大孔樹脂純化金毛狗脊葉黃酮的工藝研究

摘要：比較４種大孔樹脂純化金毛狗脊葉總黃酮的性能及工藝，結(jié)果表明，ＤＡ－２０１樹脂對金毛狗脊葉總黃酮有良好的吸附及解吸性能。其靜態(tài)分離純化工藝的最佳參數(shù)為ＤＡ－２０１大孔樹脂與提取液的比例為１∶５（Ｗ∶Ｖ，ｇ∶ｍＬ）、提取液ｐＨ值為３、恒溫振蕩時間２ ｈ、解吸液為６０％的乙醇。動態(tài)分離純化工藝的最佳參數(shù)為吸附和解吸最佳流速均為１ ｍＬ／ｍｉｎ、解吸液體積為４倍柱體積。

關(guān)鍵詞：大孔樹脂；金毛狗脊葉；總黃酮；純化

中圖分類號：Ｒ２８４．２文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）03－0583-0４

Study on the Purification of Flavonoid from the Leaves of Cibotium barometz（L）J. Sm.

by Macroporous Resin

ＬＩＮ Ｙａｎ－ｒｕ１，２，ＣＡＯ Ｑｉａｎ－ｙｏｎｇ１

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００３１，Ｊｉａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈａｎｓｈａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｏｚｈｏｕ ５２１０４１，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｆｏｕｒ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ｔｏｔａl ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｉｂｏｔｉｕｍ ｂａｒｏｍｅｔｚ（L）J. Sm． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＤＡ－２０１ ｒｅｓｉｎ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ａｂｓｏｒｂａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｃ． ｂａｒｏｍｅｔｚ （L）J. Sm． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｉｔｓ ｓｔａｔｉｃ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗｅｒｅ： ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｒｅｓｉｎｓ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｓ ａｔ １∶５（Ｗ∶Ｖ，g∶mL）， ｐＨ ｖａｌｕｅ ａｔ ３， ｓｈａｋｅ ａｔ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ２ｈ， ａｎｄ ６０％ ａｌｃｏｈｏｌ ａｓ ｅｌｕａｎｔ． Ｉｎ ｄｙｎａｍｉｃ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｗｅｒｅ： ｂｏｔｈ ｔｈｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｅｌｕａｎｔ ｆｌｏｗ ｓｐｅｅｄ ｗｅｒｅ ａｔ １ ｍＬ／ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｌｕａｎｔ ｗａｓ ４ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｉｎ ｂｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎ； Ｃｉｂｏｔｉｕｍ ｂａｒｏｍｅｔｚ（L）J. Sm.； ｆｌａｖｏｎｏｉｄ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ

金毛狗脊（Ｃｉｂｏｔｉｕｍ ｂａｒｏｍｅｔｚ（Ｌ）Ｊ．Ｓｍ．）又名金毛狗，為蚌殼蕨科（Ｄｉｃｋｓｏｎｉａｃｅａｅ）金毛狗屬植物，廣泛分布在我國南方和西南地區(qū)，其根莖為常用中藥狗脊［１］。

據(jù)前人研究，金毛狗脊嫩葉具有清熱涼血、利尿通淋等功效，可治療腸炎、痢疾等癥［２］。金毛狗脊葉也含有豐富的活性物質(zhì)，主要為黃酮類物質(zhì)［３，4］。黃酮類化合物廣泛分布于植物藥中，其主要作用有抗菌、抗突變、降壓、消熱解毒、鎮(zhèn)靜、利尿、抗氧化、抗癌，以及降血糖、降血脂、抗病毒、抗衰老等［5］。但金毛狗脊葉卻常常被丟棄，造成資源浪費(fèi)，為了更好地開發(fā)金毛狗脊葉的藥用價值，筆者對金毛狗脊葉總黃酮的分離純化工藝進(jìn)行了初步研究。

大孔吸附樹脂是近十幾年來發(fā)展起來的一類有機(jī)高分子聚合物吸附劑，它的物理化學(xué)穩(wěn)定性高，吸附選擇性獨(dú)特，不受無機(jī)物存在的影響，再生簡便，解吸條件溫和，使用周期長，易于構(gòu)成閉路循環(huán)，節(jié)省費(fèi)用等被廣泛用于生化物質(zhì)的分離純化［6，7］。

本試驗(yàn)選擇了４種大孔吸附樹脂對金毛狗脊葉中總黃酮粗提物進(jìn)行靜態(tài)吸附解吸，從中篩選出選擇性好、吸附率高、易解吸的適合金毛狗脊葉總黃酮粗提物分離純化的大孔樹脂，并對其純化的方法和條件做了進(jìn)一步的研究，為今后工業(yè)化研究和開發(fā)金毛狗脊葉黃酮類產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１金毛狗脊葉與試劑金毛狗脊葉采于潮州市西湖山上，洗凈，自然晾干，６０℃烘干，粉碎，備用。蘆丁對照品（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；ＦＬ－１、ＦＬ－３、ＡＢ－８、ＤＡ－２０１大孔吸附樹脂（天津歐瑞生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

１．１．２主要儀器設(shè)備７５２Ｓ紫外可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；格蘭仕電腦型燒烤微波爐（順德市格蘭仕電器實(shí)業(yè)有限公司）；ＢＴ－１００Ｂ數(shù)顯恒流泵（上海瀘西分析儀器廠）；ＥＴ－Ｑ型氣浴恒溫振蕩器（常州榮冠實(shí)驗(yàn)分析儀器廠）；ＰＨＳ－３Ｃ精密酸度計(jì)。

１．２方法

１．２．１標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻(xiàn)［8］中的方法，以吸光值（Ａ）為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度（Ｃ）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆丁質(zhì)量濃度（Ｃ）與吸光值（Ａ）關(guān)系曲線的回歸方程為Ａ＝８．４５４ １Ｃ＋０．００９ ５，

ｒ＝０．９９８ ８。

１．２．２樹脂的預(yù)處理［9］新購吸附劑含有未聚合單體、致孔劑、分散劑等殘留的雜質(zhì)成分，使用前必須加以處理。具體操作如下：用足量的９５％乙醇浸泡２４ ｈ，抽濾，再用大量去離子水洗滌至無乙醇味即可。處理完畢后裝入廣口瓶中，用去離子水浸泡，備用。

１．２．３金毛狗脊葉總黃酮粗提液的制備及含量測定稱取５．０ ｇ金毛狗脊葉樣品，加入２０.0 ｍＬ去離子水，微波１ ｍｉｎ后，冷卻至室溫，加入１１０.0 ｍＬ去離子水及９０.0 ｍＬ ９５％乙醇，混合均勻后，于９０℃恒溫槽中回流１ ｈ。得到萃取液，減壓抽濾，收集濾液，備用。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定總黃酮含量。

１．２．４樹脂對金毛狗脊葉黃酮吸附率的測定［１0］準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的樹脂１．０ ｇ，置于５０.0 ｍＬ具塞磨口三角瓶中，加入一定濃度的金毛狗脊葉黃酮粗提液１０.0 ｍＬ，置于氣浴恒溫振蕩器中（２５℃，１２０

ｒ／ｍｉｎ），充分振蕩１２ ｈ，至吸附平衡，取上層清液，測定其黃酮含量，并按照下式算出吸附率。

吸附率＝×100%

１．２．５樹脂對金毛狗脊葉黃酮解吸率的測定［１0］將１．２．４中充分吸附后的樹脂用去離子水清洗至樹脂表面無黃酮溶液殘留，濾紙吸干樹脂表面殘留的溶液，然后置于５０.0 ｍＬ具塞三角瓶中，加入１０.0 ｍＬ ６０％乙醇，置于氣浴恒溫振蕩器中（２５℃，１２０ ｒ／ｍｉｎ）振蕩解吸１２ ｈ， 至解吸平衡，取上層清液測定總黃酮含量，并按照下式算出解吸率和得率。

解吸率＝（解吸液濃度×解吸液體積）／［（提取液濃度－吸附平衡后溶液濃度）×提取液體積］×１００％；得率＝（解吸液濃度×解吸液體積）／（提取液濃度×提取液體積）。

２結(jié)果與分析

２．１不同樹脂對金毛狗脊葉黃酮的靜態(tài)吸附率和解吸率［１0］

ＦＬ－１、ＦＬ－３、ＡＢ－８、ＤＡ－２０１大孔樹脂對金毛狗脊葉黃酮粗提液中金毛狗脊葉總黃酮的靜態(tài)吸附率見圖１，靜態(tài)解吸率見圖2，黃酮得率結(jié)果見圖3。

從圖１～３可以看出，ＦＬ－１對金毛狗脊葉提取液中的黃酮類物質(zhì)具有極高的吸附能力，但解吸率很低，說明金毛狗脊葉中黃酮的極性較大，ＦＬ－１樹脂與其的結(jié)合能力較強(qiáng)，不利于后續(xù)黃酮類物質(zhì)的解吸。ＤＡ－２０１對金毛狗脊葉總黃酮的吸附率和解吸率都較高，得率可達(dá)４０．１％，而ＦＬ－３和ＡＢ－８樹脂雖有一定的吸附和解吸能力，但效果均不如ＤＡ－２０１樹脂。因此，選用ＤＡ－２０１樹脂純化金毛狗脊葉總黃酮。

２．2ＤＡ－２０１大孔樹脂純化條件的確定

２．2．１ＤＡ－２０１大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)按照１．２．４、１．２．５的試驗(yàn)方法，考察各種不同條件下，ＤＡ－２０１樹脂對提取液的吸附和解吸能力。①不同吸附方式下作用時間對靜態(tài)吸附的影響［１1］。準(zhǔn)確吸取兩份提取液２０．０ ｍＬ，各加入４．０ ｇ樹脂，分別進(jìn)行振蕩吸附與靜置吸附。每小時吸?。埃?ｍＬ，測定其黃酮濃度，得出吸附率，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)特征曲線（圖４）。圖4表明，振蕩吸附的效果明顯優(yōu)于靜置吸附，并且當(dāng)振蕩吸附時間達(dá)到２ ｈ時，吸附量趨于飽和，故確定靜態(tài)吸附時間為２ ｈ。②樹脂用量對靜態(tài)吸附的影響［１2］。將樹脂與提取液按照不同的比例即料液比混合（１∶５、１∶１０、１∶２０、１∶３０），并置于氣浴恒溫振蕩器中（搖床１２０ ｒ／ｍｉｎ），充分振蕩３ ｈ，測定樹脂的吸附效果。結(jié)果表明（圖5），料液比為１∶５時，樹脂對黃酮的吸附率最高，可達(dá)８１．２％。③提取液ｐＨ值對靜態(tài)吸附的影響［１3］。將提取液調(diào)成不同ｐＨ值進(jìn)行靜態(tài)吸附。結(jié)果表明（圖6），提取液的ｐＨ值對樹脂的吸附作用有很大的影響，在中性條件下樹脂的吸附率較低，在酸性（ｐＨ值為３）和堿性（ｐＨ值為１２）條件下吸附率較高，分別可達(dá)到８３．２％和８１．８％。④解吸液體積濃度對靜態(tài)解吸的影響。配制一系列不同體積百分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，準(zhǔn)確吸取一定量體積，加入到已吸附飽和的樹脂，振蕩１２ ｈ后，測定解吸率。結(jié)果表明（圖7），６０％的乙醇溶液對樹脂的解吸效果最好，乙醇濃度過大或過小都不能達(dá)到最佳的解吸效果。這是因?yàn)?，黃酮類物質(zhì)易溶于乙醇，而在水中的溶解度較低，乙醇濃度的降低不利于解吸；當(dāng)乙醇濃度偏高時，解吸液的極性降低，同樣也不利于解吸。只有當(dāng)乙醇濃度適中時才可達(dá)到較好的解吸效果［１4］。

２．2．２ＤＡ－２０１大孔樹脂動態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)①流速對動態(tài)吸附的影響［１4］。將預(yù)處理好的樹脂裝入層析柱中，柱體積為１５.0 ｍＬ，通過恒流泵控制提取液流速分別為１、２、３ ｍＬ／ｍｉｎ，每５．０ ｍＬ收集一次流分，并測定其濃度，得出吸附率。結(jié)果表明（圖8、圖9），流速為１ ｍＬ／ｍｉｎ時的泄漏點(diǎn)較晚出現(xiàn)，且吸附率較高，其原因可能是流速較慢時提取液與樹脂接觸的時間較長，有利于黃酮類物質(zhì)從液相擴(kuò)散到樹脂內(nèi)部，從而提高了吸附率。因此，動態(tài)吸附的最佳流速為１ ｍＬ／ｍｉｎ。②流速對動態(tài)解吸的影響［9］。將已吸附飽和的樹脂裝入層析柱中，柱體積為１５.0 ｍＬ，用６０％的乙醇溶液進(jìn)行動態(tài)解吸，通過恒流泵控制乙醇流速分別為１、２、３ ｍＬ／ｍｉｎ，每５．０ ｍＬ收集一次流分，并測定其濃度。結(jié)果表明（圖10），以

１ ｍＬ／ｍｉｎ的流速進(jìn)行解吸得到的峰形最窄，峰值最高，幾乎無拖尾現(xiàn)象，解吸效果較好，而以２ ｍＬ／ｍｉｎ和３ ｍＬ／ｍｉｎ的流速解吸得到的峰值較低。這可能是由于流速過快時，乙醇溶液與樹脂的接觸時間較短，乙醇分子來不及與樹脂充分作用就已流出，導(dǎo)致解吸曲線的峰值較低，解吸效果較差。因此，選用１ ｍＬ／ｍｉｎ為解吸流速。由曲線圖也可看出，當(dāng)解吸液體積為４倍柱體積（６０．０ ｍＬ）時，樹脂中黃酮類物質(zhì)已基本被解吸下來。

３結(jié)論

考察了４種不同型號大孔樹脂對金毛狗脊葉黃酮的吸附和解吸能力。結(jié)果表明，ＤＡ－２０１大孔樹脂對金毛狗脊葉黃酮具有良好的純化作用。其靜態(tài)分離純化工藝的最佳條件為ＤＡ－２０１大孔樹脂與提取液的比例為１∶５、提取液ｐＨ值為３、恒溫振蕩時間２ ｈ、解吸液為６０％的乙醇。動態(tài)分離純化工藝的最佳條件為吸附和解吸最佳流速均為１ ｍＬ／ｍｉｎ、解吸液體積為４倍柱體積。

金毛狗脊葉植物資源分布廣，黃酮類物質(zhì)含量較高，利用大孔樹脂考察分離純化金毛狗脊葉黃酮的最佳工藝，為其在醫(yī)藥和食品加工中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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