硒形態(tài)分析研究進(jìn)展

摘要：綜述了近年來(lái)關(guān)于微量元素硒形態(tài)分析領(lǐng)域取得的最新研究成果，尤其是聯(lián)用技術(shù)在硒形態(tài)分析中的應(yīng)用，主要包括不同的樣品前處理方法以及形態(tài)分析所取得的結(jié)果。

關(guān)鍵詞：硒；形態(tài)分析；聯(lián)用技術(shù)

中圖分類號(hào)：Ｓ１３２文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）03－0437-05

Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｓｅｌｅｎｉｕｍ Ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ

ＬＩ Ｎａ1，ＷＡＮＧ Ｘｕ2，ＳUN Fａｎｇ－ｆａｎｇ2，ＨE Wｕ2，ＬI Lｉ2，ＹANG Hｕｉ2，ＷAN Kａｉ2，ＷＡＮＧ Ｆｕ－ｈｕａ2

（1.Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Wuhan 430070，China；

2.Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ ａｎｄ Ｆｒｕｉｔｓ Ｑｕａｌｉｔｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｇａｖｅ ａ ｒｅｖｉｅｗ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｌａｔｅｓｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｅｌｅｍｅｎｔ—Ｓｅｌｅｎｉｕｍ（Ｓｅ）， ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｈｅｎａｔｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｍａｉｎｌｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Sｅｌｅｎｉｕｍ； ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ； ｈｙｐｈｅｎａｔｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ

硒是人體必需的微量元素。人體內(nèi)含有多種以硒化合物為活性中心的酶，如紅細(xì)胞谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（ＲＢＣ ＧＳＨ－ＰＸ）、磷脂氫過(guò)氧化物谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（ＰＨＧ－ＰＸ）、血漿谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（ＰＧＳＨ－ＰＸ）。這些酶具有抗氧化作用、提高紅細(xì)胞的攜氧能力、提高人體免疫機(jī)能等重要的生物功效。人體缺硒會(huì)導(dǎo)致克山病、大骨節(jié)病等地方病，血硒水平偏低會(huì)引起癌癥死亡率升高，因此硒享有“生命的火種”“具有保健作用的神奇礦物”的美譽(yù)。

但硒同時(shí)也是一個(gè)典型的雙功能元素。適量的硒有利于人體健康，但攝入硒過(guò)量會(huì)導(dǎo)致人體多種中毒癥狀。１９６０年，在湖北恩施發(fā)現(xiàn)一種臨床表現(xiàn)為“毛發(fā)脫落，指（趾）甲損害，皮膚損害，神經(jīng)系統(tǒng)損害”的癥狀，現(xiàn)在已經(jīng)確認(rèn)該病為地方性硒中毒，是當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境和農(nóng)作物含硒量過(guò)高所引起的。美國(guó)生物學(xué)家Ｊｏｓｅｐｈ認(rèn)為，“硒在所有具有毒性的化學(xué)制品中具有最狹窄的安全和危險(xiǎn)界限”。

硒所具有的重要生物功能使其成為功能性食品的青睞元素，但由于硒的攝入量存在限值，比如英國(guó)規(guī)定人體每日的硒攝入量不能超過(guò)７０ μｇ，而中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的日攝入量為１００～２４０ μｇ，所以對(duì)食品和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑中硒含量的檢測(cè)是食品安全領(lǐng)域的熱點(diǎn)。但是研究表明，硒的營(yíng)養(yǎng)性和毒性、在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律，不僅取決于硒的總量，同時(shí)更取決于它的形態(tài)。但是形態(tài)分析比傳統(tǒng)的總量分析復(fù)雜很多，因?yàn)榇蠖鄶?shù)食品中硒含量比較低，而且在前處理的過(guò)程中硒容易揮發(fā)和轉(zhuǎn)化。為了克服這些難題，近些年來(lái)，科技工作者從新技術(shù)手段的引用（主要表現(xiàn)為分析儀器的聯(lián)用技術(shù)）、前處理的改進(jìn)等方面對(duì)食品中硒的形態(tài)分析做了大量工作，以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同基質(zhì)的食品進(jìn)行準(zhǔn)確、高效的定量和定性分析。

１不同基質(zhì)樣品的前處理

對(duì)于生物體樣品，前處理方法相對(duì)比較簡(jiǎn)單。血漿、乳清和尿液等樣品經(jīng)過(guò)過(guò)濾和稀釋可直接進(jìn)入色譜柱。含硒的氨基酸多為水溶性，用熱水可浸取出與大分子結(jié)合的硒化合物。樣品用水?dāng)噭?，?jīng)超聲振蕩加熱處理和超聲離心，硒浸取率約為９０％。含硒氨基酸還可用超濾或透析分離。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，某些含硒氨基酸容易氧化降解，用羥甲基衍生物可以對(duì)其加以穩(wěn)定，以防降解。在分析鼠尿樣品中的硒含量時(shí)，Ｙａｓｕｍｉｔｓｕ等［１］指出必須對(duì)樣品進(jìn)行純化，去除ＮａＣｌ和脲以滿足ＥＳＩ–ＭＳ的測(cè)定要求。

在對(duì)植物性樣品進(jìn)行分析時(shí)，根據(jù)不同的分離、檢測(cè)目的，所采用的前處理方法也有差異。Ｅｍｅｓｅ等［２］用酶水解胡蘿卜樣品以提取蛋白硒和非蛋白硒，離心分離測(cè)定硒的各種形態(tài)。實(shí)驗(yàn)表明，胡蘿卜的葉子和根中硒的提取率分別是（７５±２）％和（７８±３）％（ｎ＝３），檢測(cè)限是４５ ｎｇ／ｇ（８０Ｓｅ）。Ｓａｓｉ等［３］在測(cè)定巴西干果中的硒形態(tài)時(shí)，采用了先去除脂肪，然后利用蛋白酶進(jìn)行水解的方法，提取效率達(dá)到了８９％，檢測(cè)到多種含硒氨基酸。

Ｍａｒｉａ等［４］用含Ｎａ２ＳｅＯ３的營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)大蒜和芥菜，用微波消解（１．５ ｍＬ ＨＮＯ３，１．５ ｍＬ Ｈ２Ｏ２）的方法作為測(cè)總硒的預(yù)備試驗(yàn)；在做硒的形態(tài)分析時(shí)，前處理中該試驗(yàn)比較了３種提取液（０．１ ｍｏｌ／Ｌ鹽酸，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸銨緩沖液，蛋白酶水溶液）對(duì)硒的浸提效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用０．１ ｍｏｌ／Ｌ的鹽酸作浸提劑時(shí)，硒的形態(tài)分析進(jìn)行得比較好。同時(shí)發(fā)現(xiàn)用鹽酸或者醋酸銨作提取劑時(shí)，超聲波探測(cè)器能快速提取含硒物質(zhì)，由此帶來(lái)的形態(tài)降解可以忽略不計(jì)。

Ｇｅｒｇｅｌｙ等［５］分析雙孢蘑菇（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、香菇中的硒形態(tài)時(shí)，比較了３種蛋白質(zhì)提取方案（０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ，３０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩沖液，酶消解）的效果，發(fā)現(xiàn)２４ｈ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩沖液提取，加入丙酮的方法提取水溶態(tài)的含硒蛋白質(zhì)效果最好；在利用酶體系進(jìn)行消解時(shí)，胰蛋白酶在５０℃的條件下處理２４ ｈ可以達(dá)到比較高的降解和提取效率。

同樣是分析富硒雙孢蘑菇（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）中的硒形態(tài)，Ｓｔｅｆａ′ｎｋａ等人［６］采用三步提取法（水提取，胃蛋白酶提取，胰蛋白酶提?。?duì)樣品中的硒進(jìn)行浸提，提取效率達(dá)到７５％；用高效液相色譜和水力高壓霧化器連用對(duì)浸提液進(jìn)行分析，成功檢測(cè)出ＳｅＣｙｓ２和Ｓｅ（Ⅳ），檢出限達(dá)到０．２５ mg／Ｌ。

在對(duì)細(xì)香蔥進(jìn)行分析時(shí)，不同的提取劑得到的含硒物質(zhì)并不相同。Ｅｍｅｓｅ等［７］用三種不同的硒營(yíng)養(yǎng)液（Ｓｅ（Ⅳ），Ｓｅ（Ⅵ），硒蛋氨酸）培養(yǎng)細(xì)香蔥，分別用高氯酸—乙醇和酶提取細(xì)香蔥中的含硒物質(zhì)，分析結(jié)果表明高氯酸—乙醇提取液中主要含Ｌ－硒甲基硒半胱氨酸，而酶提取液中檢測(cè)到Ｌ－硒蛋氨酸。

Ｇóｍｅｚ－Ａｒｉｚａ等［８］對(duì)酵母進(jìn)行硒的形態(tài)分析時(shí)比較了４種不同的提取方法的效果，包括加壓液相提取法（ＰＬＥ）、機(jī)械攪拌法、聲波降解法和索氏抽提器法。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ＰＬＥ法能夠更高效率地提取硒半胱氨酸、硒蛋氨酸和Ｓｅ（Ⅳ）。同時(shí)對(duì)酵母的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，認(rèn)為１１ ｍＬ的ＰＬＥ槽、硅藻土作分散劑、１∶１ （V∶V） Ｈ２Ｏ∶ＭｅＯＨ是比較優(yōu)化的提取條件。在測(cè)定自然水樣中的硒物質(zhì)含量時(shí)， Ｂｕｅｎｏ等［９］ 用Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ－７４３ 樹(shù)脂濃縮水樣，成功檢測(cè)出Ｓｅ（Ⅳ）、Ｓｅ（Ⅵ）、 硒胱氨酸。試驗(yàn)證明該方法的準(zhǔn)確性適于檢測(cè)環(huán)境水平的硒濃度（１０ ｎｇ／Ｌ）。

張玲金等［１０］建立微波密閉Ｈ２Ｏ２－ＨＮＯ３消解、分離、測(cè)定植物樣品中不同形態(tài)硒，以差減法獲得了5種不同形態(tài)硒化合物的含量，包括可溶態(tài)硒、不溶態(tài)硒、四價(jià)硒、六價(jià)硒、有機(jī)硒，該方法的回收率達(dá)到９５％～１０５％。

２分離與檢測(cè)

在近些年的研究中，硒的分離和檢測(cè)主要是利用各種聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。氣相色譜、液相色譜的迅速發(fā)展，原子熒光、原子吸收、等離子體質(zhì)譜的技術(shù)更新，以及各種連接技術(shù)的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，為硒的形態(tài)分析提供了技術(shù)支持。根據(jù)各種含硒化合物的不同性質(zhì)，采用不同的聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析。

２．１氣相色譜分離與檢測(cè)

氣相色譜可以用來(lái)分離揮發(fā)性的二甲基硒、二甲基二硒；如果分離硒氨基酸需要用衍生法增加其揮發(fā)性。Ｂｅｒｉｌ等［１１］用ＧＣ－ＭＳ進(jìn)行硒酵母中硒的形態(tài)分析時(shí)，用氯甲酸乙酯衍生法分離、測(cè)定富硒酵母中的硒蛋氨酸、硒半胱氨酸，試驗(yàn)證明該法能夠迅速、有效地分離、測(cè)定兩種氨基酸。目前已用于食品強(qiáng)化劑中硒化合物的測(cè)定。

２．２毛細(xì)管電泳分離和檢測(cè)

毛細(xì)管電泳與紫外和可見(jiàn)光檢測(cè)已用于金屬硫蛋白的分離。Ｓａｓｉ［３］等用毛細(xì)管電泳的方法分離巴西干果提取液中的各種含硒物質(zhì)，ＩＣＰ－ＭＳ檢測(cè)，在７ ｍｉｎ內(nèi)分離出亞硒酸、硒酸、硒胱氨酸和硒蛋氨酸。計(jì)算各種硒的相對(duì)含量，認(rèn)為硒代蛋氨酸是巴西干果中硒的主要形式。

２．３高效液相色譜分離與檢測(cè)

２．３．１體積排阻色譜（ＳＥＣ）ＳＥＣ是按溶質(zhì)分子的大小來(lái)分離混合物的，是一種比較溫和的分離技術(shù)，通常不會(huì)引起元素形態(tài)的丟失，適用于不穩(wěn)定或與金屬絡(luò)合較弱的生物大分子。Ｋａｔａｒｚｙｎａ等［１２］用含硒標(biāo)準(zhǔn)溶液培養(yǎng)洋蔥一周，將其分為葉和鱗莖，用０．１ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ提取液，用ＳＥＣ－ＭＳ分析，結(jié)果證實(shí)硒與高分子部分的結(jié)合在葉子中比在鱗莖中多；去除低分子化合物和無(wú)機(jī)硒后，用離子對(duì)高效液相色譜進(jìn)行硒的形態(tài)分析，證實(shí)其葉的提取物中主要的有機(jī)硒是硒甲基硒半胱氨酸；用酶水解富硒洋蔥，發(fā)現(xiàn)鱗莖中的主要有機(jī)硒是γ－谷胺?；谆腚装彼?。

Ｍｏｒｅｎｏ等［１３］用ＳＥＣ與ＩＣＰ－ＭＳ和ＵＶ檢測(cè)器聯(lián)用對(duì)冷凍干燥的生物樣品（魚類、甲殼類、蔬菜類、酵母）進(jìn)行分析；對(duì)生物樣品的水溶部分和殘?jiān)鼞B(tài)進(jìn)行酶消解，用陽(yáng)離子交換色譜連接ＩＣＰ－ＭＳ進(jìn)行分析，用Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＰＲＰ－Ｘ２００柱和不同ｐＨ條件下的４ ｍｍｏｌ／Ｌ吡啶（１ ｍＬ／ｍｉｎ）作流動(dòng)相。結(jié)果只在蔬菜樣品中檢測(cè)到硒胱氨酸（０．１～０．７ mg/kg）；在牡蠣、蛤貝、鮭魚、白三葉草中檢測(cè)到三甲基硒（０．１～０．３ mg/kg）；在硒化酵母、磷蝦、白三葉草中檢測(cè)到亞硒酸（０．２～３.0 mg/kg）；硒酸鹽只存在于酵母中，含量為８ mg/kg。

２．３．２離子交換色譜（ＩＥＣ）與ＳＥＣ相比，ＩＥＣ的優(yōu)點(diǎn)是分離效率高，應(yīng)用范圍廣。其分離過(guò)程是基于帶電溶質(zhì)離子與固定相的反電荷表面的交換平衡。Ｅｍｅｓｅ等［７］在種植胡蘿卜時(shí)施葉面肥１００ mg／Ｌ

Ｓｅ（Ⅳ），陰離子交換和陽(yáng)離子交換ＨＰＬＣ法與ＩＣＰ-ＭＳ聯(lián)用檢測(cè)根部提取液，檢測(cè)到硒蛋氨酸、γ－Ｇｌｕ－ＭｅＳｅＣｙｓ、Ｓｅ（Ⅳ）；實(shí)驗(yàn)表明γ－Ｇｌｕ－ＭｅＳｅＣｙｓ、硒蛋氨酸是胡蘿卜根中硒的主要有機(jī)形態(tài)，檢測(cè)限是４５ ｎｇ／ｇ（８０Ｓｅ）。Ｆａｎｇｓｈｉ等［１４］用ＨＰＬＣ柱子（２５ ｃｍ×４ ｍｍ×５ μｍ），陰離子交換ＥＳＡ Ａｎｉｏｎ Ⅲ進(jìn)行硒的形態(tài)分析，檢測(cè)到Ｓｅ（Ⅳ）、Ｓｅ（Ⅵ）、三甲基硒離子、硒蛋氨酸。使用ｐＨ５．５的０．００５５ ｍｏｌ／Ｌ醋酸銨作流動(dòng)相，流速為１．５ ｍＬ／ｍｉｎ，在ｍ／ｚ為７８時(shí)用ＩＣＰ－ＭＳ測(cè)量硒，用超聲波霧化提高霧化的效率。此方法中各種硒的檢測(cè)限（μｇ／Ｌ）：三甲基硒離子，０．０８；Ｓｅ（Ⅳ），０．３４；硒蛋氨酸，０．１８；Ｓｅ（Ⅵ），０．０７。Ｚｈｅｎｇ等［１５］用混合離子對(duì)試劑分離了８種含硒化合物：Ｓｅ（Ⅳ）、Ｓｅ（Ⅵ）、硒胱氨酸，硒脲、硒蛋氨酸、硒乙基硫氨酸、硒胱胺、三甲基硒離子，所使用的流動(dòng)相是２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ丁烷磺酸鈉和８ ｍｍｏｌ／Ｌ羥化四甲胺，使用ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＲＰ１８反相柱，耗時(shí)１８ ｍｉｎ。

Ｚｈａｎｇ等［１６］用陰離子交換樹(shù)脂Ｄｏｗｅｘ １－１０Ｘ

對(duì)長(zhǎng)藥芥屬（Ｓｔａｎｌｅｙａ ｐｉｎｎａｔａ）的提取液進(jìn)行分析，ＨＧ－ＡＡＳ檢測(cè)。結(jié)果表明硒化合物可以被樹(shù)脂柱定量分離；５種硒化合物（三甲基硒離子、二甲基硒氧化物、硒蛋氨酸、Ｓｅ（Ⅳ）、Ｓｅ（Ⅵ））的回收率范圍是９２．９％～１０３．０％；植物中可溶態(tài)硒化合物：硒氨基酸占７３．０％～８５．５％，Ｓｅ（Ⅵ）占７．５％～１９．５％，非氨基酸有機(jī)硒＜７％。實(shí)驗(yàn)表明，植物生長(zhǎng)過(guò)程中積累的大量Ｓｅ（Ⅵ）被代謝為含硒氨基酸。本方法的檢出限為１ mg/kg。Ｌｉｎ［１７］用Ｄｏｗｅｘ １Ｘ２樹(shù)脂和ＡＡＳ檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)地下水中的Ｓｅ（Ⅳ）和Ｓｅ（Ⅵ）進(jìn)行了分析，分別用０．１和１.0 ｍｏｌ／Ｌ的硝酸作淋洗液，測(cè)得溶解態(tài)硒的平均濃度是（３２．１±１７．６）ｎｇ／Ｌ，Ｓｅ（Ⅵ）占總可溶態(tài)硒的４７．６％～６１．２％，平均為５３．８％，檢測(cè)限為５．６ ｎｇ／Ｌ。

Ｇｏｓｅｔｔｉ等［１８］用離子交換色譜和離子阱質(zhì)譜對(duì)食品增補(bǔ)劑中的含硒物質(zhì)進(jìn)行形態(tài)分析；用甲醇、水混合物作流動(dòng)相對(duì)含硒有機(jī)物進(jìn)行梯度淋洗；用含甲醇、四丁基氨的水溶液對(duì)含硒無(wú)機(jī)物進(jìn)行梯度淋洗；色譜分析中使用Ｌｕｎａ Ｃ１８固定相。該實(shí)驗(yàn)得到的硒形態(tài)有：硒－Ｌ－蛋氨酸、Ｌ－硒胱氨酸、苯基－Ｌ－硒半胱氨酸、甲基－硒－Ｌ－半胱氨酸、甲烷硒酸、硒氰酸鹽、硒酸、亞硒酸。Ｎｉｅｄｚｉｅｌｓｋｉ［１９］用ＨＰＬＣ–ＨＧ–ＡＡＳ法對(duì)地下水進(jìn)行形態(tài)分析，實(shí)驗(yàn)中用到了Ｓｕｐｅｌｃｏ ＬＣ－ＳＡＸ１陰離子交換柱（２５０ mm×４．６ mm×５ μｍ）同時(shí)檢測(cè)到Ａｓ（Ⅲ），Ａｓ（Ⅴ），Ｓｅ（Ⅳ）和Ｓｅ（Ⅵ），其中Ｓｅ（Ⅳ）和Ｓｅ（Ⅵ）的檢測(cè)限分別為２．４ μｇ／Ｌ和１８．６ μｇ／Ｌ。

王振華等［２０］用ＰＲＰ－Ｘ１００陰離子交換柱和保護(hù)柱同時(shí)進(jìn)行了砷和硒的形態(tài)分析，流動(dòng)相為ｐＨ值５．６的１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４溶液（添加２．５％的甲醇），在１２ ｍｉｎ內(nèi)同時(shí)分離了Ａｓ（Ⅲ）、ＭＭＡ、ＤＭＡ、Ａｓ（Ⅴ）、ＳｅＣｙｓ２、ＳｅＭｅｔ和Ｓｅ（Ⅳ）等化合物，實(shí)驗(yàn)中的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為１．９％～６．１％。

韋昌金等［２１］建立了離子交換色譜－氫化物發(fā)生雙道原子熒光聯(lián)用同時(shí)測(cè)定４種Ａｓ形態(tài)和３種Ｓｅ形態(tài)的方法，采用ＰＲＰ－Ｘ１００陰離子交換分析柱可以在１０ ｍｉｎ內(nèi)同時(shí)分離、檢測(cè)Ａｓ和Ｓｅ形態(tài)，各種硒化合物的檢測(cè)限為：ＳｅＣｙｓ2 ０．６ μｇ／Ｌ、Ｓｅ（Ⅳ）０．５ μｇ／Ｌ、ＳｅＭｅｔ ３ μｇ／Ｌ。各形態(tài)的精密度ＲＳＤ（ｎ＝７）均小于５％，用此方法測(cè)定了富硒營(yíng)養(yǎng)品中的Ａｓ和Ｓｅ形態(tài)，加標(biāo)回收率在９１％～１１５％之間。

２．３．３反相高效液相色譜（ＲＰ－ＨＰＬＣ）ＲＰ－ＨＰＬＣ利用極性比流動(dòng)相弱的固定相來(lái)分離分析物。保留機(jī)制是基于分析物的憎水性。該方法的應(yīng)用范圍廣，對(duì)不同形態(tài)的分辨率高。用多種流動(dòng)相可以提供分離的多樣性，另一優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性好。Ｉｐｏｌｙｉ等［２２］用反相液相色譜直接氫化物發(fā)生原子熒光光度法進(jìn)行硒的形態(tài)分析；用ｐＨ為４的０．０１ ｍｏｌ／Ｌ的醋酸銨溶液作淋洗液，其中含有０．５％的甲醇、０．１ ｍｏｌ／Ｌ的ＤＤＡＢ；各種硒化物的檢測(cè)限（μｇ／Ｌ）為：硒蛋氨酸，７０；硒乙基硫氨酸，９６；Ｓｅ（Ⅳ），１６。

彭嵐等［２３］用 Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３反相色譜柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ×５ μｍ）對(duì)底泥中的硒進(jìn)行了形態(tài)分析，試驗(yàn)中優(yōu)化的流動(dòng)相條件：濃度為 ５ ｍｍｏｌ／Ｌ的四丁基硫酸氫銨（ｐＨ６．０）、２．５ ｍｍｏｌ/Ｌ磷酸二氫銨、體積分?jǐn)?shù)５％甲醇、流速１．５ ｍＬ／ｍｉｎ；實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到Ｓｅ（Ⅳ）、Ｓｅ（Ⅵ）、ＳｅＭｅｔ和ＳｅＣｙs2等４種不同的硒形態(tài)，檢測(cè)限為０．５～１．９ μｇ／Ｌ。

張濤等［２４］用ＲＰＬＣ－ＩＣＰ－ＭＳ法對(duì)富硒大米的酶解液中的硒代氨基酸含量進(jìn)行分析，色譜柱為Ｗａｔｅｒｓ ＲＰ１８反相柱（（１５０ ｍｍ×３９ ｍｍ×５ μｍ），并聯(lián)有ＲＰ１８保護(hù)柱（２０ ｍｍ×３９ ｍｍ×５ μｍ），流動(dòng)相為０．１％七氟丁酸，含甲醇０．３％，流速為０．８ ｍＬ／ｍｉｎ，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大米中的硒主要以硒代半胱氨酸的形式存在。

２．３．４離子對(duì)色譜（ＩＰ－ＨＰＬＣ）ＲＰ－ＨＰＬＣ僅能分離非極性不帶電的分析物，在分離帶電的極性分析物時(shí)需要用離子對(duì)試劑。固定相是標(biāo)準(zhǔn)硅烷化的硅膠填料如Ｃ８、Ｃ１８，流動(dòng)相是由磷酸鹽或醋酸鹽、有機(jī)改進(jìn)劑甲醇或乙腈和離子對(duì)試劑組成的水溶液緩沖體系。離子對(duì)試劑與分析物生成離子對(duì)保留在反相柱上。離子對(duì)試劑參與流動(dòng)相中分析物與非極性固定相之間的平衡。

Ｚｈｅｎｇ等［２５］用兩相離子對(duì)反相色譜對(duì)硒營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑進(jìn)行分離，ＩＣＰ－ＭＳ檢測(cè)，得到９種含硒物質(zhì)：亞硒酸、硒酸、硒脲、三甲基硒離子、硒胱胺、硒胱氨酸、硒半胱氨酸、硒蛋氨酸、硒乙基硫氨酸，檢測(cè)限為１ μｇ／Ｌ，達(dá)到了很好的分離效果。Ｗａｎｇ等［２６］用ＩＣ－ＩＣＰ－ＤＲＣ－ＭＳ對(duì)環(huán)境和生物樣品進(jìn)行分析。ｐＨ為９時(shí)（ＮＨ４）２ＣＯ３和ＣＨ３ＯＨ進(jìn)行梯度淋洗，在１２ ｍｉｎ內(nèi)色譜分離所有的物質(zhì)，離子色譜柱上的洗脫液輸送至ＩＣＰ－ＤＲＣ－ＭＳ的霧化系統(tǒng)中，檢測(cè)砷和硒的化合物。用峰高作定量研究，硒的檢測(cè)限是０．０１～０．０２ μｇ／Ｌ。

２．３．５多維色譜聯(lián)用技術(shù)為了更好地分離各種硒化合物以利于后續(xù)檢測(cè)，多維色譜聯(lián)用技術(shù)方興未艾。Ｍａｒｉａ等［４］用鹽酸浸提富硒植物大蒜和芥菜，用離子對(duì)反相色譜和體積排阻色譜／離子交換液相色譜與ＩＣＰ－ＭＳ方法聯(lián)用對(duì)浸提液進(jìn)行形態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)硒的主要形態(tài)是硒甲基硒半胱氨酸和硒蛋氨酸。

Ｇｅｒｇｅｌｙ等［５］用ＲＰ－ＩＰ－ＨＰＬＣ－ＩＣＰ－ＭＳ測(cè)定雙孢蘑菇和香菇的蛋白質(zhì)酶提取液中的硒物質(zhì)，鑒別出3種含硒氨基酸：硒胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒蛋氨酸，檢測(cè)限為１２ μｇ／Ｌ。Ｓｍｒｋｏｌ等［２７］用ＨＰＬＣ－ＵＶ－ＨＧ－ＡＦＳ對(duì)噴灑了硒酸鈉溶液的苦蕎麥進(jìn)行硒的形態(tài)分析，其中液相色譜部分用了Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＰＲＰ Ｘ－１００陰離子交換柱和Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＰＲＰ Ｘ－２００陽(yáng)離子交換柱，分別用４０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４溶液 （ｐＨ ６）和１０ ｍｍｏｌ／Ｌ的吡啶溶液（ｐＨ １．５）作流動(dòng)相，采用酶水解的方法，發(fā)現(xiàn)蕎麥種子提取物中（９３±５）％的硒為硒蛋氨酸。

Ｚｏｙｎｅ等［２８］用１ ｍｇ／Ｌ的Ｎａ２ＳｅＯ３溶液培養(yǎng)富硒花椰菜，陰離子交換柱（ＰＲＰ－Ｘ１００）和體積排阻／離子交換色譜柱對(duì)花椰菜的酶提取液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)硒蛋氨酸是根中主要氨基酸，而硒甲基硒半胱氨酸是花椰菜果實(shí)的主要氨基酸。Ｔｙｒｅ等［２９］以硒蛋氨酸為硒源培養(yǎng)印度芥菜，用液相色譜法（反相離子對(duì)色譜，用七氟丁酸作反離子；陽(yáng)離子交換色譜，用ｐＨ為３的吡啶甲酸鹽淋洗）分離植物提取液中的物質(zhì)，ＩＣＰ－ＭＳ法檢測(cè)，用電噴霧四極時(shí)間飛行質(zhì)譜對(duì)合成的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和根部提取物中的硒甲基硒蛋氨酸進(jìn)行定性。分析結(jié)果認(rèn)為硒甲基硒蛋氨酸為其重要的硒化合物，也可能含有少量的二甲基硒丙酸鹽。

２．４其他聯(lián)用技術(shù)

原子熒光分光光度法和原子吸收分光光度法比較成熟、簡(jiǎn)單易行、使用普遍，所以在很多聯(lián)用技術(shù)中多有使用。Ａｍｉｔ等［３０］用直接氫化物發(fā)生原子吸收方法檢測(cè)人尿中的硒蛋氨酸，檢測(cè)限是１．０８ μｇ／Ｌ，校準(zhǔn)曲線在０～３０ μｇ／Ｌ范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。

３展望

從目前的研究情況可以看出，色譜分離法與光譜類分析法如ＩＣＰ－ＭＳ、ＡＥＳ、ＡＡＳ及ＡＦＳ等的聯(lián)用是今后硒形態(tài)分析的主要方法。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，為了了解有機(jī)硒的形態(tài)，需要分析科學(xué)和其他學(xué)科的交叉滲透、各種分離方法和檢測(cè)技術(shù)的有機(jī)結(jié)合。從目前的研究情況可以看出，以色譜分離法為主體的分離技術(shù)，以其高效的分離能力將在硒形態(tài)分析方面成為主流；光譜類的檢測(cè)技術(shù)，如ＡＦＳ、ＡＡＳ、ＡＥＳ以其檢測(cè)限比較低、成本比較小等優(yōu)點(diǎn)，將在硒的檢測(cè)領(lǐng)域得到更加廣泛的應(yīng)用。在檢測(cè)結(jié)果方面，無(wú)機(jī)硒的形態(tài)分析方法較為成熟，已經(jīng)能夠有效地分離各種無(wú)機(jī)硒；但是有機(jī)硒化合物的檢測(cè)結(jié)果相差比較大，這是因?yàn)橛袡C(jī)硒具有多種形態(tài)，有些已經(jīng)確認(rèn)種類，但是也有一部分由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)而無(wú)法確認(rèn)。要進(jìn)一步準(zhǔn)確地定性、定量測(cè)定多種硒化合物，有賴于多種分析技術(shù)的聯(lián)合使用。這方面的工作還大有可為?？梢灶A(yù)期，硒的形態(tài)分析將隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展取得更大的進(jìn)展，從而為功能性食品的檢測(cè)和人類的健康做出更大的貢獻(xiàn)。

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