高鹽方法提取蒙古黃芪基因組DＮA比較分析

摘要：為了提取高質量的蒙古黃芪（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）基因組ＤＮＡ，采用高鹽十二烷基硫酸鈉（ＳＤＳ）法、高鹽溴化十六烷基三甲基溴化銨（ＣＴＡＢ）法和高鹽低ｐＨ值法，結果表明高鹽ＣＴＡＢ法獲得的黃芪基因組ＤＮＡ純度高，能用于ＰＣＲ擴增和限制性內切酶酶切，是提取黃芪基因組總ＤＮＡ的最佳方法。

關鍵詞：高鹽；蒙古黃芪；ＤＮＡ提取

中圖分類號：Ｒ２８２；Ｑ５０３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）03－0595-04

Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ mｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ

ＨＡＮ Ｙａ－ｎａｎ，ＺＨＡＯ Ｘｉｕ－ｊｕａｎ，ＬＩ Ｙａｎ－ｊｕｎ，ＣＡＩ Ｌｕ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｏｔｏｕ ０１４０１０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ＳＤＳ， ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ＣＴＡＢ， ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ｌｏｗ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｑｕａｌｉｔｙ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ｗａｓ ｐｒｅｆｅｒａｂｌｅ ｅｎｏｕｇｈ ｔｏ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ＰＣＲ ｔｅｍｐｌａｔｅ ａｎｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ； ｔｈｕｓ ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ＣＴＡＢ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ； Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ； ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

蒙古黃芪（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）屬雙子葉植物綱豆科植物，分布于黑龍江、吉林、內蒙古、河北、山西等地，可以補氣固表、托毒生肌、利水退腫。治氣短心悸、乏力、虛脫、自汗、盜汗、體虛浮腫、慢性腎炎、久瀉等疾病［１］。近年來由于環(huán)境的惡化、土地鹽堿化愈加嚴重，蒙古黃芪資源逐漸匱乏。因此，高鹽環(huán)境下蒙古黃芪的生理生化特性及分子生物學研究就變得尤為重要，而進行這些研究的必要前提就是提取高質量的蒙古黃芪基因組ＤＮＡ。提取植物基因組ＤＮＡ的方法有很多，其中高鹽提取基因組ＤＮＡ方法的優(yōu)點是可以將ＤＮＡ與蛋白質、多糖充分分離，對提取含有大量次生代謝產物物種的ＤＮＡ是較為理想的方法［2］。據(jù)此，本實驗選用了３種高鹽方法，即高鹽ＳＤＳ法［３］、高鹽ＣＴＡＢ法［４］和高鹽低ｐＨ值法［５］，比較３種方法的提取效果，以找到黃芪基因組ＤＮＡ的最佳提取方法，為進一步分子生物學研究奠定基礎。

１材料與方法

１．１材料

本實驗采用種植了兩周的蒙古黃芪葉片作為研究對象，蒙古黃芪種子購于內蒙古赤峰市喀喇沁旗牛家營子鎮(zhèn)中藥材基地。

１．２儀器

水浴恒溫搖床（ＺＨＷＹ－１１０Ｘ３０），臺式多功能高速離心機（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４Ｒ），紫外分光光度計（ＮＤ－１０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ），凝膠成像儀（ＧｅｎＧｅｎｉｕｓ），基因擴增儀（Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ１）。

１．３無菌苗的種植

１．３．１種子預處理挑選飽滿的黃芪種子，用研缽研成粉末，研磨過程中加入少許沙粒，用７５％的乙醇浸泡３０ ｓ，０．１％升汞浸泡５ ｍｉｎ，無菌水沖洗３次，最后用無菌水３７℃浸泡３ ｈ［６］。

１．３．２培養(yǎng)基母液配制大量元素１ ０００ ｍＬ，含硝酸鉀１９．０ ｇ、 氯化銨２２．２ ｇ、 ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ３．７ ｇ、磷酸二氫鉀１．７ ｇ、 無水ＣａＣｌ２ ３．３ ｇ。有機成分２００ ｍＬ，含肌醇２．０ ｇ、 鹽酸硫胺（ＶＢ１）０．００２ ｇ、 鹽酸吡哆

鋅（ＶＢ６）０．０１ ｇ、 煙酸０．０１ ｇ、 甘氨酸０．０４ ｇ。螯合鐵２００ ｍＬ， 含ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １．１１ ｇ、 乙二胺四乙酸

二鈉１．５ ｇ。微量元素２００ ｍＬ，含ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ

３．４ ｇ、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １．７ ｇ、Ｈ３ＢＯ４ １．２ ｇ、ＫＩ ０．１７ ｇ、

Ｎａ２ＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ ０．０５ ｇ、ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ ０．００５ ｇ、ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ ０．００５ ｇ。

１．３．３分裝培養(yǎng)基?。保埃?ｍＬ三角瓶，加入２０ ｍＬ ＭＳ培養(yǎng)基（大量元素１００ ｍＬ／Ｌ，微量元素１０ ｍＬ／Ｌ，有機成分１０ ｍＬ／Ｌ，螯合鐵１０ ｍＬ／Ｌ，蔗糖３０ ｇ／Ｌ，瓊脂７．０ ｇ，調ｐＨ值為５．７，１２１℃，２０ ｍｉｎ高壓滅菌）。每個三角瓶接種５～６顆種子，人工氣候箱光照和暗培育各１２ ｈ交替進行，溫度設置為（２０±１）℃，濕度為７０％，待發(fā)芽后，取長出的葉片作為提?。模危恋牟牧?。

１．４黃芪基因組ＤＮＡ的提取方法

１．４．１高鹽ＳＤＳ法［３］取黃芪幼苗的新鮮葉片０．２～０．４ ｇ于研缽中，快速加入液氮并將其研成粉末，將粉末轉入離心管中，立即加入８０ μＬ溶液Ⅰ

（５００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔris－HＣｌ，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）和１６ μＬ β－巰基乙醇，置于室溫數(shù)分鐘至解凍；加入２７０ μＬ １０％ ＳＤＳ，輕輕混勻；６５℃水浴２５ ｍｉｎ；將離心管取出后立即置于冰上，并加入１２０ μＬ ５ ｍｏｌ／Ｌ ＫＡｃ反應３５ ｍｉｎ。１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４℃離心２０ ｍｉｎ；取上清液，加入０．９倍體積的異丙醇，輕輕混勻后，－２０℃過夜放置。４℃，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ，離心２０ ｍｉｎ；棄上清液，用５００ μＬ 1×ＴＥ緩沖液溶解沉淀；向其中加等體積的氯仿－異戊醇（２４∶１，Ｖ／Ｖ，下同）溶液混勻后，４℃，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ；取上清液，向其中加入０．８倍體積的異丙醇和０．１倍體積的

３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液，于－２０℃放置１ ｈ后，４℃，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ；棄上清液，用１ ｍＬ ７０％乙醇漂洗，４℃，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ，離心１０ ｍｉｎ，棄上清，干燥

３ ｈ；加５０ μＬ 1×ＴＥ緩沖液溶解沉淀；加４ μＬ １０ ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ混勻，并在３７℃環(huán)境下溫浴３０ ｍｉｎ，置于－２０℃下備用。

１．４．２高鹽ＣＴＡＢ法［４］①提取緩沖液配方。ＤＮＡ提取緩沖液Ⅰ為０．３５ ｍｏｌ／Ｌ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ（山梨醇）、

１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－HＣｌ（ｐＨ值為７．５）、０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，核裂解緩沖液Ⅱ為１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－HＣｌ（ｐＨ值為７．５）、０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２％ ＣＴＡＢ，５％十二烷基肌氨酸鈉Ⅲ，以上３種溶液配制后進行高壓滅菌（１２１℃，１５ ｍｉｎ）。使用前，在核裂解緩沖液Ⅱ中加入ＤＮＡ提取緩沖液總體積１％的ＰＶＰ，ＰＶＰ完全溶解后，將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液按１．０∶１．０∶０．４的體積比混合，用前把提取混合液預熱到６０～６５℃。②提取步驟。取蒙古黃芪幼苗的新鮮葉片０．２～０．４ ｇ于研缽中，快速加入液氮并將其研成粉末，將粉末轉入離心管中；加入等體積預熱的ＤＮＡ提取混合液 （４００～６００ μＬ），立即混勻，置于６５℃恒溫水浴搖床上，４０～５０ ｒ／ｍｉｎ搖勻 ９０ ｍｉｎ；冷卻到室溫，加入等體積的氯仿－異戊醇（２４∶ｌ），輕輕上下顛倒１０～１５ ｍｉｎ，常溫條件下５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ；立即轉移上清液到新的２ ｍＬ離心管中，加入總體積２／３的預冷異丙醇，上下顛倒５ ｍｉｎ，在－１０～４℃下靜置３０ ｍｉｎ后，常溫條件下５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；輕輕倒掉上清，使異丙醇揮發(fā)干凈，加入６００ μＬ ７５％乙醇，在４℃漂洗過夜；然后在常溫條件，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄乙醇，將ＤＮＡ風干（不可太干燥），加入５００ μＬ １×ＴＥ緩沖液，置６５℃水?。保?ｍｉｎ，常溫條件下使ＤＮＡ完全溶解；加入1 μＬ １０ ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ酶，３７℃溫育３０ ｍｉｎ；冷卻到室溫，加入等體積的氯仿－異戊醇（２４∶1），輕輕上下顛倒１０～１５ ｍｉｎ，常溫條件下５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ；立即轉移上清至新的２ ｍＬ離心管中，加上清的２／３體積的預冷異丙醇，再加入上清的０．１倍體積的３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ，混勻，－１０～４℃靜置 ３０ ｍｉｎ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ，離心１０ ｍｉｎ；輕輕倒掉上清，使異丙醇揮發(fā)干凈，加入６００ μＬ ７５％乙醇，４℃漂洗過夜，棄乙醇，干燥３ ｈ，加５０ μＬ 1×ＴＥ緩沖液溶解ＤＮＡ；置于－２０℃?zhèn)溆谩?/p>

１．４．３高鹽低ｐＨ值法［５］取黃芪幼苗的新鮮葉片０．２～０．４ ｇ于研缽中，快速加入液氮并將其研成

粉末，將粉末轉入離心管中，加入３ ｍＬ提取液

（１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ、ｐＨ值為４．８，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ 乙二胺四乙酸二鈉、ｐＨ值為８．０，５００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，２％ ＰＶＰ，１．４％ ＳＤＳ），調節(jié)ｐＨ值至５．５，迅速混勻，６５℃水浴２０ ｍｉｎ；４℃，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄沉淀。上清液有懸浮物可再次離心除去；加入１／３體積的

５ ｍｏｌ／Ｌ ＫＡｃ，使ｐＨ值為４．８，混勻，室溫靜置１０ ｍｉｎ；４℃，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，取上清，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（２５∶２４∶１，Ｖ／Ｖ／Ｖ）和氯仿：異戊醇（２４∶１）各抽提一次；取上清液中加入０．７倍體積的

－２０℃預冷的異丙醇，室溫放置１．５ ｈ；４℃，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ；用１ ｍＬ ７０％乙醇洗滌兩次，干燥３ ｈ；加入３０ μＬ 1×ＴＥ緩沖液溶解ＤＮＡ，置于－２０℃保存?zhèn)溆谩?/p>

２結果與分析

２．１紫外分光光度計檢測

利用紫外分光光度計檢測３種方法提取的蒙古黃芪葉片ＤＮＡ的純度和濃度，檢測結果見表１。提取基因組ＤＮＡ后，利用紫外分光度計檢測，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值為１．８～２．０，說明提取純度良好；如果小于１．８，說明基因組ＤＮＡ中有蛋白質殘留；而大于２．０則說明基因組ＤＮＡ中有ＲＮＡ殘留［７］。通過檢測分析發(fā)現(xiàn)，利用高鹽ＳＤＳ法提取蒙古黃芪基因組ＤＮＡ，濃度較大，但樣品ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值大于２．０，可推斷其中可能有ＲＮＡ殘留；利用高鹽低ｐＨ值法提取蒙古黃芪基因組ＤＮＡ，提取濃度較低，可推斷提取過程中ＤＮＡ損失較大；而高鹽ＣＴＡＢ法，純度和濃度較適宜，可進行后續(xù)實驗。

２．２瓊脂糖凝膠電泳檢測

利用１％瓊脂糖凝膠電泳檢測ＤＮＡ，結果見圖１。通過１％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示利用高鹽ＳＤＳ法提取的基因組ＤＮＡ泳動速度比高鹽低ｐＨ值法和高鹽ＣＴＡＢ法所提取的基因組ＤＮＡ的泳動速度略慢，推測其中可能含有其他雜質。鄒喻蘋等［８］提出一般ＳＤＳ法只能通過提高鹽度和降低溫度的方法去除和沉淀蛋白質和多糖，因此該方法會導致提取ＤＮＡ含有大量的多糖，而蒙古黃芪中含有大量的黃芪多糖（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｈａｒｉｎ，ＡＰＳ），因此，利用這種方法提取的蒙古黃芪基因組ＤＮＡ純度較低，可能含多糖雜質；高鹽低ｐＨ值法提取的基因組ＤＮＡ有拖尾現(xiàn)象，說明ＤＮＡ可能有降解，不能得到完整的基因組ＤＮＡ；利用高鹽ＣＴＡＢ法所提取的基因組ＤＮＡ較其他兩種方法，條帶清晰，適宜進行后續(xù)實驗。

２．３酶切檢測

利用ＰｖｕⅡ單酶切和ＥｃｏＲⅠ和Ｂａｍ ＨⅠ雙酶切檢測所提取的黃芪基因組ＤＮＡ。單酶切體系：ＤＮＡ模板１０ μＬ，ＰｖｕⅡ酶１ μＬ，１０×Ｍ Bｕｆｆｅｒ ２ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ７ μＬ，總體系為２０ μＬ。雙酶切體系：ＤＮＡ模板１０ μＬ，１０×Ｋ Bｕｆｆｅｒ ３ μＬ，ＥｃｏＲⅠ和Ｂａｍ ＨⅠ各１．２ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １４．６ μＬ，總體系為３０ μＬ。比較電泳圖譜，酶切產物檢測結果見圖２。

通過１．２％瓊脂糖凝膠電泳檢測，３種方法所提蒙古黃芪基因組ＤＮＡ單雙酶切后泳動條帶均呈彌散狀態(tài)，說明提取效果較好，可進行后續(xù)實驗。

２．４ＰＣＲ擴增檢測

ＰＣＲ擴增檢測ＤＮＡ提取質量，結果見表２。

反應體系為：引物０１、０２各１ μＬ（１０ ｍｇ／ｍＬ），ｄＮＴＰs（２．５ ｍｍｏｌ／１．２８ ｍＬ）２．５ μＬ，１０×ＰＣＲ Bｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，ｒＴａｑ酶０．３ μＬ，分別取３種方法所提基因組ＤＮＡ作為模板，模板加入量隨濃度而定，最后用滅菌ｄｄＨ２Ｏ補足到總體積為２０ μＬ。

反應程序為：預變性９４℃，２ ｍｉｎ；變性９４℃、

３０ ｓ，退火４０℃、３０ ｓ，延伸７２℃、９０ ｓ，３８個循環(huán)；７２℃延伸７ ｍｉｎ后，于４℃保存。ＰＣＲ產物經１．２％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖３。

圖３的２、３泳道分別為以高鹽ＣＴＡＢ法和高鹽低ｐＨ值法提取的基因組DNA為模板，利用膽堿單加氧酶引物進行ＰＣＲ擴增的產物，其條帶完整清晰，可進行后續(xù)分子實驗。而以高鹽ＳＤＳ法提取的基因組DNA為模板，用同樣引物進行ＰＣＲ時，未擴增出條帶，可能是利用此方法所提基因組ＤＮＡ中含有雜質，影響擴增結果。

綜上所述，經紫外分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳、酶切、ＰＣＲ擴增檢測結果顯示，高鹽ＣＴＡＢ法是提取蒙古黃芪基因組ＤＮＡ的最佳方法。

３討論

獲得高質量的基因組ＤＮＡ是后續(xù)分子實驗的關鍵步驟。本實驗根據(jù)蒙古黃芪富含黃芪多糖、氨基酸等成分的特點，采用高鹽方法提取其基因組ＤＮＡ，比較３種高鹽方法的提取效果分析如下。第一，高鹽ＳＤＳ法。利用此法所提取的蒙古黃芪基因組ＤＮＡ瓊脂糖凝膠電泳時，泳動速度比其他兩種方法較慢，推斷可能有其他雜質殘留，高鹽ＳＤＳ法去除多糖類物質效果較差，因此不適宜富含多糖的植物——蒙古黃芪的基因組ＤＮＡ的提取。第二，高鹽低ｐＨ值法。Ｃａｏ［９］等人認為這種方法其中的提取介質能有效防止組織破碎及沉淀大量材料時的電離化作用以及酚化物的進一步氧化，提取的ＤＮＡ純度較好。但是本實驗證明，高鹽低ｐＨ值法提取的蒙古黃芪基因組ＤＮＡ降解現(xiàn)象嚴重，不利于后續(xù)分子實驗的進行，此外，這種方法提取的ＤＮＡ經紫外分光光度計檢測的濃度較低，不能得到完整的基因組ＤＮＡ。第三，高鹽ＣＴＡＢ法。王景雪等［１０］證明高鹽ＣＴＡＢ法適于植物新鮮葉片的基因組ＤＮＡ的提取，而提取過程中ＤＮＡ形成后可溶于高鹽溶液并與蛋白質和多糖形成復合物，當降低鹽濃度時，ＤＮＡ可沉淀析出，從而與蛋白質和多糖分離較徹底；此外，本實驗的高鹽ＣＴＡＢ法比一般的ＣＴＡＢ法在提取液中多加了ＰＶＰ，ＰＶＰ可與酚類物質結合形成水不溶性的復合物，可以有效的去除酚類物質，提高ＤＮＡ提取純度。綜上所述，相比高鹽ＳＤＳ法和高鹽低ｐＨ值法，高鹽ＣＴＡＢ法提取的蒙古黃芪基因組ＤＮＡ質量最高，適合后續(xù)分子實驗的進行。

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