四種化學還原法制備膠體金的比較研究

摘要：以檸檬酸三鈉、鞣酸、抗壞血酸、硼氫化鈉為還原劑，采用４種不同化學還原法制備出單分散性好的膠體金樣品；比較研究了４種方法制備的膠體金的光學性質(zhì)、貯存穩(wěn)定性及其對蛋白質(zhì)的標記能力。結果表明，不同方法制備得到的膠體金樣品其外觀色澤均呈現(xiàn)紅色略帶紫色或葡萄酒紅色，可見光譜圖最大吸收峰波長為５１０～５２５ ｎｍ，膠體金粒徑在５～２０ ｎｍ之間。不同貯存條件對膠體金穩(wěn)定性有影響，其中以４℃條件下貯存的膠體金最穩(wěn)定；不同方法制備得到的膠體金對蛋白質(zhì)的最佳標記量有影響。

關鍵詞：膠體金；化學還原法；光學性質(zhì)；貯存穩(wěn)定性；蛋白質(zhì)標記能力

中圖分類號：Ｏ６５；Ｏ６４８．１６；ＴＧ１４６．３＋１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）03－0476-03

Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｆｏｕｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ

ＹＡＮＧ Ｙｕ－ｘｉｎ１，ＹＥ Ｙａｎｇ１，ＺＨＯＵ Ｙｏｕ－xｉａｎｇ２，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｈｏｎｇ１

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ， ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｆｏｕｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ with ｃｉｔｒａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ， ｔａｎｎｉｃ ａｃｉｄ， ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｓｏｄｉｕｍ ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ ａｓ ｒｅｄｕｃｔａｎｔｓ． The oｐｔｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｓｔｏｒａｇｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ the ｆｏｕｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｌｏｒ ｏｆ all the ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ｗａｓ ｒｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｌｉｔｔｌｅ ｐｕｒｐｌｅ ｏｒ ｒｅｄ ｗｉｎｅ ｃｏｌｏｒ． Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ５１０～５２５ ｎｍ． Ｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ｗａｓ ５～２０ ｎｍ． Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ｗａｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｏｒａｇｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ｒｅｍａｉｎｅｄ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｔ ４℃． Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ ｗａｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ； ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ； ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ； ｓｔａｂｉｌｉｔｙ； protein labeling ability

膠體金（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ）也稱金溶膠（Ｇｏｌｄｓｏｌ），是由氯金酸被還原成原金后形成的金顆粒懸液，顏色呈橘紅色到紫紅色。１９７１年首次用免疫金標記技術研究沙門菌壁細胞抗原成分，將膠體金與抗體結合，應用于電鏡水平的免疫細胞化學研究［１］。１９７４年，Ｒｏｍａｎｏ等用膠體金標記抗球蛋白抗體，建立間接免疫金染色法。此后，膠體金作為一種新型免疫標記技術得到很快發(fā)展［２］。免疫膠體金技術作為一種新的免疫學方法，具有簡單、快速、準確和無污染等優(yōu)點，在醫(yī)學、動植物檢疫、食品安全監(jiān)督等領域得到了日益廣泛的應用［３］。

膠體金的制備一般采用化學還原法，主要有白磷還原法、抗壞血酸還原法、檸檬酸三鈉還原法、鞣酸－檸檬酸三鈉還原法、乙醇超聲波還原法和硼氫化鈉還原法［４］。常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。由于白磷易燃易爆，一般實驗室不宜采用［５］。采用化學還原法制備膠體金時，通過改變反應體系中氯金酸與還原劑的比例（增加或減少還原劑的量）可得到所需不同直徑的金顆粒［６］。

本研究在對檸檬酸三鈉還原法、鞣酸-檸檬酸三鈉還原法、抗壞血酸還原法和硼氫化鈉還原法制備膠體金的影響因素進行分析的基礎上，結合文獻報道資料，采用４種方法制備了單分散性好的膠體金樣品，利用可見光譜對金膠顆粒進行綜合評價［７］，并系統(tǒng)比較了４種方法制備的膠體金的光學性質(zhì)、貯存穩(wěn)定性及其對蛋白質(zhì)的標記能力，以期為不同方法制備的膠體金在免疫標記技術中的應用奠定基礎。

１材料與方法

１．１儀器和試劑

電子天平，ＭＦＤ．ＢＹ．Ａ＆Ｄ Ｃｏ．，Ｌｔｄ生產(chǎn)；ＬＲＨ－１５０Ｂ型生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；ＭＭ７２１ＡＡＵ－ＰＷ型微波爐，佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司生產(chǎn)；ＵＶ－１７００型紫外可見光譜儀，日本Ｓｈｉｍａｄｚｕ公司生產(chǎn)；ＳＺ－９３型自動雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)。

氯金酸，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)；檸檬酸三鈉，上?？撇毣瘜W品公司生產(chǎn)；鞣酸，天津市光復精細化工研究所生產(chǎn)；Ｌ－抗壞血酸，中國醫(yī)藥（集團）上海化學試劑公司生產(chǎn)；硼氫化鈉，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)；牛血清白蛋白，武漢市華順生物技術有限公司生產(chǎn)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

１．２方法

１．２．１膠體金的制備①檸檬酸三鈉法［８］。取５０ ｍＬ

０．０１％氯金酸與２ ｍＬ １％檸檬酸三鈉充分混勻后，置于微波爐中小火加熱１５ ｍｉｎ，待其冷卻后用雙蒸水補至原體積，于４℃貯存，備用。②鞣酸-檸檬酸三鈉法［９］。取５０ ｍＬ ０．０１％氯金酸、２ ｍＬ １％檸檬酸三鈉、１２．５ μＬ的０．１ ｍｏｌ／Ｌ Ｋ２ＣＯ３和０．５ ｍＬ ０．１％鞣酸充分混勻后，置于微波爐中小火加熱１５ ｍｉｎ，待其冷卻后用雙蒸水補至原體積，于４℃貯存，備用。③抗壞血酸法［１０］。?。担?ｍＬ ０．０１％氯金酸、０．７５ ｍＬ的０．２ ｍｏｌ／Ｌ Ｋ２ＣＯ３和０．５ ｍＬ ０．７％抗壞血酸充分混勻后，置于微波爐中小火加熱１０ ｍｉｎ，待其冷卻后用雙蒸水補至原體積，于４℃貯存，備用。④硼氫化鈉法［１１］。?。担?ｍＬ ０．０１％氯金酸和０．２５ ｍＬ的０．２ ｍｏｌ／Ｌ Ｋ２ＣＯ３充分混勻后，分３～５次向上述溶液中滴加現(xiàn)配的０．５ ｍｇ／ｍＬ硼氫化鈉，每次０．５ ｍＬ，邊滴加邊振蕩混勻，直至反應液變紫，最終變?yōu)槌燃t色，繼續(xù)振蕩約３ ｍｉｎ。于４℃貯存，備用。

１．２．２膠體金的可見光譜評價利用紫外可見分光光度計對膠體金顆粒在可見光范圍內(nèi)（４００～７００ ｎｍ）進行掃描，測定其最大吸收波長、吸光值，對制備出的膠體金進行評價。

１．２．３膠體金貯存穩(wěn)定性將采用不同方法制備的膠體金溶液分別在４、２２、３７℃和自然光照下貯存２個月，其間分別于第１、１４、２２、３０、５６天取膠體金溶液進行可見光譜掃描，對其穩(wěn)定性進行評價。

１．２．４膠體金的牛血清白蛋白標記試驗［１２］采用Ｍｅｙ氏穩(wěn)定化試驗，以牛血清白蛋白為標記蛋白質(zhì)，用不同方法制備的膠體金對其進行標記，觀察不同膠體金溶液對蛋白質(zhì)最佳標記量的影響，比較不同方法制備的膠體金溶液標記蛋白質(zhì)能力的差異。

２結果與分析

２．１不同方法制備的膠體金溶液外觀形態(tài)比較

以檸檬酸三鈉、鞣酸、抗壞血酸、硼氫化鈉為還原劑，采用檸檬酸三鈉還原法、鞣酸-檸檬酸三鈉還原法、抗壞血酸還原法和硼氫化鈉還原法制備的膠體金溶液外觀形態(tài)如圖１所示。由圖１可知，不同方法制備得到的膠體金樣品其外觀色澤均呈現(xiàn)葡萄酒紅色或紅色略帶紫色，說明采用這４種方法制備得到的膠體金顆粒均勻、單分散性好。

２．２不同方法制備的膠體金溶液可見光譜圖分析

不同方法制備的膠體金溶液在可見光范圍內(nèi)（４００～７００ ｎｍ）的掃描圖譜如圖２所示。由圖２可知，檸檬酸三鈉法制得的膠體金溶液可見光譜圖最大吸收峰波長為５１９ ｎｍ，粒徑分布較均勻，為１５ ｎｍ左右。鞣酸-檸檬酸三鈉法制得的膠體金，可見光譜圖最大吸收峰波長為５２３ ｎｍ，膠體金粒徑約為２０ ｎｍ。抗壞血酸法制得的膠體金可見光譜圖最大吸收峰波長為５２２ ｎｍ，粒徑在１８ ｎｍ左右，可見光譜圖最大吸收峰峰寬最窄，即粒徑分布相對最均勻，但抗壞血酸易見光分解，需現(xiàn)配現(xiàn)用，不利于此法的推廣。硼氫化鈉法制得的膠體金可見光譜圖最大吸收峰波長為５１５ ｎｍ，膠體金粒徑最小，為５ ｎｍ左右。由于硼氫化鈉還原性強，反應快，導致膠體金生長速率和膠體金核形成速率不平衡，粒徑分布非常不均勻，可見光譜圖最大吸收峰峰寬較寬。

２．３不同方法制備的膠體金溶液貯存穩(wěn)定性分析

將采用不同方法制備的膠體金溶液分別在４、２２、３７℃和自然光照下貯存２個月，分別于第１、１４、２２、３０、５６天取膠體金溶液進行可見光譜掃描，根據(jù)膠體金溶液的可見光譜圖，繪制其最大吸收峰波長隨貯存時間的變化曲線圖，對其貯存穩(wěn)定性進行分析。由圖３～圖６可知，采用同一方法制備得到的膠體金溶液在不同貯存條件下的穩(wěn)定性是有區(qū)別的，其中以４℃條件下的貯存穩(wěn)定性最好，膠體金溶液的最大吸收峰波長變化不明顯，采用不同方法制備的膠體金穩(wěn)定性有差異。

不同方法制備的膠體金溶液在不同條件下貯存１個月后的可見光譜變化情況如表１所示。由表１可知，在４℃和22℃條件下，在１個月的貯存時間內(nèi)，以檸檬酸三鈉法和抗壞血酸法制備得到的膠體金溶液的可見光譜圖基本無變化，膠體金溶液貯存穩(wěn)定性優(yōu)于鞣酸-檸檬酸三鈉法和硼氫化鈉法，自然光照條件不利于膠體金溶液的貯存。

２．４不同方法制備的膠體金溶液標記蛋白質(zhì)的試驗分析

采用Ｍｅｙ氏穩(wěn)定化試驗，以牛血清白蛋白為標記蛋白質(zhì)，用檸檬酸三鈉法、鞣酸-檸檬酸三鈉法、抗壞血酸法和硼氫化鈉法制備的膠體金對牛血清白蛋白的最佳標記量分別為０．１５、０．３０、０．１５、０．05 ｍｇ／ｋｇ。表明不同方法制備的膠體金溶液標記蛋白質(zhì)能力有差異，其中檸檬酸三鈉法和抗壞血酸法制備的膠體金溶液對牛血清白蛋白的標記量較為適中。

３結論

以檸檬酸三鈉、鞣酸、抗壞血酸、硼氫化鈉為還原劑，采用檸檬酸三鈉法、鞣酸-檸檬酸三鈉法、抗壞血酸法和硼氫化鈉法分別制備得到單分散性好的膠體金溶液。對這４種化學還原法制備得到的膠體金溶液的光學性質(zhì)、貯存穩(wěn)定性及其對蛋白質(zhì)的標記能力的比較研究。結果顯示，不同方法制備得到的膠體金樣品其外觀色澤均呈現(xiàn)紅色略帶紫色或葡萄酒紅色，紫外光譜圖最大吸收峰波長為５１０～５２５ ｎｍ，膠體金粒徑在５～２０ ｎｍ之間。不同貯存條件對膠體金穩(wěn)定性有影響，其中以４℃條件下貯存的膠體金最穩(wěn)定。不同方法制備得到的膠體金對蛋白質(zhì)的最佳標記量有影響。

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