尼可地爾預(yù)處理保存大鼠離體心臟的實(shí)驗(yàn)研究

張國(guó)彬 劉亞楠 張 宇

(1.河北聯(lián)合大學(xué)研究生學(xué)院，唐山 063000;2.河北聯(lián)合大學(xué)免疫學(xué)教研室，唐山 063000;3.華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸心外科，唐山 063000)

離體心臟的保存效果很大程度上決定心臟移植的成功與否［1］，目前主要通過(guò)改良心臟保存液的成分來(lái)延長(zhǎng)心臟保存時(shí)間［2-4］。有研究［5-7］表明缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IP)能顯著增強(qiáng)心臟對(duì)缺血的耐受性，但它是一種損傷性的預(yù)適應(yīng)。藥物預(yù)處理［8-11］(pharmacological preconditioning)安全有效，通過(guò)藥物激發(fā)或模擬機(jī)體內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制起作用。研究［12］表明七氟烷預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用可能與HSP70表達(dá)有關(guān)。本研究旨在探討非選擇性KATP通道開(kāi)放劑尼可地爾預(yù)處理誘導(dǎo)心肌細(xì)胞HSP70表達(dá)的改變，從而揭示離體供心的可能保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取24只成年SD雄性大鼠，體質(zhì)量250～350 g，購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(冀)2005-0038〕，溫度22℃，濕度50%飼養(yǎng)。12 h光照/黑暗，自由攝食進(jìn)水。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品和試劑

尼可地爾購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，丙二醛(malonaldehyde，MDA)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，兔多克隆HSP70一抗、生物素化山羊抗兔IgG二抗、SP-9000免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 St-Thomas心肌保存液配方

Component Concentration/(mmol·L －1)__NaCl 100.0 NaHCO3 10.0 KCl 16.0 MgCl2·6H2 O 16.0 CaCl2·2H2 O 1.2______pH___________________________________________________7.8±0.02

1.4 動(dòng)物分組及標(biāo)本取材

大鼠采用抽簽法隨機(jī)分為2組，每組12只。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均注射相同劑量的0.9%氯化鈉注射液或尼可地爾(0.1 mg/kg)，每天1次，第9次注射結(jié)束后10%水合氯醛麻醉并肝素化。剪開(kāi)胸骨暴露心臟，阻斷升主動(dòng)脈，在主動(dòng)脈根部注射4℃ St-Thomas液4～6 mL，待心臟完全停搏，心外膜變白后，摘除心臟，迅速修剪后放入4℃心肌保存液中。

1.5 心肌組織MDA含量測(cè)定

分別在2、4、6、8、10、12、16、20、24 h 取左心室前壁心肌組織制成勻漿液，離心取上清。硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，具體操作過(guò)程按照試劑盒。

1.6 心肌組織電鏡超微結(jié)構(gòu)測(cè)定

各時(shí)間點(diǎn)取0.1 cm ×0.1 cm ×0.1 cm 體積的大鼠離體心肌，并置于電鏡固定液，超薄切片電鏡觀察。

1.7 免疫組化法檢測(cè)

各時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本取材置于10%中性甲醛4℃固定24 h常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋。全層心肌連續(xù)切片，厚度約5 μm，用經(jīng)粘片劑處理過(guò)的載玻片撈片，置于60℃烤箱烘烤3 h后行S-P法免疫組化染色。滴加HSP70一抗4℃過(guò)夜(1∶150)，滴加二抗37℃孵育1 h，DAB顯色。多媒體彩色病理分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)，取均值。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

標(biāo)本取材加3倍體積細(xì)胞裂解液，冰浴中勻漿，4℃離心5 min，12 000 r/min離心取上清?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)樣本的蛋白含量后，取蛋白樣品40 μg與等體積上樣緩沖液混合，95℃煮沸10 min，10%SDS-PAGE膠分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫下震蕩1 h，加入HSP70一抗(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜，二抗37℃孵育1 h，TBST洗滌并曝光，洗膜敷βactin并作定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量分析。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組間比較采用雙因素方差分析，組間比較采用Bonferroni檢驗(yàn);同一處理組不同時(shí)間點(diǎn)比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織MDA含量測(cè)定

供心置入保存液后，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組MDA含量均表現(xiàn)為逐漸升高，同一時(shí)間點(diǎn)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組供心保存8 h MDA含量明顯增加，與保存6 h相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;10 h MDA含量增加趨勢(shì)顯著，與8 h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。對(duì)照組供心保存4 h MDA含量即明顯增加，保存6 h后MDA含量增加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1及圖1。

表1 2組中各時(shí)間點(diǎn)MDA的含量測(cè)定Tab.1 The concentrations of MDA in the two groups of control and NCR at different time points()(nmol/mg)

表1 2組中各時(shí)間點(diǎn)MDA的含量測(cè)定Tab.1 The concentrations of MDA in the two groups of control and NCR at different time points()(nmol/mg)

＊＊ P ＜0.01 vs control group;MDA:malonaldehyde;NCR:nicorandil.

Time/h Control group NCR group 2 1.98 ±0.55 0.35 ±0.09＊＊2.13 ±0.57 0.37 ±0.09＊＊6 2.94 ±0.55 0.53 ±0.10＊＊8 4.02 ±0.97 1.28 ±0.24＊＊10 5.31 ±1.34 2.70 ±0.42＊＊12 6.34 ±0.11 3.29 ±0.12＊＊16 7.15 ±0.17 4.42 ±0.14＊＊20 7.70 ±0.17 4.36 ±0.22＊＊______24___________________________________________________8.24_±0.17_5.19±0.18 4＊＊________

2.2 心肌組織電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察

對(duì)照組保存6 h的供心可見(jiàn)心肌細(xì)胞水腫明顯，局灶性肌絲斷裂溶解消失，染色體邊集，線粒體嵴模糊、部分消失、線粒體間空泡較多、線粒體內(nèi)出現(xiàn)空泡及致密顆粒(圖1A)。實(shí)驗(yàn)組低溫保存8 h的離體心臟心肌細(xì)胞尚完整，肌絲、肌節(jié)排列稍紊亂，線粒體輕度腫脹有空泡化，增生明顯，嵴較亂(圖1B)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組離體心肌組織的超微結(jié)構(gòu)Fig.1 The ultrastructure of myocardial tissue in two groups(6 600×)

2.3 尼可地爾組和對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)心肌組織HSP70免疫組化測(cè)定結(jié)果

對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)心肌組織僅見(jiàn)少量HSP70陽(yáng)性細(xì)胞，各時(shí)間點(diǎn)HSP70表達(dá)量明顯少于實(shí)驗(yàn)組(P＜0.01)(表2，圖2A)。與對(duì)照組比較，尼可地爾預(yù)處理組離體后2 h可見(jiàn)中量胞核呈棕黃色的HSP70陽(yáng)性細(xì)胞;6 h達(dá)到高峰，可見(jiàn)大量胞核呈黃褐色陽(yáng)性細(xì)胞，明顯高于其他時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)(圖2B);隨離體心臟保存時(shí)間延長(zhǎng)，HSP70陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，最終24 h時(shí)僅見(jiàn)胞核少量陽(yáng)性細(xì)胞，數(shù)量明顯減少。

表2 2組不同時(shí)間點(diǎn)HSP70陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)Tab.2 The HSP70 positively stained cells in the two groups of control and NCR at different time point()(n=12)

表2 2組不同時(shí)間點(diǎn)HSP70陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)Tab.2 The HSP70 positively stained cells in the two groups of control and NCR at different time point()(n=12)

* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control group;NCR:nicorandil.

Time/h Control group NCR group 2 1.02 ±0.16 67.01 ±5.04＊＊1.31 ±0.21 66.60 ±4.66＊＊6 1.72 ±0.42 79.68 ±6.18＊＊8 1.89 ±0.33 74.45 ±4.46＊＊10 1.68 ±0.35 65.99 ±5.80＊＊12 0.84 ±0.29 43.27 ±4.07*16 0.80 ±0.19 25.49 ±3.27*20 0.78 ±0.27 15.41 ±2.88*______24___________________________________________________0.66_±0.32_2.25_±0.72 4*_________

2.4 尼可地爾預(yù)處理組及其對(duì)照組心肌組織HSP70蛋白印跡測(cè)定結(jié)果

與實(shí)驗(yàn)組相比，對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)只有微量HSP70蛋白表達(dá)(表3，圖3A)(P＜0.01)。尼可地爾預(yù)處理組離體后2 h HSP70蛋白中量表達(dá);至6 h即可見(jiàn)大量HSP70蛋白表達(dá)，表達(dá)量大于同組其他時(shí)間點(diǎn)(圖3B)(P＜0.01);隨離體心臟保存時(shí)間延長(zhǎng)，HSP70表達(dá)水平逐漸下降，但離體24 h后仍高于對(duì)照組(P＜0.01)。

2.5 心臟損傷指標(biāo)MDA與HSP70表達(dá)的相關(guān)關(guān)系比較

Spearman相關(guān)分析顯示:MDA與HSP70陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、HSP70蛋白表達(dá)量之間均有明顯負(fù)相關(guān)性(r1= －0.724，P ＜0.05;r2= －0.715，P ＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

1967年首例人類心臟移植成功以來(lái)，心臟移植效果隨著心臟保存技術(shù)的改進(jìn)有了顯著提高［1，13］。缺血預(yù)處理和熱預(yù)處理作為有效的心臟保存方式畢竟是一種損傷性過(guò)程，而且最佳時(shí)間、安全時(shí)限及個(gè)體差異等問(wèn)題使其臨床應(yīng)用受到限制。使用藥物替代缺血進(jìn)行預(yù)處理來(lái)保存離體心肌具有更大的臨床意義。

圖2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組HSP70蛋白免疫組化圖Fig.2 The expression of HSP70 in two groups(400×)

表3 2組不同時(shí)間點(diǎn)HSP70蛋白印記結(jié)果Tab.3 The expression of HSP70 protein in the two groups of control and NCR at different time point()(n=12)

表3 2組不同時(shí)間點(diǎn)HSP70蛋白印記結(jié)果Tab.3 The expression of HSP70 protein in the two groups of control and NCR at different time point()(n=12)

＊＊ P ＜0.01 vs control group;NCR:nicorandil.

Time/h control group NCR group 2 0.98 ±0.10 4.51 ±0.31＊＊1.05 ±0.15 3.67 ±0.41＊＊6 1.15 ±0.21 5.28 ±0.33＊＊8 1.58 ±0.34 4.71 ±0.46＊＊10 1.17 ±0.18 3.92 ±0.43＊＊12 0.89 ±0.12 2.88 ±0.33＊＊16 1.02 ±0.16 3.51 ±0.21＊＊20 0.81 ±0.12 0.93 ±0.25＊＊24 0.72 ±0.11 1.52 ±0.61 4＊＊

圖3 2組不同時(shí)間點(diǎn)HSP70蛋白水平表達(dá)Fig.3 The expression of HSP70 protein in two groups at different time point

研究［14］表明七氟烷預(yù)處理新生大鼠心肌細(xì)胞過(guò)程中，鉀離子ATP通道抑制劑可以抑制HSP70的表達(dá)。為了進(jìn)一步研究鉀離子ATP通道與HSP70在離體心肌保存中的關(guān)系，我們使用鉀離子ATP通道開(kāi)放劑尼可地爾預(yù)處理大鼠。與對(duì)照組相比，尼可地爾預(yù)處理組過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醇MDA含量增加不多，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)其心肌超微結(jié)構(gòu)也有所改善。這提示尼可地爾預(yù)處理和低溫保存離體心臟可以使供心的心肌結(jié)構(gòu)改變較輕微，對(duì)大鼠離體心臟的保存有利。本研究前期試驗(yàn)提示，尼可地爾、去甲腎上腺素、黃芪、硝酸甘油、倍他樂(lè)克、三七、川芎嗪等都能誘導(dǎo)在體心肌表達(dá)內(nèi)源性HSP70，而尼可地爾的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步動(dòng)態(tài)觀察了尼可地爾預(yù)處理誘導(dǎo)離體心臟HSP70的表達(dá)規(guī)律。免疫組化和免疫印記結(jié)果表明在低溫保存條件下，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)HSP70蛋白表達(dá)量均顯著大于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組在6 h就達(dá)到高峰，而且主要定位于細(xì)胞核。相關(guān)分析結(jié)果表明心臟損傷程度指標(biāo)MDA與HSP70表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步提示HSP70為離體心肌的保護(hù)因素之一。有研究［15］認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)HSP70短暫高表達(dá)可減輕因ATP耗竭引起的細(xì)胞毒性和蛋白毒性效應(yīng)。另外由于冷存離體心臟仍保持低水平的新陳代謝，所以仍可表達(dá)痕量HSP70，但由于代謝緩慢和底物不足，隨時(shí)間延長(zhǎng)，其表達(dá)量也明顯降低。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在體尼可地爾誘導(dǎo)后離體心臟仍能表達(dá)保護(hù)性HSP70，并且呈現(xiàn)一定的表達(dá)規(guī)律，提示藥物預(yù)處理確能對(duì)離體心臟提供一定的保護(hù)作用。

尼可地爾預(yù)適應(yīng)的機(jī)制非常復(fù)雜，本文僅初步探討了誘導(dǎo)型HSP70所起的作用，具體的分子機(jī)制如HSP70與KATP的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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