浙貝母生物堿微波輔助法提取工藝研究

摘要：分別采用單因素和正交分析法研究了不同參數(shù)對微波輔助法和傳統(tǒng)方法（搖床浸提法）提取浙貝母生物堿效果的影響。結果發(fā)現(xiàn)采用微波輔助法提取率為０．０１１ ７％，比傳統(tǒng)法略高但不顯著；還確定了微波輔助法最佳提取條件是料液比為１∶３０（ｍ∶Ｖ，ｇ∶ｍＬ），功率為３３８ Ｗ，提取溶媒為８０％乙醇，提取時間為１５０ ｓ。

關鍵詞：浙貝母；生物堿；微波輔助法提取

中圖分類號：Ｒ２８４．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）03－0566-04

Microwave-assisted Extraction Technology of Alkaloids from Fritillaria thunbergii Miq.

ＷＡＮＧ Ｚｈｏｎｇ－ｈｕａ１，WANG Cheng-cheng1，ＣＨＥＮ Ｙｕ１，ＦＡＮＧ Ｚｈｅｎ－ｈｕａ１，ＳＨＥＮ Ｘｉａｏ－ｘｉａ２

（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｗａｎｌｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｉｎｇｂｏ ３１５１００，Zhejiang，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００２３，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｙ ｓｈａｋｅｒ （ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ） ａｎｄ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｆ． ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： ８０％ ｅｔｈａｎｏｌ ａｓ ｔｈｅ ｓｏｌｖｅｎｔ， ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ ｒａｔｉｏ ａｔ １∶３０（ｍ∶Ｖ，ｇ∶ｍＬ）， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ １５０ｓ， ａｎｄ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｐｏｗｅｒ ３３８W． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ａｌｋａｌｏｉｄ ｗａｓ ０．０１１ ７％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｆｒｉｔｉｌｌａｒｉａ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ； ａｌｋａｌｏｉｄ； ｍｉｃｒｏｗａｖｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

浙貝母學名是Ｆｒｉｔｉｌｌａｒｉａ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ Ｍｉｑ．，為百合科貝母屬的一種多年生草本植物，是“浙八味”中最主要的中藥之一，其鱗莖具有清熱化痰、止咳、開郁、散結之功，用于熱痰咳嗽、肺癰、乳癰、痰核等多種病癥的治療［１］。

浙貝母化學成分的研究始于１９２３年，我國貝母屬化學成分的研究也是這時開始的。當時袁淑范等從浙貝母中提取到一種白色針晶，熔點為２６８℃，與德國產的Ｆｒｉｔｉｌｌａｒｉａ ｉｍｐｅｒｉａｌｉｓ Ｌｉｎｎ．中得到的帝貝靈Ｇ３５Ｈ６００４Ｎ不同，后經純化證明其為一種生物堿。此后化學工作者又分離出了幾種生物堿。到20世紀60年代末，從浙貝母中共分離得到十幾種生物堿，但限于當時的技術條件，僅確定了貝母甲素（Ｐｅｉｍｉｎｅ）、貝母乙素（Ｐｅｉｍｉｎｉｎｅ）和貝母辛（Ｐｅｉｍｉｓｓｉｎｅ）等的結構。20世紀80年代從浙貝母中又分離出Ｉｓｏｐｅｉｍｉｎｉｎｅ、貝母乙素的兩個異構體和貝母甲素、貝母乙素的氮氧化物，以及西藜蘆生物堿［２］。

生物堿大多具有天然的生理活性，是多種中草藥及藥用植物的有效成分［３，４］，對生物堿提取、分離和純化的研究，具有非常重要的意義。一方面，更多的具有獨特藥用價值的生物堿不斷被發(fā)現(xiàn)和應用；另一方面，伴隨著科學技術的不斷進步和發(fā)展，各種高效的、方便快捷的方法不斷涌現(xiàn)，各種生物堿的獨特效能不斷被發(fā)掘并廣泛應用。根據生物堿的性質，選擇具體的提取、分離和純化方法，靈活運用各種提取、分離和純化的原理，不斷探索新的提取、純化的最佳條件，生物堿的提取分離技術將會得到更加深入的研究和開發(fā)。本文采用微波輔助提取法對浙貝母生物堿提取工藝進行了研究，建立了適宜的提取條件。

１材料與方法

１．１材料

浙貝母鱗莖采自浙江省寧波市鄞州區(qū)樟村貝母基地，由寧波市鄞州區(qū)章水鎮(zhèn)農技推廣中心提供；用去離子水漂洗數(shù)次，８０℃強風烘干，萬能高速粉碎機粉碎，過６０目篩，得干燥的浙貝母粉末，備用。標準對照品浙貝甲素購自浙江省藥品檢驗所。

１．２方法

工藝流程為浙貝母→選擇、烘干→粉碎→過篩→生物堿提取，其中分別用傳統(tǒng)方法（搖床浸提法）和微波輔助法→過濾→粗液蒸干→２％鹽酸溶解→濃氨水調節(jié)ｐＨ值→氯仿萃取３次→氯仿蒸干→紫外可見分光光度計測ＯＤ值→比較得出最優(yōu)工藝條件。

１．２．１對照溶液的制備精密稱?。保?ｍｇ浙貝甲素于５０ ｍＬ容量瓶中，用氯仿溶解并定容至50 ｍＬ，得３６ μｇ／ｍＬ的浙貝甲素標準溶液。

１．２．２標準曲線的繪制精密吸取浙貝甲素標準溶液０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ ｍＬ分別置于６只

１００ ｍＬ的具塞錐形瓶中，分別加入９．５、９．０、８．５、８．０、７．５、７．０ ｍＬ的氯仿，再分別加入５．０ ｍＬ去離子水和２．０ ｍＬ、ｐＨ值為４．５的０．０４％溴甲酚綠緩沖液，密塞，劇烈振搖３ ｍｉｎ后，移入６０ ｍＬ分液漏斗中，靜置０．５ ｈ。?。?ｍＬ下層氯仿液置于已加入了１．０ ｍＬ的０．００１ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鉀的無水乙醇溶液的具塞刻度試管中，搖勻，隨行空白對照。最后，在６１８ ｎｍ處測定吸光值，并用最小二乘法，以吸光值為縱坐標，溶液濃度為橫坐標，即可得回歸方程［５］。最終得到的回歸方程為ｙ＝０．００４ １ｘ＋０．００９ ２，相關系數(shù)ｒ＝０．９９２ ７。

１．２．３傳統(tǒng)方法（搖床浸提法）稱?。玻?ｇ浙貝母粉末，置于１００ ｍＬ具塞錐形瓶中，加入４０ ｍＬ ８０％乙醇，搖床振蕩提?。玻?ｈ，轉速為１３０ ｒ／ｍｉｎ，用中速定性濾紙（杭州新化紙業(yè)有限公司）進行過濾，得到粗液，加熱使醇提液揮發(fā)蒸干，再加入２０ ｍＬ ２％的鹽酸，溶解，過濾，濾液用濃氨水調ｐＨ值至１１．０，然后用氯仿萃?。炒?，每次１０ ｍＬ，萃取液蒸干，得到浸膏，最后用氯仿定容至１ ｍＬ。再用分光光度計在６１８ ｎｍ下測其吸光值，按照標準曲線得到的回歸方程換算出生物堿的含量［６］。

１．２．４微波輔助法稱?。玻?ｇ浙貝母粉末，置于１００ ｍＬ的具塞錐形瓶中，加入４０ ｍＬ ８０％乙醇，按照預先設計好的提取條件（時間、功率等）進行微波輔助提取后，結合搖床冷浸提取，將得到的粗提液，用中速定性濾紙進行過濾，濾液用Ｅ２５型旋轉蒸發(fā)儀（上海青浦瀘西儀器廠）減壓濃縮，醇提物用２％鹽酸溶解、過濾，濾液用濃氨水調節(jié)ｐＨ值至１１．０，然后用氯仿萃取３次，每次２０ ｍＬ，萃取液經減壓濃縮后，稱取浸膏重量。最后用氯仿定容至１０ ｍＬ。再用分光光度計在６１８ ｎｍ下測定吸光值，按照標準曲線得到的回歸方程計算出生物堿的含量。

２結果與分析

２．１單因素試驗

２．１．１不同溶媒對生物堿質量濃度的影響采用功率３３８ Ｗ，料液比１∶３０，提取時間１５０ ｓ，用６０％、７０％、８０％、９0％乙醇和１００％甲醇的不同溶媒微波輔助法提取，結果見圖１。由圖１可看出，隨著乙醇濃度的升高，提取的生物堿質量濃度隨之升高，但當乙醇濃度超過最適濃度８０％時，提取的質量濃度反而降低。100%甲醇的提取率雖然比較高，但也不及８０％的乙醇。究其原因是當濃度升高時，溶入有機溶劑的生物堿量也就越多，但當濃度升高至超過最適濃度時，其他物質也被提取出來，反而影響了總生物堿的提取率，使得提取率隨著濃度的升高反而下降。由此認為，微波輔助法提取浙貝母生物堿的溶媒采用８０％乙醇為宜。

２．１．２不同提取時間對生物堿質量濃度的影響采用功率３３８ Ｗ，溶媒為８０％乙醇，料液比１∶３０，在不同的提取時間１００、１２５、１５０、１７５、２００ ｓ下微波輔助提取，結果見圖２。由圖２可知，隨著提取時間的延長，提取的生物堿的質量濃度也隨之升高，但當時間超過１５０ ｓ時，提取的質量濃度反而有所降低。因為當時間延長時，溶入有機溶劑的生物堿的量也隨之增多，但當時間超過最適提取時間時，生物堿會少量的溶于提取劑中，反而影響了總生物堿的提取率，使得提取率隨著時間的延長而下降。由此認為，浙貝母生物堿微波輔助提取法的最適提取時間為１５０ ｓ。

２．１．３不同料液比對生物堿質量濃度的影響采用功率３３８ Ｗ，溶媒為８０％的乙醇，提取時間為１５０ ｓ，分別用１∶１０、１∶２０、１∶３０、１∶４０、１∶５０的料液比進行微波輔助提取，結果如圖３所示。由圖３可知，隨著溶媒量的增加，提取的生物堿的質量濃度也隨之升高，但當溶媒量超過最適溶媒量（料液比１∶３０）時，提取的生物堿的質量濃度反而降低。這是由于當溶媒量升高時，溶入有機溶劑的生物堿量也就越多，但當溶媒量升高至超過最適溶媒量時，其他物質也被提取出來，反而影響了總生物堿的提取率，使得提取率隨著溶媒量的升高反而下降。由此認為，浙貝母生物堿微波輔助提取法的最適提取料液比為１∶３０。

２．１．４不同功率對生物堿質量濃度的影響采用８０％乙醇作為溶媒，提取時間為１５０ ｓ，料液比１∶３０，分別在１９８、２６８、３３８、４０８、４７８ Ｗ的微波功率下提取，結果見圖４。由圖４可知，隨著提取功率的加大，提取的生物堿的質量濃度也隨之升高，但當功率超過３３８ Ｗ時，提取的生物堿的質量濃度反而有所降低。這是因為當功率加大時，溶入有機溶劑的生物堿量也隨之增多，但當功率超過最適提取功率時，微波會破壞生物堿的成分，或者使其他物質溶到提取劑中，這樣反而影響了總生物堿的提取率，使得提取率隨著提取功率的加大而下降。由此認為浙貝母生物堿微波輔助提取法的最適提取功率為３３８ Ｗ。

２．２微波輔助提取法的正交試驗

依據表１的因素與水平，采用微波輔助提取法提取浙貝母鱗莖生物堿，并測定其吸光值，再依照標準曲線得浙貝母總生物堿的濃度，并以此基礎得出微波輔助提取法提取浙貝母生物堿的最優(yōu)條件。結果見表２。

正交試驗結果表明，各影響因素極差值分別為ＲＡ＝２５．０８，ＲＢ＝１８．３６，ＲＣ＝６５．７６，ＲＤ＝１９．７８。故影響貝母生物堿提取率的因素關系為Ｃ（料液比）＞Ａ（溶媒）＞Ｄ（提取時間）＞Ｂ（功率），其中Ｃ（料液比）對提取率影響最大，Ａ（溶媒）對提取率影響次之，Ｂ（功率）對提取率影響相對較少。這與高岐等［７］提取葵花子仁中的綠原酸的條件類似。

３結論與討論

３．１兩種方法最優(yōu)提取條件下的比較

本試驗利用傳統(tǒng)方法（搖床浸提法）提取浙貝母中生物堿的提取率為０．０１０ ２％，微波輔助法在最佳提取條件下浙貝母生物堿的提取率為０．０１１ ７％。無論是傳統(tǒng)方法還是微波輔助提取法，浙貝母生物堿提取的量都不是很多，但微波輔助提取法提取生物堿的量要略多于傳統(tǒng)方法。

３．２浙貝母生物堿微波輔助法最優(yōu)提取工藝

１）本試驗結果表明，浙貝母生物堿微波輔助法提取工藝的最佳條件為８０％乙醇為溶媒、１∶３０料液比、３３８ Ｗ微波輸出功率和微波處理時間１５０ ｓ。

２）與傳統(tǒng)方法（搖床浸提法）相比，微波輔助提取法大大縮短了提取時間，提高了浙貝母生物堿的提取率，這是因為微波輔助提取法是利用不同結構的物質在微波場中吸收微波能力的差異，使物質中的某些區(qū)域或提取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使被提取物從物質或體系中分離，進入介電常數(shù)較小、微波吸收能力相對差的提取劑中［８］。

３）本試驗還發(fā)現(xiàn)，微波輔助法提取浙貝母生物堿的另一個優(yōu)點是減少了溶媒的用量，在提高效率的同時，更節(jié)約了提取成本。這在當今注重效率，注重利潤的工業(yè)社會來說，是一個很大的優(yōu)勢。

鑒于微波輔助提取法具有較高的選擇性、提取率高、提取速度快、溶劑用量少、安全、節(jié)能等優(yōu)點，建議將其引入到浙貝母生物堿的工業(yè)提取中。當然，大規(guī)模工業(yè)化提取工藝需要進一步的研究。

參考文獻：

［１］ 陳華珍，陳建偉． 浙貝母的品質研究［Ｊ］． 現(xiàn)代中藥研究與實踐，２００３，１７（２）：１３－１６．

［２］ 高文遠，李志亮，肖培根． 常用中藥浙貝母的研究進展［Ｊ］． 中國中藥雜志，１９９６，２１（６）：３２３－３２５．

［３］ 耿敬章，徐福星． 生物堿的生理功能及其提取分離研究進展［Ｊ］． 飲料工業(yè)，２００７，１０（１０）：１－４．

［４］ 周文華，楊輝榮． 生物堿提取和分離方法的研究新進展［Ｊ］． 當代化工，２００３，３２（２）：１１１－１１４．

［５］ 李松林，李萍，卞云云，等． 浙貝母總生物堿的月積累動態(tài)的研究［Ｊ］． 中國中藥雜志，１９９９，１０（２４）：５９２－５９４．

［６］ 丁春霞，屠善軍，應敏． 浙貝母中生物堿提取方法以及條件的優(yōu)化［Ｊ］． 現(xiàn)代中藥研究與實踐，２００４，８（２）：２８－３０．

［７］ 高岐，竇憲民． 微波法提取葵花籽仁中的綠原酸［Ｊ］． 中國油脂，２００９，３４（６）：６８－６９．

［８］ 劉梅，米瑩． 微波提取在中藥領域的應用進展［Ｊ］． 天津藥學，２００９，２１（５）：６２－６４．