PGN激活BV2內(nèi)吞Aβ寡聚體后對PC12的影響

姜 新 謝 明 白麗娟 陳曉虹 馬恩龍

(1.遼寧省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110016;2.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，沈陽 110016)

小膠質(zhì)細胞在腦部炎性反應(yīng)、腦缺血、阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變時被激活，發(fā)揮損傷和修復(fù)的雙重作用，AD中小膠質(zhì)細胞作用也存在爭議，不同試驗結(jié)果不完全一致，甚至相反［1-7］。本研究用肽聚糖(peptidoglycan，PGN)、β 淀粉樣蛋白(amyloid protein β，Aβ)1～42寡聚體處理BV2細胞后通過篩網(wǎng)與PC12細胞(代替神經(jīng)元)共育，篩網(wǎng)允許二者分泌的活性物質(zhì)自由通過，使細胞間彼此影響，但細胞不能通過，應(yīng)用此模型，探討PGN激活BV2內(nèi)吞Aβ1～42寡聚體后對PC12的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1)BV2與PC12細胞株:購自中國科學(xué)院細胞生物研究所，細胞株來源于德國DSMZ(German collection of microorganisms and cell cultures)，分別采集于小鼠腦小膠質(zhì)細胞瘤和小鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤。

2)主要試劑和儀器:胎牛血清(美國GIBCO公司)，1640培養(yǎng)基(美國 GIBCO 公司)，Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)基(美國GIBCO公司);Aβ1～42(美國Sigma公司);無酚紅F12培養(yǎng)液(美國GIBCO公司);六氟丙醇(hexafluoro isopropyl，HFIP)(美國Sigma公司);PGN(美國Sigma公司);噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)(上海華舜生物工程有限公司);細胞轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)(美國 BD Falcon公司);抗 tau(pS396)抗體(美國Sigma公司);BCA蛋白定量試劑盒(美國PIERCA公司);流式細胞儀(德國Leica公司);96孔酶標儀(瑞士Sunrise Tecon公司)。

1.2 方法

1)Aβ1～42寡聚體的制備:① 制備 Aβ1～42寡聚體:22.2 μL 冷卻的 HFIP 加 1 mg Aβ1～42室溫孵育 60 min，將肽-HFIP溶液放置冰上10 min后，使HFIP在室溫下?lián)]發(fā)，過夜。置于真空冷凍干燥機內(nèi)60 min，除去所有HFIP，分裝后于 －80℃保存。② 冰上用100%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配 5 mmol/L Aβ:4.44 μL 新鮮脫水 DMSO 加 0.1 mg 多肽。加439.56 μL無酚紅F12培養(yǎng)液稀釋至終濃度為50 μmol/L，4℃孵育24 h。4℃ 14 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至新管，即為寡聚體。

2)細胞培養(yǎng):① PC12細胞培養(yǎng):PC12細胞置于1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 g/L鏈霉素)，37℃，5%CO2及飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待單層培養(yǎng)細胞生長至80%匯合后傳代培養(yǎng)。② BV2細胞培養(yǎng):BV2細胞置于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，37℃，5%CO2及飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待單層培養(yǎng)細胞生長至80%匯合后傳代培養(yǎng)。

3)細胞共育過程:① 分組:A組為BV2+PC12;B組為Aβ+PC12;C組為Aβ+BV2+PC12;D組為PGN+BV2+PC12;E組為PGN+Aβ+BV2+PC12。② 細胞共育過程:PGN、Aβ1～42寡聚體實驗前三天BV2細胞以1×104/孔在轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)上培養(yǎng);實驗前一天將PC12細胞以1.5×105個/孔種植于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng);實驗前一天分別將 Aβ1～42寡聚體(1 μmol/L)、PGN(20 μg/mL)加入 C、D 組 BV2 細胞，PGN(20 μg/mL)加入E組 BV2細胞預(yù)孵育1 h后再加 Aβ1～42寡聚體(1 μmol/L);上述各組均孵育24 h;除去PC12細胞培養(yǎng)液，將生長有BV2細胞的轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)及培養(yǎng)液同時移入PC12細胞24孔培養(yǎng)板中與PC12細胞共育24 h。

4)PC12細胞抑制率:采用MTT方法檢測，棄去PC12上清液，設(shè)置3個重復(fù)孔和無細胞培養(yǎng)基對照，加入MTT(終濃度0.5 mg/mL)，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，細胞內(nèi)見到藍色沉淀后，小心吸出培養(yǎng)上清液，每孔加入100 μL DMSO，使結(jié)晶物充分溶解，經(jīng)全自動酶標儀于490 nm處檢測OD值。

5)各組PC12細胞tau(pS396)蛋白表達情況:(1)樣品的制備:將蛋白裂解緩沖液(預(yù)冷至0℃)加入經(jīng)過漂洗的PC12細胞中，靜置20 min;用細胞刮棒收集細胞，連同裂解緩沖液一起轉(zhuǎn)移至經(jīng)過冷卻的微量離心管中;于4℃以12 000 r/min離心2 min;將上清液轉(zhuǎn)移至另一個微量離心管中，保存于－80℃待用。(2)蛋白定量分析BCA(bicinchonic acid asay):A、B、C試劑按照 50∶50∶2比例混合后配制為工作液。梯度稀釋BCA標準品，分別吸取待測樣品及梯度蛋白到微孔板對應(yīng)孔中，稀釋混勻后在37℃孵育30 min。以96孔酶標儀于570 nm處檢測OD值，經(jīng)數(shù)據(jù)處理后得出各樣本蛋白濃度。(3)蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析:① 制備凝膠;② 點樣，每孔加樣25 μL 2 mg/mL樣本;③ 電泳，濃縮膠80 V，分離膠120 V;④轉(zhuǎn)膜:使用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)于4℃ 50 V，30 mA轉(zhuǎn)移2 h;⑤檢測:取出膜，封閉1～2 h，在室溫下將tau(pS396)及tau一抗1∶1 000比例稀釋于封閉緩沖液中，4℃過夜。室溫下將二抗按1∶4 000比例稀釋，孵育60 min;化學(xué)發(fā)光顯色，計算機掃描分析。

6)流式細胞儀對細胞周期的檢測:收集細胞，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)清洗3次;1 000 r/min離心10 min，收集細胞沉淀;細胞沉淀中加入70%乙醇2 mL，－20℃固定過夜;1 000 r/min離心10 min，收集細胞沉淀;加入PI染色液1 mL;上機，每組均設(shè)3例標本。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PC12 的生長

PC12細胞株培養(yǎng)初期，呈成簇狀、多角形半懸浮生長。傳代1代以上細胞貼壁生長，部分細胞呈分化趨勢，有偽足伸出，有的偽足較長，甚至連接在一起，細胞傾向于呈小簇狀生長(圖1)。

2.2 PC12細胞抑制率

PGN激活BV2細胞內(nèi)吞Aβ增多后，與對照A組相比，對PC12細胞增生有抑制作用(P＜0.05)。詳見表1，圖2。細胞抑制率%=〔1－(OD實驗組/OD對照組)〕×100%。

圖1 PC12的生長Fig.1 The growth of PC12(200×)

表1 MTT方法檢測PC12細胞抑制率Tab.1 The results of PC12 cell inhibition with MTT method()n=3

表1 MTT方法檢測PC12細胞抑制率Tab.1 The results of PC12 cell inhibition with MTT method()n=3

Blank:PC12;A:BV2+PC12;B:Aβ +PC12;C:Aβ +BV2+PC12;D:PGN+BV2+PC12;E:PGN+Aβ +BV2+PC12;n=3;*P ＜0.05 vs bland;△ P ＜0.05，group A、B、C、D vs group E;▼ P ＜0.05，group B、C、D vs group A;#P ＜0.05 group C vs group B.

Item Blank A B C D E OD value 0.811 ±0.005 0.752 ±0.006＊△ 0.557 ±0.004＊△▼ 0.468 ±0.007＊△▼# 0.508 ±0.005＊△▼ 0.289 ±0.007*

圖2 各組PC12細胞抑制率比較Fig.2 Comparison of PC12 cell inhibition in each group

2.3 PC12細胞tau(pS396)、tau蛋白表達情況

以Western blotting檢測可見E組tau(pS396)表達量高于其他組，而總tau表達量在各組間未發(fā)現(xiàn)明顯差異(圖3)。計算各組磷酸化tau與總tau比值以確定tau激活程度，結(jié)果詳見表2。E組tau磷酸化激活程度同各組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，提示PGN激活BV2細胞內(nèi)吞Aβ后，加重PC12細胞的損傷。

2.4 流式細胞儀檢測PC12細胞凋亡

圖3 Western blotting檢測PC12細胞tau(pS396)、tauFig.3 tau(pS396)and tau of PC12 cells determined by Western blotting

結(jié)果顯示，E組PC12細胞凋亡率與各組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，PGN激活BV2細胞內(nèi)吞Aβ后，加重PC12細胞的凋亡，結(jié)果詳見圖4，圖5。

3 討論

小膠質(zhì)細胞被認為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中最有代表性的免疫細胞［8］，它可在CNS病變時被激活，主要通過分泌或促進神經(jīng)保護因子的表達［9-12］發(fā)揮神經(jīng)保護作用，通過自身分泌的自由基或促進促炎因子釋放而發(fā)揮其神經(jīng)毒性作［13-14］。小膠質(zhì)細胞參與AD炎性反應(yīng)是一把雙刃劍［15］。在前炎性介質(zhì)及神經(jīng)毒性物質(zhì)的刺激下小膠用質(zhì)細胞被激活，可以分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子或神經(jīng)毒性因子，對神經(jīng)元細胞保護或損傷起直接作用，小膠質(zhì)細胞被認為不僅能促進Aβ斑塊形成同時在不同實驗條件下能清除Aβ。

表2 各組tau(pS396)/總tau比值列表Tab.2 The list of the ratio of each value of tau(pS396)divided by the total value of tau()n=3

表2 各組tau(pS396)/總tau比值列表Tab.2 The list of the ratio of each value of tau(pS396)divided by the total value of tau()n=3

A:BV2+PC12;B:Aβ +PC12;C:Aβ +BV2+PC12;D:PGN+BV2+PC12;E:PGN+Aβ+BV2+PC12;n=3;*P ＜0.05 vs group E;△ P ＜0.05，group D、B、C vs group A;#P ＜0.05，group C vs group B.

Item A B C D E tau(pS396)/〔 tau+tau(pS396)〕 11.257 ±0.296* 25.703 ±0.280＊△#35.468 ±1.263＊△ 31.933 ±0.719＊△50.283 ±1.851

圖4 流式細胞儀檢測各組PC12細胞凋亡Fig.4 The apoptosis of PC12 cells determined by flow cytometry

圖5 各組PC12細胞凋亡檢測結(jié)果Fig.5 The result of the apoptosis of PC12 cells of each group

PC12細胞來自鼠腎上腺素嗜鉻細胞瘤細胞系，被廣泛用作研究神經(jīng)細胞的模型。細胞篩網(wǎng)網(wǎng)孔徑8 μm，篩網(wǎng)上下細胞可通過分泌的活性物質(zhì)相互影響。本研究利用它將BV2細胞與PC12細胞共育，既部分模仿體內(nèi)環(huán)境，又不影響對PC12細胞進行各項指標檢測，較目前采用較多的只轉(zhuǎn)移培養(yǎng)上清或直接兩種細胞共育培養(yǎng)的方法有明顯優(yōu)勢。既往研究觀察前炎性介質(zhì)對小膠質(zhì)細胞的雙重作用［15-20］少有神經(jīng)元共育的報道。本研究利用細胞轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)構(gòu)建BV2細胞與PC12細胞共育體系，并用PGN、Aβ1～42寡聚體分別作用或共同作用于BV2細胞及PC12細胞，制作體外AD模型，探討PGN激活BV2內(nèi)吞Aβ42寡聚體后對PC12細胞的影響，是比較接近體內(nèi)狀態(tài)的細胞培養(yǎng)模型。

經(jīng)Aβ1～42寡聚體處理后 PC12細胞，突起減少，PC12細胞抑制率增加，tau蛋白異常磷酸化水平增加，凋亡增多。Tau蛋白是神經(jīng)元微管蛋白的組成成分，其異常磷酸化后導(dǎo)致微管形成障礙，影響神經(jīng)元有絲分裂和營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)裙δ?，引起神?jīng)元凋亡［15］。上述結(jié)果提示 Aβ1～42寡聚體具有神經(jīng)毒性，可引起神經(jīng)元損傷。

PGN 激活 BV2 內(nèi)吞 Aβ1～42后，加重 Aβ1～42引起PC12的抑制率，tau蛋白異常磷酸化水平，細胞凋亡的增多。提示PGN激活BV2細胞可引起PC12細胞損傷，BV2細胞放大β淀粉樣蛋白對PC12細胞損傷，小膠質(zhì)細胞在AD中促進損傷，加重病情作用。PGN與Aβ1～42寡聚體共同作用于BV2細胞后，增加 BV2細胞內(nèi)吞Aβ1～42寡聚體后IL-1 β分泌增多，明顯加重對PC12細胞的損傷，加速tau蛋白異常磷酸化，促進神經(jīng)元凋亡。說明前炎性介質(zhì)刺激小膠質(zhì)細胞后，表現(xiàn)出其雙重性，既增加其內(nèi)吞Aβ清除Aβ的能力，又促進其分泌炎性介質(zhì)的能力，最終平衡傾向于損傷作用，結(jié)果引起神經(jīng)元損傷。本研究結(jié)果與其他研究［15］有相似之處，炎性介質(zhì)腫瘤壞死因子α刺激小膠質(zhì)細胞，降低清道夫受體A(scavenger receptor A，SRA)、CD36的表達，減少對Aβ內(nèi)吞，提示小膠質(zhì)細胞分泌的炎性介質(zhì)反過來促進Aβ產(chǎn)物形成，降低Aβ清除，增加Aβ積累，加速神經(jīng)變性進展。綜上所述，在AD的發(fā)病機制中，小膠質(zhì)細胞起到促進神經(jīng)元損傷、死亡，促使AD發(fā)生發(fā)展，前炎性介質(zhì)對小膠質(zhì)細胞激活促使其雙重性傾向于損傷作用，提示將來對AD抗炎治療要考慮其雙重功能。

［1］Guillozet A L，Weintraub S，Mash D C，et al.Neurofibrillary tangles，amyloid，and memory in aging and mild cognitive impairment［J］.Arch Neurol，2003，60(5):729-736.

［2］DeKosky S T.Neurobiology and molecular biology of Alzheimer’s disease［J］.Rev Neurol，2002，35(8):752-760.

［3］Hardy J，Selkoe D J.The amyloid hypothesis of Alzeimer’s disese:progress and problems on the road to therapeutics［J］.Science，2002，297(5580):353-356.

［4］Lorenzo A，Yankner B A.Beta-amyloid neurotoxicity requires fibeil formation and inhibited by congo red［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91(25):12243-12247.

［5］Klyubin I，Walsh D M，Lemer C A，et al.Amyloid β peotein immunotherapy neutralizes A-beta oligomers that disrupt synaptic plasticity in vivo［J］.Nat Med，2005，11(5):556-561.

［6］Cleary J P，Walsh D M，Hofmeister J J，et al.Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function［J］.Nat Neurosci，2005，8(1):79-84.

［7］Gong Y，Chang L，Viola K L，et al.Alzheimer’s diseaseaffected brain:presence of oligmeric A-beta ligands(ASSLs)suggests a molecular basis for reversible memory loss［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(18):10417-10422.

［8］Hauwel M，F(xiàn)uron E，Canova C，et al.Innate(inherent)control of brain infection，brain inflammation and stromal ependymal cells［J］.Brain Res Brain Rev，2005，48(2):220-233.

［9］Neumann J，Gunzer M，Gutzeit H O，et al.Microglia provide neuroprotection after ischemia［J］.FASEB J，2006，20(6):714-716.

［10］Noda M，Kettenmann H，Wada K.Anti-inflammatoryeffects of kinins via microglia in the central nervous system［J］.Biol Chem，2006，387(2):167-171.

［11］Battista D，F(xiàn)errari C C，Gage F H，et al.Neurogenic niche modulation by activated microglia:transforming growth factor beta increase neurogenesis in the adault dentate gyrus［J］.Eur J Neurosci，2006，23(1):83-93.

［12］Minghetti L，Levi G.Microglia as effector cells in brain damage and repair:focus on prostanoid and nitric oxide［J］.Prog Neurobiol，1998，54(1):99-125.

［13］Clark A K，Gentry C，Bradbury E J，et al.Role of spinal microglia in rat models of peripheral nerve injury and inflammation［J］.Eur J Pain，2007，11(2):223-230.

［14］Méme W，Calvo C F，F(xiàn)roger N，et al.Proinflammatory cytokines released from microglia inhibit gap junctions in astrocytes:potentiation by beta-amyloid［J］.FASEB J，2006，20(3):494-496.

［15］Hickman S M，Allison E K，EI Khoury J.Microglial dysfunction and defective β-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer’s disease mice［J］.J Neurosci，2008，28(33):8354-8360.

［16］Chen K，Iribarren P，Hu J，et al.Activation of Toll-like receptor 2 on microglia promotes cell uptake of Alzheimer disease-associated amyloid beta peptide［J］.J Biol Chem，2006，281(6):3651-3659.

［17］Cordle A，Landreth G.3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors attenuate beta-amyloid-induced microglial inflammatory responses［J］.J Neurosci，2005，25(2):299-307.

［18］Jiao J，Xue B，Zhang L，et al.Triptolide inhibits amyloidbeta1-42-induced TNF-alpha and IL-1 beta production in cultured rat microglia［J］.J Neuroimmunol，2008，205(1-2):32-36.

［19］Jana M，Palencia C A，Pahan K.Fibrillar amyloid-beta peptides activate microglia via TLR2:implications for Alzheimer’s disease［J］.J Immunol，2008，181(10):7254-7262.

［20］Wikén M，Grunewald J，Eklund A，et al.Higher monocyte expression of TLR2 and TLR4，and enhanced pro-inflammatory synergy of TLR2 with NOD2 stimulation in sarcoidosis［J］.J Clin Immunol，2009，29(1):78-89.