外源性皮質(zhì)酮對大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞熱休克蛋白90表達(dá)的影響

王曉兵，張薇，田國祥

應(yīng)激(stress)是指內(nèi)外環(huán)境刺激超過正常閾值時，機(jī)體出現(xiàn)的一種包括神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)等在內(nèi)的綜合應(yīng)答狀態(tài)。在應(yīng)激狀態(tài)下，各種有機(jī)體都有其共同的分子反應(yīng)，即正?；虮磉_(dá)的抑制和一組特殊基因——熱休克蛋白基因的激活和表達(dá)，這導(dǎo)致熱休克蛋白(HSP)的大量產(chǎn)生。血清皮質(zhì)酮(CORT)增多是機(jī)體應(yīng)激時的一個重要表現(xiàn)，應(yīng)激時糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GC)分泌顯著增多具有重要的生理意義，不僅可以調(diào)控炎癥反應(yīng)，而且還有參與機(jī)體能量代謝、提高血管對兒茶酚胺的敏感性以及穩(wěn)定溶酶體膜等多種作用。本實(shí)驗(yàn)通過采用皮質(zhì)酮對大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的干預(yù)，目的在于觀察皮質(zhì)酮對大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞熱休克蛋白90表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 健康Wistar大鼠(清潔級)，體重(120±10)g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)動物所;皮質(zhì)酮購自Sigma公司;抗HSP90抗體購自Santa Cruz公司。Elx800型酶標(biāo)儀為BIO2TEK公司產(chǎn)品;倒置光學(xué)顯微鏡(BX60)為德國Leica公司產(chǎn)品;PCR儀為Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 模型制做及實(shí)驗(yàn)分組 采用大鼠主動脈“環(huán)”植塊培養(yǎng)［1］大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞及傳代，實(shí)驗(yàn)用大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分為三組，分別為正常組、量效組和時相組，量效組加入終濃度分別為0.1μM、50μM和100μM的CORT，分別繼續(xù)培養(yǎng)2 h、4 h、6 h、12 h、24 h和72 h后收集細(xì)胞并做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 Bradford法測定細(xì)胞總蛋白含量［2］以牛血清白蛋白(BSA)為測量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，并將其配置成0.5 mg/ml溶液。取5支EP管分別加入0.5 mg/ml BSA 5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，再加0.15 mmol/L NaCl補(bǔ)足至 100μl;另取一支 EP管加入 100μl 0.15 mmo1/L NaCl作為空白對照。然后，每支EP管中各加入1 ml考馬斯亮藍(lán)G-250染液，充分混勻，室溫下放置2 min，用1 cm光徑的比色杯測595 nm波長處的吸光度(A595)，以A595與對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)BSA濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以同樣的方法測量待測蛋白樣品的A595，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品蛋白含量。

1.4 細(xì)胞總RNA的提取及RT-PCR PCR引物設(shè)計(jì)與合成:從GenBank中查找大鼠HSP90和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因序列，應(yīng)用Primer 4.0引物設(shè)計(jì)軟件，按照引物設(shè)計(jì)的基本原則，并優(yōu)選跨不同外顯子的一對引物。設(shè)計(jì)好的引物由上海生物工程公司合成。HSP90引物序列:上游引物5＇TTGAGCCCATTGATGAGTATTG 3＇;下游引物5＇GGGTTTATCTCCAGGTGTTTCT 3＇。GAPDH引物序列:上游引物5＇-GTGACTTCAACAGCAACTCCCATTC-3＇;下游引物5＇-GTTATGGGGTCTGGGATGGAATTGTG-3＇。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間差異采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)酮干預(yù)后大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白中HSP90的含量及量效動態(tài)變化 Western blot檢測結(jié)果顯示:皮質(zhì)酮干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞2 h后，干預(yù)濃度不同的各組(0.1μM、50μM和100μM)，內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白中HSP90的含量顯示明顯增加，皮質(zhì)酮干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞6 h后，各組內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白中HSP90的含量達(dá)到峰值，其中干預(yù)濃度為0.1μM組HSP90的蛋白含量增加最為明顯，皮質(zhì)酮干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞72 h后，0.1μM組、50μM和100μM組HSP90的蛋白含量仍有少量表達(dá)(圖1、2、3)。

圖1 皮質(zhì)酮干預(yù)后大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白中HSP90的含量及量效動態(tài)變化(n=5)

圖2 皮質(zhì)酮干預(yù)后大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白中HSP90的含量(0.1μM組)

圖3 皮質(zhì)酮干預(yù)后大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白中HSP90的含量(6 h組)

2.2 皮質(zhì)酮干預(yù)后大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞HSP90 mRNA水平的表達(dá) 根據(jù)蛋白水平的表達(dá)變化情況，通過PCR重點(diǎn)檢測了未干預(yù)組和皮質(zhì)酮干預(yù)6 h(0.1 μM組)大鼠主動脈內(nèi)皮中HSP90 mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，未干預(yù)組HSP90 mRNA表達(dá)較弱，皮質(zhì)酮干預(yù)6 h后，其表達(dá)顯著提高，HSP90 mRNA表達(dá)水平分別為(0.66±0.07)ODu×mm2、(7.42±0.19)ODu×mm2，兩組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)(圖4)。

圖4 皮質(zhì)酮干預(yù)6 h后HSP90 mRNA的表達(dá)變化(0.1μM組)

3 討論

HSP90是目前研究較多的一類熱休克蛋白，HSP90為生物進(jìn)化過程中一種高度保守的蛋白質(zhì)，主要存在于細(xì)胞漿，約占胞漿蛋白的1%～2%。在真核動物細(xì)胞中，HSP90的缺失會導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。人類HSP90以是否富含谷氨酰胺片段分為α和β兩種主要類型，分別由不同基因編碼，其中HSP90α基因包含11個外顯子和10個內(nèi)含子。HSP90β基因位于6p21。對HSP90β基因的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在其轉(zhuǎn)錄起始位置上游包含由1102個堿基對組成的區(qū)域，整個基因包含12個外顯子和11個內(nèi)含子，外顯子長度介于99～396個堿基對之間，而內(nèi)含子為91～1433個堿基對，目前已鑒定出的6個熱休克元件中有3個位于第一內(nèi)含子里。人類HSP90家族的HSP90α和HSP90β的cDNA在1989年被克隆，它們分別轉(zhuǎn)錄形成不同的mRNA。已知HSP90α和HSP90β基因的第一個外顯子是不能翻譯為蛋白質(zhì)的。一般情況下，HSP90α易受熱誘導(dǎo)，HSP90β易受有絲分裂的誘導(dǎo)。在高溫、創(chuàng)傷等因素刺激時內(nèi)臟組織中以HSP90α表達(dá)升高為主。

類固醇激素在未被活化時都與HSP90結(jié)合，類固醇激素與受體結(jié)合需要HSP90，在沒有激素作用時，2分子HSP90與1分子類固醇激素受體結(jié)合，使受體處于非活性狀態(tài)，此時的受體雖然不能與細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，但HSP90可以讓受體維持在一個激素配體結(jié)合狀態(tài)中。Picard等［3］利用哺乳動物的類固醇激素受體可以在酵母細(xì)胞中發(fā)揮作用，而酵母的HSP90含量容易調(diào)節(jié)這一特性，下調(diào)HSP90含量二十多倍后發(fā)現(xiàn)，在HSP90含量很低的情況下，受體大多未與HSP90結(jié)合。研究表明HSP90是糖皮質(zhì)激素受體(GR)，的一種重要的伴侶蛋白，影響著GR活性和功能［4-7］。生理狀態(tài)下，GR與HSP90等分子伴侶結(jié)合而存在于胞漿中，HSP90遮蓋了GR的DNA結(jié)合部位，阻滯GR活性，GC進(jìn)入細(xì)胞后與GR的C端結(jié)合，GR發(fā)生溫度依賴性立體構(gòu)型變化，HSP90等被解離，DNA結(jié)合部位得以暴露，抑制活性被解除，成為能與DNA結(jié)合的活化型受體。這種活化的GR與GC一起向核內(nèi)移行，與細(xì)胞核靶基因中特定的GRE結(jié)合，誘導(dǎo)生成特異性mRNA，指導(dǎo)特定蛋白質(zhì)合成，發(fā)揮其生物效應(yīng)。進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的GR在發(fā)揮完其轉(zhuǎn)錄激活作用后，又會返回胞漿中，并與HSP90等分子伴侶結(jié)合，等待再次被GC激活。研究發(fā)現(xiàn)用HSP90抑制劑可以減弱地塞米松誘導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素受體核轉(zhuǎn)位，并影響一些前炎癥因子的活化，從而進(jìn)一步提示HSP90在類固醇激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要作用。HSP90有兩個富含負(fù)電荷區(qū)域，一個位于中央鉸鏈區(qū)，是真核細(xì)胞所特有的，參與和糖皮質(zhì)激素受體等靶蛋白的結(jié)合。該區(qū)還有核定位信號(NLS)，可能參與類固醇激素受體的細(xì)胞漿-細(xì)胞核穿梭。因此，細(xì)胞內(nèi)的GR一直是處于循環(huán)再利用狀態(tài)，而HSP90在其循環(huán)過程中起著至關(guān)重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，皮質(zhì)酮干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞2h后，干預(yù)濃度不同的各組(0.1μM、50μM和100μM)，內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白中HSP90的含量顯示明顯增加，皮質(zhì)酮干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞6 h后，各組內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白中HSP90的含量達(dá)到峰值，其中以0.1μM組HSP90的蛋白含量增加最為明顯。皮質(zhì)酮干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞72 h后，0.1μM組、50μM和100μM組HSP90的蛋白含量仍有少量表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用皮質(zhì)酮干預(yù)大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞后，觀測不同時相點(diǎn)和不同量效點(diǎn)大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞熱休克蛋白90表達(dá)的改變，通過本部分實(shí)驗(yàn)研究顯示外源性皮質(zhì)酮可以促使大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞HSP90表達(dá)顯著增加。

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