家蠶微孢子蟲(chóng)(Ｎosema bombycis)對(duì)蚯蚓的感染性試驗(yàn)

摘要：為了進(jìn)一步探索家蠶微孢子蟲(chóng)的感染宿主范圍以及感染致病機(jī)制，試驗(yàn)采用屬于原生動(dòng)物環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)的動(dòng)物—蚯蚓作為被感染對(duì)象，使用不同濃度的家蠶微孢子蟲(chóng)對(duì)其進(jìn)行感染試驗(yàn)，觀察并統(tǒng)計(jì)蚯蚓的感染和死亡情況，并通過(guò)顯微鏡觀察蚯蚓體內(nèi)微觀變化及微粒子孢子的變化情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，家蠶微孢子蟲(chóng)對(duì)蚯蚓的感染能力較強(qiáng)，其半致死濃度ＬＣ５０為８．６×１０７個(gè)／ｍＬ。

關(guān)鍵詞：家蠶微孢子蟲(chóng)；蚯蚓；感染

中圖分類號(hào)：Ｓ４７６．１；Ｓ８８４．２＋１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）03－0538-03

Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｔｈｅ Ｉｎｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ｔｏ Ｅａｒｔｈｗｏｒｍ

ＬＩＵ Ｒｅｎ－ｈｕａ１，２，ＺＨＯＵ Ｄａ－ｘｉａｎｇ１，２，ＬＩ Ｙａｎ－ｊｉｅ１，２，ＹＡＮＧ Ｊｕｎ－ｎｉａｎ１，２，ＬＩＵ Ｙｕｎ－ｆｅｎｇ１，２

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｗａｎｚｈｏｕ ４０４１００， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ Ｒｅｇｉｏｎ，Ｗａｎｚｈｏｕ ４０４１００，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ， ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎs ｏｆ Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ｗere ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｏ ｅａｒｔｈｗｏｒｍｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ｔｏ ｅａｒｔｈｗｏｒｍｓ waｓ ｓｔｒｏｎｇ， ｔｈｅ ｍｅｄｉａｎ ｌｅｔｈａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （ＬＣ５０） ｗａｓ ８．６×１０７ｐｉｅｃｅ／ｍＬ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ； ｅａｒｔｈｗｏｒｍｓ；ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ

家蠶微孢子蟲(chóng)（Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ） 被家蠶取食后可以引起家蠶疾病，直至死亡。最初被認(rèn)為只能專性寄生于家蠶的單細(xì)胞真核生物。近代研究認(rèn)為，家蠶微孢子蟲(chóng)可廣泛寄生于動(dòng)物，是經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)、魚(yú)類、兔類、皮毛動(dòng)物、嚙齒類及靈長(zhǎng)類的致命病原。目前在分子水平上對(duì)宿主與寄生物間相互關(guān)系還知之甚少。本試驗(yàn)采用屬于原生動(dòng)物環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)的動(dòng)物—蚯蚓作為被感染對(duì)象來(lái)進(jìn)行感染性試驗(yàn)，以求進(jìn)一步探索家蠶微孢子蟲(chóng)的感染宿主范圍以及感染致病機(jī)制。

１材料和方法

１．１試驗(yàn)材料

１．１．１家蠶微孢子蟲(chóng)家蠶微孢子蟲(chóng)材料由西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院家蠶病理實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，保存于重慶三峽學(xué)院生物系實(shí)驗(yàn)室。通過(guò)飼養(yǎng)無(wú)病家蠶，用添食方法接種家蠶微孢子蟲(chóng)入家蠶體內(nèi)進(jìn)行微孢子蟲(chóng)的擴(kuò)增，制成微孢子蟲(chóng)原液，濃度為１０８?jìng)€(gè)／ｍＬ。

１．１．２蚯蚓及飼料在魚(yú)餌店買回的大小均一的健康蚯蚓１５０條。蚯蚓是雜食性動(dòng)物，各種禽糞、畜糞、瓜果皮、菜葉、樹(shù)葉以及無(wú)毒的生活垃圾等都可作為它的飼料。這些飼料先進(jìn)行發(fā)酵，達(dá)到無(wú)臭味、無(wú)酸味、完全腐熟、外觀呈咖啡色后備用。

１．２試驗(yàn)器材

雙目生物顯微鏡；冰箱；燒杯若干；研缽；載玻片、蓋玻片若干；玻璃杯；油瓶培養(yǎng)器；吸管；洗瓶；解剖器等。

１．３試驗(yàn)方法

１．３．１微孢子蟲(chóng)的提純將接種家蠶微粒子孢子后患病的五齡家蠶整體研磨，紗布過(guò)濾，２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ粗提后，以差速離心法純化，調(diào)制為１０８?jìng)€(gè)／ｍＬ的微孢子蟲(chóng)孢子液［７］，放于４℃冰箱保存待用。

１．３．２微飽子蟲(chóng)的添食

１）蚯蚓的飼養(yǎng)。用打有小孔的潔凈的自制油瓶培養(yǎng)器盛一層疏松肥沃土壤，將蚯蚓放入其中，加入已經(jīng)發(fā)酵好的蚯蚓飼料，保持土壤濕潤(rùn)，觀察蚯蚓生長(zhǎng)狀況一周，無(wú)異常后，選擇生長(zhǎng)健壯的蚯蚓１５０只待用。

２）微孢子蟲(chóng)樣液濃度配制。對(duì)低溫保存的微孢子蟲(chóng)溶液進(jìn)行重懸，并進(jìn)行活化，活化后使用紅血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，用原樣濃度為１０８?jìng)€(gè)／ｍＬ的微孢子液配制微孢子蟲(chóng)稀釋液濃度為１０５、１０６、１０７個(gè)／ｍＬ各１０ｍＬ待用。

３）蚯蚓的分區(qū)飼養(yǎng)。按每種濃度設(shè)３個(gè)分區(qū)，另加一組空白對(duì)照，試驗(yàn)共分１０個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)分１５只蚯蚓，在相同的條件下飼養(yǎng)。

４）微孢子蟲(chóng)的添食。向９個(gè)試驗(yàn)區(qū)蚯蚓生活的土壤噴灑不同濃度的微孢子蟲(chóng)溶液２ ｍＬ，每天觀察蚯蚓生活情況，統(tǒng)計(jì)蚯蚓感染和死亡情況。

１．３．３鏡檢每天統(tǒng)計(jì)死亡蚯蚓的條數(shù)，并觀察蚯蚓死亡后的外形變化，再將死亡的蚯蚓用研缽研碎，用無(wú)菌去離子水制成溶液后取少量于光學(xué)顯微鏡下觀察是否存在微孢子蟲(chóng)。

１．３．４數(shù)據(jù)處理

死亡率計(jì)算，利用公式：

死亡率＝×１００％

對(duì)死亡率進(jìn)行校正。校正死亡率計(jì)算利用公式：

Ｍ＝×１００％

其中：Ｍ為校正死亡率（％），ｃ為對(duì)照組死亡率（％），ｔ為處理組死亡率（％）。

在數(shù)據(jù)處理中，先對(duì)每個(gè)小組的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，再將沒(méi)有大偏差的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)混合，而后進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。所有的數(shù)據(jù)分析均在ＥＸＣEＬ２００３中進(jìn)行。最后得到對(duì)應(yīng)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)等。

半致死濃度ＬＣ５０的計(jì)算：試驗(yàn)完畢后，清點(diǎn)各組死亡數(shù)并計(jì)算出死亡率（Ｐ），按改良寇氏法公式進(jìn)行計(jì)算：

ＬＣ５０＝log－１［Ｘｍ-ｉ（∑Ｐ-０．５）］

其中：Ｘｍ為最大劑量的對(duì)數(shù)值；ｉ為相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)值之差；Ｐ為各組動(dòng)物死亡率，用小數(shù)表示（如死亡率為８０％應(yīng)寫(xiě)成０．８０）；∑Ｐ為各組動(dòng)物死亡率之總和。

２結(jié)果與分析

２．１接種前期觀察結(jié)果

試飼養(yǎng)一周內(nèi)蚯蚓生活均完全正常，未見(jiàn)異常情況。

２．２試驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄與數(shù)據(jù)處理結(jié)果

２．２．１數(shù)據(jù)處理不同濃度家蠶微孢子蟲(chóng)添食蚯蚓后蚯蚓死亡率數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。

通過(guò)表1可以看出：

１）試驗(yàn)的前４ ｄ，蚯蚓死亡數(shù)逐漸增高。第五天開(kāi)始各組蚯蚓死亡的總數(shù)趨于穩(wěn)定，試驗(yàn)組蚯蚓死亡的數(shù)量接近蚯蚓總數(shù)，對(duì)照組也有個(gè)別蚯蚓死亡，但死亡的數(shù)量明顯小于試驗(yàn)組。其中濃度最高的試驗(yàn)組的蚯蚓死亡的數(shù)量最多，而且死亡最快。

２）試驗(yàn)組蚯蚓累計(jì)死亡率明顯高于對(duì)照組，試驗(yàn)組中所選３種濃度梯度均與蚯蚓累計(jì)死亡率成正比例關(guān)系，濃度越高蚯蚓累計(jì)死亡率越高，而且死亡越快。

３）３種濃度的第四天的校正死亡率均高于７５．０％，其中濃度為１０７個(gè)／ｍＬ的最高接種濃度下的致死作用最強(qiáng)，第四天時(shí)平均死亡率為９１％，校正死亡率也達(dá)８９％。

２．２．２添食家蠶微孢子蟲(chóng)后７ ｄ內(nèi)蚯蚓的校正死亡率從圖１可以看出，蚯蚓在前４ｄ死亡最快，死亡率與天數(shù)成線性關(guān)系，在第四天開(kāi)始校正死亡率趨于平穩(wěn)。同時(shí)各濃度下的蚯蚓校正死亡率與濃度成正比例關(guān)系，即高濃度的其校正死亡率也高，低濃度的其校正死亡率也低。

２．２．３半致死濃度計(jì)算結(jié)果經(jīng)計(jì)算，得到家蠶微孢子蟲(chóng)對(duì)蚯蚓的半致死濃度ＬＣ５０＝８．６×１０７個(gè)／ｍＬ。

３討論

此試驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的家蠶微孢子蟲(chóng)能夠引起環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)的蚯蚓感染并致其死亡。而且家蠶微孢子蟲(chóng)對(duì)蚯蚓的感染作用時(shí)間較短，在短期內(nèi)具有較強(qiáng)的致死作用。后續(xù)的鏡檢分析表明家蠶微孢子蟲(chóng)在蚯蚓體內(nèi)的感染率也較高。雖然在１０７個(gè)／ｍＬ的接種濃度下致死作用較好，然而最適添食濃度的選擇尚需進(jìn)一步的試驗(yàn)摸索。

本試驗(yàn)中，蚯蚓在添食家蠶微孢子蟲(chóng)后明顯表現(xiàn)出活動(dòng)緩慢，挑起時(shí)卷曲程度不大，形態(tài)成癱軟狀，在觀察的后期腸腔內(nèi)泥沙少等現(xiàn)象，這是與蚯蚓的取食量有關(guān)，說(shuō)明蚯蚓消化能力減弱，微孢子蟲(chóng)感染了蚯蚓的消化系統(tǒng)。觀察死亡蚯蚓的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)有的蚯蚓全身出現(xiàn)痙攣狀的結(jié)節(jié)，體色變白，體壁破裂或體節(jié)斷裂，這種現(xiàn)象說(shuō)明蚯蚓是因不良環(huán)境條件的影響而造成的死亡。對(duì)照組的飼料由于后期部分酸化后被蚯蚓取食酸性食物而致胃酸過(guò)多導(dǎo)致部分死亡，這是對(duì)照組蚯蚓死亡的主要原因。

本試驗(yàn)的蚯蚓體內(nèi)微孢子蟲(chóng)孢子檢測(cè)說(shuō)明一定濃度的家蠶微孢子蟲(chóng)對(duì)環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)的蚯蚓有一定的感染和致死能力。本試驗(yàn)結(jié)果為后期探索家蠶微孢子蟲(chóng)的病蟲(chóng)傳播提供了可能性說(shuō)明。

在以往報(bào)道的研究中家蠶微孢子蟲(chóng)不僅能感染家蠶，還能感染草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞、小菜蛾、菜青蟲(chóng)、野生型及突變型果蠅等，這些都是變態(tài)型生長(zhǎng)發(fā)育的昆蟲(chóng)。本試驗(yàn)證實(shí)了家蠶微孢子蟲(chóng)能夠跨門(mén)感染環(huán)節(jié)動(dòng)物類的蚯蚓，甚至致其死亡。本次試驗(yàn)為后期研究家蠶微孢子蟲(chóng)的感染宿主范圍和感染機(jī)制提供了一定參考。

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