蘇云金芽孢桿菌幾丁質酶基因的克隆及誘導表達

摘要：從蘇云金芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｔ０４Ａ００１中提取基因組ＤＮＡ，通過ＰＣＲ的方法克隆了幾丁質酶ｃｈｉＡＣ基因（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＥＦ４２７６７０）。置換ｃｈｉＡＣ基因的啟動子為Ｔ７啟動子時，ｃｈｉＡＣ基因能在ＩＰＴＧ誘導下在大腸桿菌中大量表達，并產(chǎn)生大小約７０ ｋＤａ的表達產(chǎn)物。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；幾丁質酶基因；克?。恍蛄蟹治?；表達

中圖分類號：Ｑ７８６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）03－0599-04

Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ

Ｔ０４Ａ００１ Ｓｔｒａｉｎ

ＣＡＩ Ｙａ－ｊｕｎ1，2，ＹＵＡＮ Ｚｈｉ－ｍｉｎｇ2，ＨＵ Ｘｉａｏ－ｍｉｎ2，ＣＡＩ Ｑｕａｎ－ｘｉｎ2

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｕｈａｎ Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７３，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｗｕｈａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，The Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓciences，Ｗｕｈａｎ ４３００７１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｃｈｉＡＣ（GenBank Accession Number：EF427670） ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｔ０４Ａ００１ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉＡＣ ｕｎｄｅｒ Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧ； ａｎｄ ｉｔ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｏｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ７０ ｋＤａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ； ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ； ｃｌｏｎe； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

幾丁質酶在芽孢桿菌中廣泛存在，目前已有多種芽孢桿菌的幾丁質酶基因得到了克隆與表達，如環(huán)狀芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、蠟狀芽孢桿菌（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ）、蘇云金芽孢桿菌（Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，簡稱Ｂｔ）、枯草芽孢桿菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）以及地衣芽孢桿菌（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等［１，２］。蘇云金芽孢桿菌因為對多種害蟲具有毒殺作用而一直為人們所關注，目前已有十多個亞種的蘇云金芽孢桿菌被證明能產(chǎn)生幾丁質酶［３］。有報道證明，蘇云金芽孢桿菌自身產(chǎn)生的幾丁質酶對其殺蟲毒力具有增效作用，其殺蟲毒力與幾丁質酶的活力呈高的正相關（０．７５～０．７９）［４］，表明幾丁質酶在外界因素對害蟲的侵害中起著重要的作用。增加外源的幾丁質酶可以提高蘇云金芽孢桿菌殺蟲效果，而用阿洛菌素（一種幾丁質酶抑制劑）抑制蘇云金芽孢桿菌的幾丁質酶后，ＬＣ５０值增高［５］。因此，對蘇云金芽孢桿菌幾丁質酶的性質、編碼基因的序列差異性以及幾丁質酶基因的表達等方面進行研究，可為幾丁質酶更好的應用于生物防治提供依據(jù)。

本研究對產(chǎn)幾丁質酶活力高的Bt菌株Ｔ０４Ａ００１［６］的幾丁質酶基因進行了克隆、測序分析，并將Ｔ０４Ａ００１菌株的幾丁質酶基因ｃｈｉＡＣ的開放閱讀框（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）在Ｔ７啟動子調(diào)控下進行原核表達。幾丁質酶基因的序列測定及其在大腸桿菌中的大量表達為研究芽孢桿菌幾丁質酶的進化關系、幾丁質酶的純化與制備及更進一步研究提供了條件。

１材料與方法

１．１菌株與培養(yǎng)基

Bt菌株Ｔ０４Ａ００１為本實驗室分離保藏，大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、ＢＬ２１為本實驗室保存菌株。ＬＢ培養(yǎng)基（每升含１０ ｇ蛋白胨，５ ｇ酵母粉，１０ ｇ ＮａＣｌ）；氨芐青霉素和卡那霉素使用終濃度分別為５０ μｇ／ｍＬ和３０ μｇ／ｍＬ，ＩＰＴＧ 使用終濃度為

１ ｍｍｏｌ／Ｌ。

１．２主要試劑與儀器

所用內(nèi)切酶均購自ＴａＫａＲａ公司；質粒提取、ＰＣＲ產(chǎn)物回收和ＤＮＡ片段快速純化試劑盒購自Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ公司；Ｈｉｓ－bｉｎｄ親和層析蛋白純化試劑盒購自Ｎｏｖａｇｅｎ公司；其余常規(guī)試劑均為Ｓｉｇｍａ進口分裝。主要儀器有美國Ｂｉｏｔｅｃｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ全波長自動酶標儀，美國ＡＢＩ ９８００ ＰＣＲ儀，電泳系統(tǒng)為美國ＢｉｏＲａｄ ＤＮＡ電泳系統(tǒng)和蛋白質電泳系統(tǒng)。

１．３ＤＮＡ的提取

大腸桿菌質粒ＤＮＡ提取參照《分子克隆實驗指南》第二版（１９89）小量堿法進行［７］。

芽孢桿菌的總ＤＮＡ按照如下方法提取。將芽孢桿菌單菌落接入ＬＢ培養(yǎng)基中，３０℃ ２００ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)４～５ ｈ至ＯＤ６００約０．６～０．８，?。保?ｍＬ菌液至Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，離心收集菌體，用ＴＥＳ緩沖液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ值為８．０，５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ值為８．０，２０％蔗糖）洗滌菌體１次，沉淀中加入５００ μＬ含１０ ｍｇ／ｍＬ溶菌酶的ＴＥＳ，混勻后３７℃下作用１．０～１．５ ｈ至菌體形成原生質球，加１００ μＬ １０％ ＳＤＳ溶液及終濃度為２ ｍｇ／ｍＬ的蛋白酶Ｋ，上下顛倒數(shù)次混勻，３７℃下作用１ ｈ，１２ ０００ r／min離心１０ ｍｉｎ，上清加等體積的酚氯仿抽提后，加入兩倍體積預冷無水乙醇溫和混勻，－２０℃放置３０ ｍｉｎ左右后１２ ０００ r／min離心１０ ｍｉｎ，沉淀用７０％乙醇洗滌，風干，最后溶于含２ ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ酶的適量的無菌去離子水中。

１．４幾丁質酶基因的ＰＣＲ擴增

根據(jù)ＧｅｎＢａｎｋ中Ｂｔ以色列亞種幾丁質酶基因（ＧｅｎＢａｎｋ序列號為ＡＦ５２６３７９）全序列設計了擴增引物［８］，ＩＣＨＩ１ ５′－ＧＴＣＧＡＣＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＴＡＣＣＡ－３′（帶ＳａｌⅠ酶切位點），ＣＣＨＩ１ ５′－ＧＧＧＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴＣ－３′（帶ＥｃｏＲⅠ酶切位點），ＣＣＨＩ２ ５′－ＧＧＧＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴＣ－３′（帶ＨｉｎｄⅢ酶切位點）。擴增體系為：芽孢桿菌總ＤＮＡ ０．１ μｇ，１×ＰＣＲ Bｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ， ２．５ ｐｍｏｌ ｄＮＴＰｓ，

Ｔａｑ ｐｌｕｓ（Ｔａｑ＋ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１ Ｕ，引物各

１０ ｐｍｏｌ，加ｄｄＨ２Ｏ至２５ μＬ。擴增程序為：94℃預變性4 min；９４℃變性３０ ｓ，５０℃退火３ ｍｉｎ，７２℃延伸３ ｍｉｎ，２８個循環(huán)；７２℃延伸７ ｍｉｎ。

１．５幾丁質酶基因的克隆

以Bt菌株Ｔ０４Ａ００１總ＤＮＡ為模板，ＩＣＨＩ１／ＣＣＨＩ２為引物，ＰＣＲ擴增得到包含啟動子和ｃｈｉＡＣ基因ＯＲＦ和終止子的幾丁質酶全長基因，將ＰＣＲ產(chǎn)物（為確保ＰＣＲ產(chǎn)物末端加上了Ａ殘基，擴增完成后直接向ＰＣＲ反應管中加入１Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，７２ ℃延伸３０ ｍｉｎ），用ＰＣＲ產(chǎn)物回收試劑盒純化回收后連接到ＰＣＲ產(chǎn)物克隆載體ｐＭＤ１８－Ｔ上，連接產(chǎn)物轉化進Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α，在氨芐青霉素抗性ＬＢ平板上挑取白色克隆子，提取質粒酶切鑒定，得到Ｔ０４Ａ００１幾丁質酶基因的正確克隆子Ｅ－ｐＭＤＣ２６，送往上海博道生物公司測序。

１．６用于幾丁質酶基因原核表達的重組質粒的構建

以ＣＣＨＩ１／ＣＣＨＩ２為引物ＰＣＲ擴增得到不含啟動子序列的ｃｈｉＡＣ基因ＯＲＦ，其兩端分別帶有ＥｃｏＲⅠ和Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切位點，ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)ＰＣＲ產(chǎn)物回收試劑盒純化回收后ＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ Ⅲ雙酶切。雙酶切后的ＰＣＲ片段與表達質粒ｐＥＴ２８ａ ＥｃｏＲⅠ／Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切后的片段連接，將連接產(chǎn)物轉化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α后在卡那霉素抗性ＬＢ平板上篩選克隆子，隨機挑取菌落提取質粒進行酶切鑒定，鑒定正確的質粒即為ｃｈｉＡＣ基因在質粒ｐＥＴ２８ａ Ｔ７啟動子控制下表達的重組質粒，命名為ｐＥＴＣ２１。

１．７幾丁質酶的誘導表達及蛋白質純化

將質粒ｐＥＴＣ２１轉化Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１，得到用于誘導表達的重組菌株Ｅ－ｐＥＴＣ２１。Ｅ－ｐＥＴＣ２１接到

５ ｍＬ ＬＢ液體培養(yǎng)基中，３０℃震蕩培養(yǎng)（２００ ｒ／ｍｉｎ）過夜，按１∶１ ０００比例轉接到５００ ｍＬ的新鮮ＬＢ中，當菌液培養(yǎng)至ＯＤ６００約０．６時加入終濃度為１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ誘導繼續(xù)培養(yǎng)４ ｈ，取樣處理后經(jīng)Ｈｉｓ－bｉｎｄ親和層析試劑盒純化得到表達的幾丁質酶。具體純化方法見試劑盒說明?？捡R斯亮藍Ｇ２５０染色法測定純化的蛋白質濃度。３，５－二硝基水楊酸測定幾丁質酶活力［６］。一個酶活力單位（Ｕ）定義為合適溫度下每小時產(chǎn)生１ μｇ還原糖的酶量。

１．８抗血清制備和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析

約４００ ｎｇ的純化的ＣｈｉＡＣ蛋白質經(jīng)ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離、考馬斯亮藍染液染色、脫色后，將７０ ｋＤａ目的蛋白帶切下，凍融３次，用研缽研碎，懸浮于１ ｍＬ生理鹽水中。蛋白樣品制備好后，注射兔子進行免疫反應。２周后加強一次注射免疫，１個月后再一次加強，１個半月后取兔血，離心得到７０ ｋＤａ ＣｈｉＡＣ的抗血清。制備Ｅ－ｐＥＴ２８ａ菌體破碎后的可溶性部分０．５ ｍＬ，與１０ ｍＬ抗血清在４℃孵育過夜，然后３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心３ ｍｉｎ，除去所有抗原抗體凝集反應的沉淀，得到去除宿主菌雜抗體的抗血清。本研究經(jīng)摸索后確定Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析均用１ ０００倍稀釋度的ＣｈｉＡＣ抗血清進行一抗雜交。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法按《分子克隆實驗指南》［７］進行。

２結果

２．１幾丁質酶基因和氨基酸序列分析

序列測定表明，Ｂｔ菌株Ｔ０４Ａ００１的幾丁質酶基因編碼序列（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＥＦ４２７６７０）由２ ０３１個核苷酸組成，是編碼６７６個氨基酸的７４ ｋＤａ蛋白質。與ＧｅｎＢａｎｋ中其他ＣｈｉＡ家族幾丁質酶基因進行核酸序列比對，菌株Ｔ０４Ａ００１（Ｈ４血清型）幾丁質酶基因ｃｈｉＡＣ的全序列與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ（Ｈ１４血清型）幾丁質酶基因ｉｃｈｉ相似性最高，為９９％；與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｏｎｋｕｋｉａｎ（Ｈ３４血清型）幾丁質酶基因Ｂｔ及Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｅｎｙａｅ（Ｈ４ａ４ｃ血清型）幾丁質酶基因ｃｈｉＡ７４相似９８％；與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｓｏｔｔｏ（Ｈ４ａ４ｂ血清型）幾丁質酶基因Ｂｔｓ相似９６％；與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｐａｋｉｓｔａｎｉ（Ｈ１３血清型）幾丁質酶基因ｃｈｉＡ７１相似８０％；與枯草芽孢桿菌幾丁質酶基因Ｂｓｕ相似４２％；與地衣芽孢桿菌ＴＰ菌株幾丁質酶基因Ｂl相似２８％；與Ｓ． ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ菌株１４１ 幾丁質酶基因Ｓｍ相似７％（見圖１）。

將ｃｈｉＡＣ翻譯得到的蛋白序列ＣｈｉＡＣ與ＧｅｎＢａｎｋ中其他Ｂｔ菌株的幾丁質酶進行比對，結果顯示ＣｈｉＡＣ與其他Ｂｔ菌株的幾丁質酶存在高度相似性，與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｐａｋｉｓｔａｎｉ幾丁質酶ＣｈｉＡ７１相似性為７０％，與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｏｎｋｕｋｉａｎ幾丁質酶Bt相似性為９３％，與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｉsｒａｅｌｅｎｓｉｓ及同為Ｈ４血清型的Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｓｏｔｔｏ幾丁質酶相似性為９７％，與Ｂ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｋｅｎｙａｅ幾丁質酶ＣｈｉＡ７４相似性則有９９％。這些Ｂｔ菌株的幾丁質酶均屬于糖基水解酶１８家族，且同為ＣｈｉＡ。

在ＣｈｉＡＣ的Ｎ端，首先是一段３４氨基酸的信號肽，該信號肽能被革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及其他原核生物識別，在革蘭氏陰性菌中其斷裂位點是Ｌｅｕ－３３和Ａｌａ－３４，在革蘭氏陽性菌和其他原核生物中其斷裂位點是Ａｌａ－３４和Ａｓｐ－３５。其后為催化區(qū)，該結構域在Ｂｔ菌株的幾丁質酶中高度保守，與幾丁質酶活性相關的Ａｓｐ－２０７、Ａｓｐ－２０９和Ｇｌｕ－２１１高度保守。催化區(qū)之后為兩個纖粘蛋白相似區(qū)（Ｆｂｒｏｎｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ，ＦＬＤ），盡管兩個ＦＬＤ相互之間相似性很低（１０％左右），但均含有粘蛋白的典型保守氨基酸殘基（ＦＬＤ１：Ｔｒｐ－３７３、Ｔｙｒ－３８４和Ｔｙｒ－４１１；ＦＬＤ２：Ｔｒｐ－５０７、Ｔｙｒ－５１９和Ｔｙｒ－５４６）。在Ｂｔ菌株的幾丁質酶中，僅巴基斯坦亞種幾丁質酶不含ＦＬＤ１，其余幾丁質酶ＦＬＤｓ的相似性均達到９０％以上。在ＦＬＤｓ之后為位于Ｃ端的幾丁質結合區(qū)，其保守殘基為Ｔｒｐ－５９１、Ｔｙｒ－5９５和Ｔｒｐ－6２６，Ｂｔ菌株的幾丁質酶的該結構域相似性也均達到９０％以上。

２．２ｃｈｉＡＣ基因在Ｔ７啟動子下的表達

幾丁質酶基因ｃｈｉＡＣ ＯＲＦ插入載體ｐＥＴ２８ａ，得到ｃｈｉＡＣ基因ＯＲＦ在Ｔ７啟動子調(diào)控下的重組表達質粒ｐＥＴＣ２１，轉進Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１中，得到重組菌株Ｅ－ｐＥＴＣ２１。對Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ－ｐＥＴ２８ａ、Ｅ－ｐＥＴＣ２１全菌體和純化的幾丁質酶進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析，原始菌株Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１和轉化空載體的對照菌株Ｅ－ｐＥＴ２８ａ均不產(chǎn)生幾丁質酶，而Ｅ－ｐＥＴＣ２１及由其所提取的幾丁質酶均能觀察到ＣｈｉＡＣ蛋白質對應的７０ ｋＤａ表達帶，同時還可觀察到兩條大小分別約４０ ｋＤａ和２９ ｋＤａ的降解蛋白質條帶（圖２）。

２．３在Ｅ－ｐＥＴＣ２１中的表達時相分析

同時接種兩瓶Ｅ－ｐＥＴＣ２１培養(yǎng)，當培養(yǎng)４ ｈ時ＯＤ６００均達到約０．６，此時在一個搖瓶中加入１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ繼續(xù)培養(yǎng)，另一瓶則不加ＩＰＴＧ用作對照。由圖３可知，在加入ＩＰＴＧ誘導后菌株的生長明顯受到抑制，菌體ＯＤ６００最高僅能達到０．８左右，而未加ＩＰＴＧ誘導的菌體ＯＤ６００可達到１．１左右。誘導后菌株的幾丁質酶產(chǎn)量顯著增強，且隨培養(yǎng)時間的延長不斷增長，直至培養(yǎng)１００ ｈ左右酶活最高可達到約４２０ Ｕ／ｍＬ，之后酶活逐漸下降；而未誘導的Ｅ－ｐＥＴＣ２１雖然也能表達產(chǎn)生幾丁質酶，但其產(chǎn)量不高，酶活最高僅能達到１００ Ｕ／ｍＬ。

３討論

本研究所克隆的Bt菌株Ｔ０４Ａ００１的幾丁質酶基因ｃｈｉＡＣ包括啟動子、編碼區(qū)和終止子序列，其編碼區(qū)由分泌信號肽、催化區(qū)、ＦＬＤｓ和幾丁質結合區(qū)４個結構域組成。蛋白質前體的信號肽符合原核生物信號序列特點，即Ｎ末端帶電荷，其后形成一個疏水中心以及極性氨基酸串。成熟的ＣｈｉＡＣ蛋白質的Ｎ端存在一個催化區(qū)，與糖基水解酶１８家族的催化區(qū)有較高的同源性，其中Ｄ２０７、Ｄ２０９、Ｅ２１１高度保守，可能是質子供體。催化區(qū)后有兩個與Ｆｎ Ⅲ結構域有同源性的區(qū)域——ＦＬＤｓ。該結構域對幾丁質酶與幾丁質的結合作用無影響，卻與膠狀幾丁質降解程度有關。目前已在Ｂａｃｉｌｌｕｓ sp.、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ sp.等細菌的幾丁質酶中發(fā)現(xiàn)了ＦｎⅢ同源結構域。除幾丁質酶外，α－淀粉酶、纖維素酶、ＰＨＢ解聚酶等也存在ＦｎⅢ同源結構域。在進行氨基酸序列比對時發(fā)現(xiàn)，在其他結構域高度相似的情況下，同時具有ＦＬＤ１和ＦＬＤ２的Ｂｔ菌株的幾丁質酶ＣｈｉＡ７４為內(nèi)切酶，而缺少ＦＬＤ１區(qū)域的ＣｈｉＡ７１卻為外切酶，因此推測ＦＬＤ１可能影響了幾丁質酶的水解切口部位，同時推測與ＣｈｉＡ７４相似度達９９％且具有ＦＬＤ１的ＣｈｉＡＣ也為內(nèi)切酶。ＣｈｉＡＣ蛋白Ｃ端幾丁質結合區(qū)中的芳香族氨基酸——酪氨酸（Ｔｙｒ）和色氨酸（Ｔｒｐ）也是高度保守的，該結構域能特異結合不可溶幾丁質（如膠狀幾丁質或再生幾丁質）及晶體幾丁質，卻不能與可溶性幾丁質及其他不溶性多糖結合。

幾丁質酶基因ｃｈｉＡＣ在載體ｐＥＴ２８ａ的Ｔ７啟動子調(diào)控下能夠誘導表達，雖然其自身具有較高的本底表達水平，但在ＩＰＴＧ誘導下，幾丁質酶產(chǎn)量能夠得到顯著且迅速的提高。表達的幾丁質酶在胞內(nèi)和胞外都能檢測到。對菌體進行時相ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析顯示，在３７℃誘導培養(yǎng)時，加入１ ｍmol／L ＩＰＴＧ后的最初２ ｈ內(nèi)可觀察到逐漸增強的７０ ｋＤａ表達蛋白質條帶，但之后繼續(xù)培養(yǎng)，則表達帶的強度保持不變（數(shù)據(jù)未顯示）。對比酶活時相檢測誘導后酶活不斷增強的結果，表明在大腸桿菌中誘導表達的幾丁質酶主要分泌到了胞外。此外，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析中，重組菌株在表達產(chǎn)生７０ ｋＤａ幾丁質酶ＣｈｉＡＣ的同時還產(chǎn)生兩條大小分別為４０ ｋＤａ左右和２９ ｋＤａ左右的蛋白質條帶，推測它們是７０ ｋＤａ ＣｈｉＡＣ的降解產(chǎn)物。

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