近紅外熒光分子標(biāo)記的ox-LDL靶向小鼠動脈粥樣硬化模型的成像研究

王圓圓，姚玉宇，張毅，文頌，郭靜，顧月清

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院放射科，江蘇 南京 210009;2.中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210009)

關(guān)于動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的形成機(jī)制，最被廣泛接受的是“損傷后反應(yīng)”學(xué)說[1]，即內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起血管炎癥，繼而形成泡沫細(xì)胞和發(fā)生增殖反應(yīng)。對AS疾病，了解、探討其發(fā)生發(fā)展過程及可能機(jī)制具有重大意義。本實驗通過體外合成近紅外熒光分子標(biāo)記的ox-LDL分子，進(jìn)行體外巨噬細(xì)胞吞噬實驗，并采用高脂喂食動脈內(nèi)皮損傷后的Apo E-/-小鼠，成功建立頸總動脈AS模型，并通過活體7 T MRI、近紅外成像及病理組織學(xué)對照研究，觀察近紅外熒光分子探針對小鼠頸總動脈AS的評估價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及試劑 小鼠RAW 264.7細(xì)胞株(上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，ox-LDL(2 mg·ml－1，廣州奕源生物科技有限公司)，碳青花染料ICG-Der-02(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院)，高糖DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司，美國)，胎牛血清(四季青公司)，EDTA-胰蛋白酶(Sigma公司，美國)，MTT(南京晚晴化學(xué)制劑公司)。

1.1.2 動物與飼料 實驗動物:Apo E-/-鼠10只[8周齡，雄性，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部，許可證號:SCXK(京)2006-0008]，高脂飼料(Western Diet:21%脂肪，0.15%膽固醇，南京協(xié)同生物有限公司)。

1.1.3 儀器及藥品 CO2培養(yǎng)箱(Herabus，德國)，倒置相差顯微鏡(Zeiss Axiovert25 CFL，德國)，紫外分光光度計(Bedkmen，美國)，凈化工作臺(吳江市生化凈化設(shè)備廠)，7 T MRI設(shè)備(Bruker，PharmaScan，德國，孔徑大小89 mm，射頻線圈直徑25 mm)，近紅外成像儀(CRI Maestro系統(tǒng))，異氟烷(山東科源制藥有限公司)，戊巴比妥鈉(南京晚晴化學(xué)制劑公司)。

1.2 方法

1.2.1 ox-LDL-ICG-Der-02探針合成 ICG-Der-02是一種吲哚菁綠的衍生物，首先在常溫下將其溶解在DMSO溶液中，然后與催化劑EDC/NHS(GL生化有限公司，上海)混合 4 h，(摩爾比值 ICG-Der-02∶EDC∶NHS=1∶1.5∶1.5)，緩慢滴入 5 ml ox-LDL 溶液，4 ℃下避光攪拌12 h，在4℃下離心(800×g，5 min)，取上清液用PBS透析(分子篩10 kDa)直到游離染料完全透析掉，0.22 μm 過濾器濾過后 4 ℃避光保存[2]。

1.2.2 考馬斯亮藍(lán)G-250法測定探針蛋白含量 用標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度(mg·ml－1)為橫坐標(biāo)，用吸光度(A)值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出樣品蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 Raw 264.7細(xì)胞吞噬實驗 用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，置入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底時用含EDTA的0.25%胰酶消化，用含血清的培養(yǎng)液終止消化后離心，倒掉上清，用培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋至濃度為106個·ml－1，各取2 ml置入6 孔板中，取5 孔分別加入10、20、40、60、80 μl近紅外探針，孵育6 h后用PBS沖洗3遍，用近紅外儀檢測熒光信號強(qiáng)度。

1.2.4 MTT細(xì)胞活力檢測 收集對數(shù)期細(xì)胞至96孔板中，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至103～104個·孔－1，至細(xì)胞單層鋪滿孔底時，分別取細(xì)胞對照組、小劑量組及大劑量組，各設(shè)5個復(fù)孔，小劑量組及大劑量組分別加入10、100 μl·ml－1劑量的探針，5%CO2、37 ℃ 孵育 6 h，倒掉培養(yǎng)液，用PBS沖洗3遍后，加入150 μl培養(yǎng)液進(jìn)行MTT檢測，記錄每孔A值，連續(xù)60 h，繪制細(xì)胞對照組、小劑量組及大劑量組的細(xì)胞生長曲線。

1.2.5 頸總動脈粥樣硬化模型的建立 8周齡大小Apo E-/-鼠10 只，戊巴比妥鈉按 60 mg·kg－1腹腔麻醉后，分離一側(cè)頸總、頸外動脈，從頸外動脈將細(xì)金屬絲伸至頸總動脈內(nèi)約15 mm，來回牽拉損傷頸總動脈內(nèi)膜3次，結(jié)扎頸外動脈并縫合創(chuàng)口。

1.2.6 7 T MR掃描 使用小鼠專用床及線圈，采用T2及質(zhì)子成像序列，進(jìn)行小鼠頸總動脈斑塊的成像。成像參數(shù):MSME-PD-T2WI，TR 2 400 ms，TE 13/65 ms;FOV 2.5 cm，矩陣 256 ×256;分辨率 117 μm ×117 μm ×700 μm，平均激勵次數(shù)為 4 次，掃描使用壓脂技術(shù)減少偽影，層厚均為 0.6 mm，層間距為0.7 mm，每序列掃描16層。

1.2.7 體內(nèi)近紅外成像 掃描前用戊巴比妥鈉按60 mg·kg－1劑 量 進(jìn) 行 腹 腔 麻 醉，近 紅 外 探 針 按2 μl·g－1劑量進(jìn)行尾靜脈注射，15、30 min 及 1、2、24 h分別進(jìn)行紅外熒光檢測。

1.2.8 病理學(xué)觀察 所有動物在接受近紅外掃描后即刻被處死，處死前先暴露游離兩側(cè)頸動脈(方法同模型建立)，剪開右心房，經(jīng)左心室注入4%多聚甲醛10 ml，然后注入生理鹽水40 ml直至血管沖洗干凈，將兩側(cè)頸動脈取出，放置在4%多聚甲醛溶液中，血管橫斷面作冰凍切片，HE染色。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)處理 用統(tǒng)計軟件 SPSS 15.0處理所有實驗數(shù)據(jù)，求出各組各觀察指標(biāo)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，t檢驗比較各組各定量指標(biāo)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 考馬斯亮藍(lán)G-250法測定探針蛋白含量

見圖1。

經(jīng)測算標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)為:Y=2.579X+0.438(R=0.980，P=0.001)，因此測得探針的蛋白濃度為 1.085 mg·ml－1。

2.2 細(xì)胞吞噬實驗及體外近紅外成像結(jié)果

2.2.1 細(xì)胞形態(tài)變化 細(xì)胞對照組即未標(biāo)記探針的細(xì)胞呈邊緣光整且偽足較少的圓形單核形態(tài)，該細(xì)胞分裂增殖較快，且細(xì)胞活力較強(qiáng)。標(biāo)記10與20 μl探針后的細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，仍呈圓形(見圖2a)。而與標(biāo)記80 μl探針后的細(xì)胞形態(tài)比較，發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞由單核形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘈涡跃奘杉?xì)胞形態(tài)，細(xì)胞體積增大，偽足較多，且細(xì)胞數(shù)目亦有所減少(圖2b)。

2.2.2 近紅外熒光強(qiáng)度結(jié)果 見圖3。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 細(xì)胞形態(tài) ×400

圖3 體外細(xì)胞近紅外熒光成像 從左上至右下分別加入探針 0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 ml，在劑量為 0.01 ～ 0.06 ml·(2 ml)－1時熒光強(qiáng)度隨濃度遞增而增加，而劑量為0.08 ml·(2 ml)－1時熒光強(qiáng)度較前有所降低

不同劑量探針孵育細(xì)胞后測定其近紅外熒光強(qiáng)度，熒光信號亦隨之改變，在探針劑量為 0.01～0.06 ml·(2 ml)－1內(nèi)近似線性關(guān)系，而在 0.08 ml·(2 ml)－1劑量時熒光強(qiáng)度有所減弱，見表1。

表1 不同劑量探針孵育細(xì)胞后近紅外熒光強(qiáng)度(±s)

表1 不同劑量探針孵育細(xì)胞后近紅外熒光強(qiáng)度(±s)

0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 5.041 ±0.763 13.275 ±1.274 29.159 ±0.840 54.2細(xì)胞對照 不同探針劑量[ml·(2 ml)－1]下熒光強(qiáng)度24 ±1.614 90.710 ±3.376 82.402 ±2.831

2.3 MTT檢測細(xì)胞活力結(jié)果

將未標(biāo)記細(xì)胞組、小劑量探針標(biāo)記細(xì)胞組及大劑量探針標(biāo)記細(xì)胞組分別進(jìn)行活力檢測，作出兩者的生長曲線，可見小劑量的探針對細(xì)胞活力沒有影響，而大劑量的探針對細(xì)胞活力有一定的影響(圖4)。

2.4 7 T MR掃描及近紅外熒光掃描

采用金屬絲拉傷小鼠頸總動脈內(nèi)膜模型，經(jīng)7 T MR掃描后，可見術(shù)后周圍水腫較明顯，2周后水腫基本吸收，患側(cè)血管表現(xiàn)為血管腔狹窄，血管壁增厚(圖5)。此時進(jìn)行活體近紅外成像，可見患側(cè)有近紅外熒光逐漸聚集，1～2 h可見較明顯聚集，24 h后較多信號已衰減(見圖6)。

2.5 HE 染色結(jié)果

模型鼠2周后進(jìn)行頸總動脈取材及HE染色，在病理組織學(xué)切片上，可見患側(cè)血管管壁不規(guī)則增厚，新內(nèi)膜增生(見圖7)。

圖4 MTT法繪制細(xì)胞生長曲線 未標(biāo)記細(xì)胞生長速度較快，在一定時間內(nèi)且呈線性增殖，小劑量探針標(biāo)記后并未對細(xì)胞增殖的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，大劑量探針標(biāo)記細(xì)胞一定時間后對其增殖的影響有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，甚至可能阻滯細(xì)胞生長

圖5 小鼠頸部磁共振成像 a、b為同一層面。a.質(zhì)子加權(quán)像;b.T2加權(quán)像?？梢娪覀?cè)頸總動脈管壁增厚，且管腔較對側(cè)狹窄，周圍炎癥基本吸收

3 討 論

關(guān)于小鼠血管內(nèi)膜損傷模型，實驗證明多種方法均能成功建立。其中，在頸部進(jìn)行金屬絲損傷法操作較為簡便易行。選擇在高脂喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上利用金屬絲拉傷建立早期AS模型，成功率較高且穩(wěn)定可靠[3]。

圖6 不同時間點小鼠頸部近紅外熒光分布圖 a.明場圖;b、c、d、e、f依次為15 min、30 min、1 h、2 h、24 h近紅外熒光掃描圖。右側(cè)頸總動脈為患側(cè)，15 min及30 min時可見周圍腺體近紅外熒光的非特異性聚集，右側(cè)頸總動脈已可見熒光聚集，1 h時可見右側(cè)頸總動脈走形區(qū)呈條狀近紅外熒光聚集，24 h后熒光信號明顯減少;切口周圍亦可見非特異性熒光聚集

圖7 模型鼠頸總動脈管壁切片 HE×200

近紅外熒光分子探針由于其極其敏感、無創(chuàng)、無放射性、宏觀微觀顯影、良好的組織對比、實時顯像、價格相對便宜的優(yōu)點，越來越多地被用于動物實驗。目前近紅外探針已被用于檢測腫瘤、細(xì)胞凋亡及炎癥成像等[4]。由于近紅外熒光分子本身具有高敏感性及組織對比性，且頸總動脈距體表的距離不超過近紅外熒光分子的成像限度。采用切開頸部皮膚及分離軟組織后近紅外成像，更能減少偽影，避免因腺體、肌肉等炎癥發(fā)生非特異性成像，可操作性較強(qiáng)。

AS斑塊中的巨噬細(xì)胞有吞噬、參與炎癥、免疫及增殖反應(yīng)，破裂的AS斑塊與非破裂的斑塊相比，其纖維帽中含有更多的巨噬細(xì)胞。因此，如果能早期觀察到巨噬細(xì)胞異常聚集，可能為易損斑塊的早期發(fā)現(xiàn)提供線索。在AS疾病模型中，可見大量的泡沫細(xì)胞，一般認(rèn)為，這些泡沫細(xì)胞是由于巨噬細(xì)胞通過清道夫受體大量吞噬ox-LDL形成。實驗表明，巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)的攝取可經(jīng)如清道夫受體等受體途徑，也可經(jīng)巨噬細(xì)胞的胞飲途徑[5-8]。

體外細(xì)胞吞噬實驗驗證了近紅外標(biāo)記的ox-LDL可被巨噬細(xì)胞吞噬，且攝取量與探針濃度具有相關(guān)性。同時發(fā)現(xiàn):小劑量的探針對小鼠單核巨噬細(xì)胞的生長、形態(tài)及活力沒有明顯影響，而探針劑量較大時可發(fā)現(xiàn)較多單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閭巫爿^多的巨噬細(xì)胞，細(xì)胞活力有所下降，這與巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL形成泡沫細(xì)胞后的改變可能有所關(guān)聯(lián)，此時細(xì)胞近紅外成像示熒光強(qiáng)度有所減低，這證明了只有在巨噬細(xì)胞大量聚集處才可能吞噬較多的近紅外探針。

小鼠頸總動脈損傷后2周，進(jìn)行MR掃描可見患側(cè)頸總動脈管壁增厚，HE染色證實新生內(nèi)膜增生。且此時患側(cè)頸部周圍炎性滲出已基本吸收，頸總動脈局部管腔較窄，血流動力學(xué)發(fā)生改變，有利于近紅外探針的局部聚集及攝取。通過近紅外成像證實，在以不影響細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變的前提下，即在探針濃度的允許范圍內(nèi)，可以很好地進(jìn)行熒光成像?；紓?cè)頸部近紅外熒光信號聚集，且在頸總動脈分叉處信號聚集明顯，與AS好發(fā)部位相一致，表明在患側(cè)頸總動脈內(nèi)可能存在較多可以吞噬近紅外熒光分子的巨噬細(xì)胞，這可能為易損斑塊的早期發(fā)現(xiàn)提供線索。應(yīng)用水溶性的熒光分子，較多經(jīng)過腎臟排泄，可在膀胱內(nèi)見到較多的熒光聚集。近紅外標(biāo)記的ox-LDL在體外測量的峰值約800 nm，在活體內(nèi)約820 nm，證明在體內(nèi)發(fā)生了紅移現(xiàn)象，但總體改變不大，仍可較好顯示病變。頸部病變較為局限，但由于光的散射原理，可能存在較多偽影，且凡是存在炎癥的部位均可引起非特異性聚集，這就減低了其特異性。

每個LDL分子中含有1個apoB-100，后者含有豐富的胺基，可與近紅外熒光分子染料如碳青花類染料的羧基相結(jié)合，經(jīng)過分離純化后可被用于腫瘤、炎癥等近紅外的成像，連接成功率為100%，有學(xué)者等則利用HDL作為載體，實現(xiàn)了Gd、熒光分子及HDL模擬肽探針的合成[2，9-10]。雖然apoB含有一定數(shù)量的胺基，但在連接過程中，無法得知apoB-100與多少個熒光分子相連，因此劑量問題需要進(jìn)一步探索。

總而言之，近紅外熒光分子標(biāo)記的ox-LDL是一種新型的分子探針，該探針對AS的早期診斷及易損斑塊的研究可能具有良好前景。

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