纖維素酶產(chǎn)生菌的鑒定及其混合發(fā)酵條件優(yōu)化

摘要：分離篩選到的４株纖維素酶活較高的菌株Ｄ６、Ｄ７、Ｂ７和Ｄ１，根據(jù)形態(tài)特征初步判斷為３株細菌、

1株放線菌，其１６Ｓ ｒＤＮＡ序列同源性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ｄ６、Ｄ７、Ｂ７與Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．的同源性為９９％，系統(tǒng)發(fā)育樹分析與Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．遺傳關(guān)系最近，Ｄ１與Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚａｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ的同源性為９９％，系統(tǒng)發(fā)育樹分析與Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚａｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ遺傳關(guān)系最近；對４株菌株進行單獨與混合發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果表明菌株組合Ｄ６／Ｄ７混合培養(yǎng)后的酶活顯著高于其單菌培養(yǎng)，其在培養(yǎng)溫度３７℃、培養(yǎng)基初始ｐＨ值為８．０、接種量為２％（Ｖ／Ｖ）、Ｄ６／Ｄ７接種比例為２∶１（Ｖ∶Ｖ）下的酶活最高，可達到７９．４２ Ｕ／ｍＬ。

關(guān)鍵詞：纖維素；篩選；混合培養(yǎng)；發(fā)酵條件

中圖分類號：Ｑ９３－３３１；ＴＱ９２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）03－0573-03

Study on Identification of Cellulose-Decomposing Microorganisms and Optimum Conditions for Their Mixed Cultivation

ＬＵ Ｙｕｅ－ｘｉａ１，ＬＩＵ Ｋａｉ－ｎａｎ２，ＬＩ Ｃｕｉ－ｐｉｎｇ３

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｈｅｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｈａｎｄａｎ ０５６０２１，Hebei，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｙｏｎｇｎｉａｎ Ｃｏｕｎｔｙ， Ｙｏｎｇｎｉａｎ ０５７１５０， Ｈｅｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｙｏｎｇｎｉａｎ Ｃｏｕｎｔｙ， Ｙｏｎｇｎｉａｎ ０５７１５０， Ｈｅｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｎａｍｅｄ ａｓ Ｄ６， Ｄ７， Ｂ７ ａｎｄ Ｄ１ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ； ａｎｄ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ３ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｏｎｅ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｍｏｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ Ｄ６， Ｄ７， Ｂ７ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓp. ｗｅｒｅ ９９％； ａｎｄ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｄ１ ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚａｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ｗａｓ ａｌｓｏ ９９％． Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｂｕｉｌｔ ｏｎ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｏｒｍｅｒ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｄ ｔｈｅ ｎｅａｒｅｓｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ Ｂacillus sp． ， ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｌａｔｔｅｒ ｏｎｅ ｗａｓ ｎｅａｒｅｓｔ ｔｏ Ｓ． ｚａｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ． Ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｉｘｅｄ ｓｔｒａｉｎ Ｄ６／Ｄ７ ｗａｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｉｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｎｚｙｍｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｔ ３７℃， ｗｉｔｈ ｍｅｄｉｕｍ ｐｒｉｍａｒｙ ｐＨ ８．０， ２％ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ（Ｖ／Ｖ）， ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ Ｄ６∶Ｄ７ ａｔ ２∶１． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｈｅｄ ７９．４２ Ｕ／ｍＬ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｍｉｘｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

纖維素是植物細胞壁的主要成分，是自然界儲存量最多的多糖類物質(zhì)，也是一筆取之不盡、用之不竭的可再生資源。因此，纖維素類物質(zhì)的分解利用對于解決未來的能源危機和環(huán)境污染意義重大［１］。自然狀態(tài)下，纖維素降解主要通過３種方式，即物理方式、化學方式和微生物降解［２］，物理方法作用效果不明顯，化學方法成本高且易產(chǎn)生二次污染。實踐表明，纖維素的微生物降解是最佳途徑，此法具有降解率高、安全環(huán)保、成本低等優(yōu)點［３］。但是，由于天然纖維素分解菌活性低，降解速度慢，而纖維素降解需要多種酶協(xié)同作用，充分利用自然界多種微生物的協(xié)同關(guān)系，人工篩選構(gòu)建能夠產(chǎn)生多種纖維素酶的高效穩(wěn)定混合菌系，引起了人們的高度重視。

目前在構(gòu)建混合菌系，利用菌株協(xié)同作用降解纖維素的研究報道較少。本實驗對分離篩選到的４株纖維素酶活較高的菌株進行不同菌株組合發(fā)酵，目的在于構(gòu)建一組高效纖維素降解菌系，初步確定其最適產(chǎn)酶條件以應用于纖維素廢棄物處理，對減少環(huán)境污染、變廢為寶，實現(xiàn)經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展具有一定的理論指導意義。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１菌株來源本實驗室分離篩選獲得，分別為Ｄ６、Ｄ７、Ｂ７和Ｄ１。

１．１．２液體發(fā)酵培養(yǎng)基參照文獻［４］配方制作。

１．２方法

１．２．１菌株形態(tài)觀察及系統(tǒng)發(fā)育分析①菌株的形態(tài)觀察結(jié)果。對菌株進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察各菌株形態(tài)，根據(jù)形態(tài)特征對菌株進行初步分類。②菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ擴增及序列分析。細菌的ＤＮＡ提取及ＰＣＲ擴增和序列分析參考文獻［６］進行。

１．２．２菌株單獨與混合發(fā)酵對酶活的影響將菌株分別進行單個菌、兩個菌、３個菌和４個菌混合發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時按２％的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，３７℃，１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床振蕩培養(yǎng)，每隔２４ ｈ測酶活。

１．２．３菌株單獨與混合發(fā)酵對甘蔗渣的降解率測定①甘蔗渣的預處理。采用質(zhì)量分數(shù)為０．５％的ＮａＯＨ溶液處理甘蔗渣，固液比１∶３０（ｍ∶Ｖ，ｇ∶ｍＬ），１２１℃反應３０ ｍｉｎ，然后過濾，水洗，調(diào)ｐＨ值，獲得處理樣品。②降解率的測定。將菌株按單個菌、兩個菌、３個菌和４個菌混合發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時按２％的接種量接種于以甘蔗渣為惟一碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，３７℃，１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床振蕩培養(yǎng)７ ｄ，把所得發(fā)酵液過濾并水洗以除去菌體，干燥后稱重并計算降解率。降解率＝（降解前質(zhì)量－降解后殘渣質(zhì)量）／降解前質(zhì)量×１００％。

１．２．４優(yōu)化組合發(fā)酵條件研究在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別就培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始ｐＨ值、接種量、混合菌群中單個菌株接種比例等不同條件對優(yōu)化組合的酶活影響進行比較，確定組合菌株的最佳產(chǎn)酶條件。

２結(jié)果與分析

２．１菌株形態(tài)觀察及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

２．１．１菌株的形態(tài)觀察篩選的４株菌進行染色觀察，從形態(tài)上看出，菌株Ｄ１形態(tài)類似放線菌，有菌絲和孢子絲的出現(xiàn)；Ｄ６、Ｄ７、Ｂ７的形態(tài)很相似，其細胞為桿狀，產(chǎn)芽孢，芽孢的形狀很接近，只是在相同的培養(yǎng)時間，Ｄ６菌株產(chǎn)芽孢的量較少，分析可能是由于不同的菌株所處的生長時期不一致，由形態(tài)可初步判斷３株菌都為細菌，革蘭氏染色結(jié)果為陽性。

２．１．２菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ擴增和序列分析對４菌株提?。模危?，然后采用正向引物Ｐ０和反向引物Ｐ６對菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ進行ＰＣＲ擴增，電泳檢測其片段大?。▓D１），對ＰＣＲ產(chǎn)物進行序列測定和分析，獲得菌株的種屬信息，并構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖２）。從圖２可以看出，Ｄ６、Ｄ７、Ｂ７屬于芽孢菌屬（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．），Ｄ１為鏈霉菌屬（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）。

２．２菌株混合培養(yǎng)對降解率的影響

將各菌株進行單菌與混合發(fā)酵培養(yǎng)，在前期研究［４］基礎(chǔ)上明確菌株組合Ｄ６／Ｄ７在７２ ｈ的酶活顯著高于其他組合，而且對甘蔗渣有著比較高的降解率（圖３），對甘蔗渣的降解率達２３．８％，相對于其他組合降解率最高。為此，選擇該組合進行產(chǎn)酶條件研究。

２．３優(yōu)化組合發(fā)酵條件研究

２．３．１溫度對酶活的影響將菌株組合Ｄ６／Ｄ７以２％接種量、接種比例１∶１接種于ｐＨ值為７．０的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在２８、３７、４６、５５℃的不同溫度下，１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床振蕩培養(yǎng)７２ ｈ，取樣測酶活，測定結(jié)果如圖４所示，從圖４中可以看出，菌株在３７℃酶活最高，即菌株產(chǎn)酶的最適溫度為３７℃。

２．３．２培養(yǎng)基初始ｐＨ值對酶活的影響將菌株組合Ｄ６／Ｄ７以２％接種量、接種比例１∶１分別接種于ｐＨ值為５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，３７℃，１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間同上，取樣測酶活，測定結(jié)果如圖５，從圖５可以看出在起始ｐＨ值為５．５～８．０時，隨著ｐＨ值的增高酶活逐漸增加，ｐＨ值為８．０時達到高峰，隨后酶活呈快速下降趨勢，表明該組合菌株最適ｐＨ值為８．０。

２．３．３接種量對酶活的影響菌株組合Ｄ６／Ｄ７以接種比例１∶１接種，并分別以１％、２％、３％、４％、５％的接種量接種于ｐＨ值為８．０的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，３７℃，１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間同上，取樣測酶活，酶活測定結(jié)果如圖６。從圖６中可以發(fā)現(xiàn)，接種量不同，酶活差別很大，且以２％的接種量接種時酶活較高，從酶活的變化趨勢還可以看出，隨著接種量的增加酶活逐漸增加，但接種量超過２％后酶活卻明顯降低，原因可能是由于接種量太大會造成菌株徒長而產(chǎn)酶量卻顯著減少。

２．３．４接種比例對酶活的影響Ｄ６／Ｄ７分別以接種比例１∶１、１∶２、２∶１，接種量２％接種于ｐＨ值為８．０的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，３７℃，１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床振蕩培養(yǎng)，每隔２４ ｈ取樣測酶活，結(jié)果如圖７。從圖７可以看出，菌株Ｄ６和Ｄ７在接種比例為２∶１時的酶活明顯高于其他兩種情況，且在７２ ｈ的酶活達到最高，為７９．４２ Ｕ／ｍＬ。Ｄ６和Ｄ７在任一菌種稍多的情況下表現(xiàn)出較強的降解能力，出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是由于兩菌均能產(chǎn)生同一種組分酶，同時又能各自產(chǎn)生另一種組分酶，而在相同接種量的情況下，僅僅加強了一種組分酶的量，而不能得到纖維素降解能力增強的纖維素酶體系。因此，纖維素酶各酶系組成比例協(xié)調(diào)是實現(xiàn)其高效降解的關(guān)鍵因素。

３討論

本研究構(gòu)建了一組纖維素降解菌群Ｄ６／Ｄ７，該菌群在７２ ｈ酶活可以達到７９．４２ Ｕ／ｍＬ，并非所有隨機組合的混合菌群產(chǎn)生的纖維素酶的活力均顯著增加，有些混合培養(yǎng)的菌株產(chǎn)生的纖維素酶活甚至低于單菌株的酶活力。Ｄ６和Ｄ７同屬于芽孢菌屬不同的種群，它們組合后酶活能顯著提高，初步確定不同種類的微生物能相互作用，促進纖維素酶的分泌。菌株組合Ｄ６／Ｄ７在所有組合中酶活最高且對甘蔗渣有比較高的降解率，如果將其應用于纖維素類廢棄物處理，對纖維素資源的再利用和治理環(huán)境污染將具有一定的理論和實踐意義。

本文只對菌群Ｄ６／Ｄ７的產(chǎn)酶條件進行了單因素分析，未考慮多種因素之間的相互作用，因此，發(fā)酵條件優(yōu)化實驗有待于進一步完善。

纖維素酶是一種多組分酶，單一菌株酶系簡單，因此纖維素高效降解必須通過多種微生物的相互作用。在構(gòu)建混合菌群時，要充分利用微生物之間的協(xié)同作用，使其發(fā)揮最佳降解效能。

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