zebularine調(diào)控卵巢癌A2780細(xì)胞RASSF1A基因再表達(dá)的研究

沈文靜，劉石磊，邱廣蓉

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，遼寧沈陽 110001;2.遼河油田 康復(fù)醫(yī)院，遼寧興城 125100;3.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室，遼寧沈陽 110001)

Ras相關(guān)區(qū)域家族1A基因(Ras associated domain family genes 1A，RASSF1A)，是從人3號染色體短臂克隆出來的一種新型腫瘤抑制基因，RASSF1A基因異常甲基化引起RASSF1A表達(dá)缺失參與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生[1]。研究表明，RASSF1A基因異常甲基化導(dǎo)致表達(dá)失活與上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[2]。由于甲基化的過程是可逆的，通過應(yīng)用去甲基化藥物能夠誘導(dǎo)由于基因啟動子區(qū)異常甲基化導(dǎo)致失活的抑癌基因再表達(dá)[3]，這有可能成為卵巢癌臨床治療的新靶點。zebularine(Zeb)是一種去甲基化藥物，具有性質(zhì)穩(wěn)定、毒性低的特點[4]。Cheng 等[5]發(fā)現(xiàn)，Zeb 具有較強的去甲基化和抗腫瘤增殖作用，提示該藥物有可能作為抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床。本研究通過觀察應(yīng)用Zeb后人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780中抑癌基因RASSF1A甲基化狀態(tài)及表達(dá)水平的改變，探討Zeb對卵巢癌細(xì)胞RASSF1A基因表達(dá)的調(diào)控作用，初步為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780(天津血液病學(xué)研究所)，Zeb(Sigma公司)，Trizol(Invitrogen公司)，RT-PCR 試劑盒及Taq酶(TaKaRa公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)，RASSF1A羊抗人多克隆抗體(Santa Cruz公司)，Wizard DNA純化柱(Promega公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780的培養(yǎng)條件及實驗分組 細(xì)胞培養(yǎng)條件:應(yīng)用含10%胎牛血清的RPMI 1640，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度設(shè)置 37 ℃，CO2濃度 50 ml·L－1。取對數(shù)生長期的A2780細(xì)胞，應(yīng)用含低濃度胎牛血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，再予實驗藥物處理，在培養(yǎng)瓶中加入含實驗濃度(50、100、200 μmol·L－1)Zeb 的培養(yǎng)液，實驗的24、72 h更換同樣的加藥培養(yǎng)液，于第120小時收集細(xì)胞，對照組為未加藥物干預(yù)的A2780細(xì)胞。

1.2.2 RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測應(yīng)用甲基化特異性 PCR(methylation-specific PCP，MSP)法。實驗步驟:(1)離心沉淀收集Zeb作用120 h各實驗組A2780細(xì)胞，應(yīng)用酚-氯仿-異戊醇法提取細(xì)胞DNA。(2)DNA的修飾及純化:根據(jù)文獻已有方法[6]進行。純化體系 50 μl:樣本 DNA 2 μg，3 mol·L－1NaOH 5 μl，充分混勻，加熱至 75 ℃，反應(yīng) 15 min。取 20 mmol·L－1氫醌 12.6 μl(新鮮配置)和 320 μl濃度4.8 mol·L－1的亞硫酸氫鈉(NaHSO4)，充分混勻，加入礦物油10 μl，55℃水浴過夜。將DNA純化樹脂1 ml加入DNA純化體系中，混勻充分，再通過純化柱，應(yīng)用80%異丙醇2 ml溶解樹脂。應(yīng)用NaOH(3 mol·L－1)脫硫，醋酸鈉(5 mol·L－1)及無水冰乙醇沉淀純化的DNA。應(yīng)用75%乙醇洗滌后，溶于TE溶液30 μl中備用。(3)MSP反應(yīng):設(shè)置25 μl反應(yīng)體系，其中含2 μl樣品 DNA，2.5 μl 10 × PCR buffer，0.5 μl引物，2 μl dNTP，0.2 μl Taq 酶，17.3 μl雙蒸水。

PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 30 s，35個循環(huán);72℃延伸10 min。退火溫度設(shè)置:甲基化反應(yīng)為58℃，非甲基化反應(yīng)為57℃。陽性對照設(shè)置:甲基轉(zhuǎn)移酶SssⅠ處理的正常人外周血細(xì)胞DNA;陰性對照設(shè)置:未經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶SssⅠ處理的正常人外周血細(xì)胞DNA;空白對照設(shè)置:加入雙蒸水。分子質(zhì)量標(biāo)記:1 000 bp DL2000。

實驗應(yīng)用的引物序列:甲基化反應(yīng)，實驗?zāi)康漠a(chǎn)物94 bp，上游引物5'-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3'，下游引物5'-AACCCCGCGAACTAAAAACGA-3';非甲基化反應(yīng)，實驗?zāi)康漠a(chǎn)物108 bp，上游引物5'-TTTGGT TGGAGTGTGTTAATGTG-3'，下游引物5'-CAAACCC CACAAACTAAAAACAA-3'。

PCR產(chǎn)物應(yīng)用2%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，電泳條件:電壓100 V，電泳時間40 min。電泳結(jié)果應(yīng)用激光密度掃描儀(pharmacia LKB ultroscan)掃描后保存并進行分析。PCR實驗重復(fù)5次。

1.2.3 RASSF1A 基因 mRNA的檢測 應(yīng)用 RTPCR法。

離心沉淀收集Zeb作用120 h各實驗組A2780細(xì)胞，細(xì)胞總RNA應(yīng)用Trizol試劑進行提取，定量后稀釋為終濃度1 μg·L－1。首先合成 cDNA:應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶和Oliga(dT)20作為引物。

RT-PCR反應(yīng)體系設(shè)定為25 μl，反應(yīng)條件設(shè)置為:95℃預(yù)變性2 min;94℃ 40 s，67℃ 40 s，72℃60 s，35個循環(huán);72℃延伸6 min。擴增目的產(chǎn)物:RASSF1A mRNA 330 bp;β-actin 498 bp。引物序列設(shè)定:RASSF1A mRNA上游引物5'-GGCGTCGTGCGC AAAGGCC-3'，下游引物 5'-GGG TGGCTTCTTGCTG GAGGG-3';內(nèi)參 β-actin上游引物5'-GTGGGGCGC CCCAGGCACCA-3'，下游引物 5'-CTCCTTAATGT CACGCACGATTTC-3'。應(yīng)用2%瓊脂糖凝膠電泳對RT-PCR產(chǎn)物進行分離，電泳結(jié)果應(yīng)用自動成像儀(Alpha Image 2000)進行掃描成像并保存，然后采用Fluorchem V 2.0 Stand Alone軟件進行分析。RT-PCR實驗重復(fù)5次。

1.2.4 RASSF1A蛋白表達(dá)檢測 應(yīng)用Western blotting法。

離心沉淀收集Zeb作用120 h各實驗組A2780細(xì)胞?？偟鞍滋崛?應(yīng)用200 μl蛋白裂解液(細(xì)胞 ∶細(xì)胞裂解液為1∶5)，蛋白定量采用酚試劑法。上樣:于總蛋白取樣100 μl進行變性反應(yīng)10 min后，取其中的25 μl加樣進行電泳。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳:配制10%的SDS聚丙烯酰胺分離膠以及5%濃縮膠，取已變性總蛋白樣品20 μl，順序加入加樣孔中，100 V的電壓電泳2 h。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜及封閉:將蛋白電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，應(yīng)用10%脫脂奶粉進行封閉(室溫、1 h)。抗體雜交:然后將PVDF膜放在1∶200一抗稀釋液中過夜(4℃)，再置于1∶2 000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗稀釋液中，37℃孵育2 h，DAB顯色后觀察結(jié)果。成像應(yīng)用ChemiImager 5500 AlPhaInn Ch系統(tǒng)，數(shù)據(jù)采集應(yīng)用Fluorchem V 2.0系統(tǒng)。以β-actin蛋白表達(dá)為內(nèi)對照。實驗反應(yīng)重復(fù)5次。

2 結(jié) 果

2.1 Zeb對A2780細(xì)胞中RASSF1A基因甲基化狀態(tài)的影響

RASSF1A基因在卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780中呈異常甲基化狀態(tài)，經(jīng)過不同濃度 Zeb處理 120 h后，RASSF1A 基因在50 μmol·L－1組甲基化條帶減弱，在100、200 μmol·L－1組呈去甲基化狀態(tài)。見圖 1。

圖1 A2780細(xì)胞經(jīng)Zeb作用120 h后RASSF1A基因甲基化狀態(tài)的改變Fig 1 Change in methylation state of RASSF1A gene in ovarian cancer cell A2780 after treated with Zeb 120 h

2.2 Zeb對A2780細(xì)胞中RASSF1A基因mRNA表達(dá)的影響

Zeb處理前卵巢癌細(xì)胞A2780中未檢測到RASSF1A 基因 mRNA 表達(dá)，在 100、200 μmol·L－1組Zeb處理120 h后RASSF1A基因在mRNA水平重新表達(dá)，見圖2。

圖2 A2780細(xì)胞經(jīng)Zeb作用120 h后RASSF1A基因mRNA表達(dá)的改變Fig 2 mRNA expression of RASSF1A gene in ovarian cancer cell A2780 after treated with Zeb 120 h

2.3 Zeb對A2780細(xì)胞中RASSF1A基因蛋白表達(dá)的影響

Zeb處理前卵巢癌細(xì)胞A2780中未檢測到RASSF1A 基因蛋白表達(dá)，在 100、200 μmol·L－1組 Zeb處理120 h后RASSF1A基因重新表達(dá)，見圖3。

圖3 A2780細(xì)胞經(jīng)Zeb作用120 h后RASSF1A基因蛋白表達(dá)的改變Fig 3 Protein expression of RASSF1A gene in ovarian cancer cell A2780 after treated with Zeb 120 h

3 討 論

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，5年生存率25%～30%，其主要原因是缺少有效的早期診斷方法及化療耐藥性。腫瘤抑制基因啟動子區(qū)異常甲基化導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)失活參與卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展[2，7]。由于應(yīng)用去甲基化藥物可以使抑癌基因異常甲基化區(qū)域恢復(fù)到去甲基化狀態(tài)并恢復(fù)功能，目前去甲基化藥物的研究正在成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點，可能成為卵巢癌臨床治療的新靶點[4]。相對于目前研究較多的去甲基化藥物5-氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR)存在毒性、不穩(wěn)定性的缺點[8]，并且雖然體外實驗對卵巢癌細(xì)胞具有生長抑制作用[9]，但臨床試驗對包括卵巢癌在內(nèi)的實體瘤療效不理想[10]，Zeb具有性質(zhì)穩(wěn)定、毒性低的特點，它對腫瘤細(xì)胞具有高選擇性生長抑制作用，可能用于包括卵巢癌在內(nèi)的惡性腫瘤的臨床治療[4]。Zeb，[1-(β-D-呋喃核糖苷)-1，2-二氫嘧啶-2-酮]，是胞苷類似物，其分子結(jié)構(gòu)同一種已知的去甲基化藥物5-氮雜胞苷(5-azacytidine)相似。

RASSF1A基因是一種重要的抑癌基因，RASSF1A蛋白主要以GTP依賴的方式結(jié)合Ras傳導(dǎo)通路上游的Ras/GTP而被激活，發(fā)揮抑制細(xì)胞生長、促進細(xì)胞凋亡和衰老的功能[11]，是Ras傳導(dǎo)通路中非常活躍的負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白。卵巢癌組織中已證實，RASSF1A基因甲基化與卵巢癌發(fā)生有關(guān)，異常甲基化是其失活的主要機制[2]。本研究顯示，卵巢癌細(xì)胞 A2780細(xì)胞中RASSF1A基因呈異常甲基化狀態(tài)，經(jīng)過 Zeb處理120 h后，RASSF1A 基因在 100 及 200 μmol·L－1組呈現(xiàn)去甲基化，表明Zeb能使RASSF1A基因去甲基化。同時，Zeb處理前A2780細(xì)胞中RASSF1A基因在mRNA及蛋白水平均無表達(dá)，Zeb處理后，伴隨RASSF1A基因去甲基化，其mRNA及蛋白重新表達(dá)。根據(jù)Zeb處理前后RASSF1A基因甲基化狀態(tài)及表達(dá)的變化，可以看出異常甲基化是卵巢癌細(xì)胞RASSF1A基因失活的主要原因，去甲基化藥物Zeb通過逆轉(zhuǎn)RASSF1A基因甲基化狀態(tài)，調(diào)控RASSF1A基因重新表達(dá)。新近研究[12]表明，結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29中DLC-1基因表達(dá)沉默與啟動子區(qū)高甲基化狀態(tài)有關(guān)。同時，在急性髓性白血病中RIZ1基因表達(dá)下降，其部分機制在于基因啟動子區(qū)甲基化[13]。這些研究表明，啟動子區(qū)異常甲基化是抑癌基因失活的主要機制，包括RASSF1A基因。由于RASSF1A能抑制細(xì)胞生長、促進細(xì)胞凋亡，通過去甲基化誘導(dǎo)RASSF1A抑癌基因重新表達(dá)可能是Zeb抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的原因之一。DNA甲基化靠DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)來維持，哺乳動物細(xì)胞中目前發(fā)現(xiàn)維持甲基化的DNMT1、重新甲基化的 DNMT3A和 DNMT3B 3種 DNMT[14]。Zeb是DNMT抑制劑，可能主要通過抑制DNMT1，來誘導(dǎo)因甲基化失活的抑癌基因異常甲基化區(qū)域去甲基化而重新表達(dá)。在膀胱癌細(xì)胞中已證實Zeb能誘導(dǎo)p16去甲基化及重新表達(dá)[15]。

綜上所述，本研究表明，啟動子區(qū)異常甲基化是卵巢癌細(xì)胞RASSF1A基因失活的主要原因，去甲基化藥物Zeb能逆轉(zhuǎn)RASSF1A基因甲基化狀態(tài)，調(diào)控RASSF1A基因重新表達(dá)，可能用于卵巢癌的臨床治療。

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