小肽轉(zhuǎn)運載體2在奶牛乳腺小肽攝取中的作用研究

周苗苗 吳躍明 劉紅云 趙 珂 劉建新

(浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，動物分子營養(yǎng)學(xué)教育部重點實驗室，杭州 310029)

小肽轉(zhuǎn)運載體2在奶牛乳腺小肽攝取中的作用研究

周苗苗 吳躍明*劉紅云 趙 珂 劉建新*

(浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，動物分子營養(yǎng)學(xué)教育部重點實驗室，杭州 310029)

本試驗旨在研究2型小肽轉(zhuǎn)運載體(oligopeptide transporter 2，PepT 2)在奶牛乳腺組織吸收利用小肽合成乳蛋白過程中的作用。在體外培養(yǎng)的奶牛乳腺組織培養(yǎng)液中分別添加不同濃度的苯丙氨酸二肽(Phe-Phe)(0和11.7μg/m L)和/或焦碳酸二乙酯(DEPC)(0、0.01、0.1、0.5和1.0 mmol/L)進行培養(yǎng)，試驗結(jié)束后收集乳腺組織和培養(yǎng)液分別用于基因表達和乳蛋白合成的檢測。結(jié)果表明，Phe-Phe促進了PepT 2和αs1－酪蛋白基因表達及乳蛋白合成(P＜0.05);隨DEPC添加濃度的升高，αs1－酪蛋白基因表達(P＜0.01)和乳蛋白合成(P＜0.05)顯著降低;0.5 mmol/L DEPC顯著降低了Phe-Phe組αs1－酪蛋白的基因表達(P＜0.05)和乳蛋白合成(P＜0.01)以及不添加小肽組乳蛋白合成(P＜0.05)，但不影響不添加小肽組αs1－酪蛋白基因表達(P＞0.05)。結(jié)果提示，奶牛乳腺能攝取Phe-Phe用于乳蛋白的合成，PepT 2可能在乳腺小肽攝取過程中發(fā)揮重要作用。

二肽;PepT 2;酪蛋白;DEPC;奶牛乳腺組織

隨著反芻動物蛋白質(zhì)和氨基酸營養(yǎng)研究的深入，小肽在反芻動物乳腺蛋白質(zhì)合成中的作用已引起重視。有研究表明，25%以上的乳蛋白合成原料來自于過瘤胃小肽［1］。除氨基酸之外，乳腺組織很可能直接攝取和利用血液中的小肽和多肽作為合成酪蛋白等的前體物質(zhì)。研究證實，給體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)液中添加適當濃度的蛋氨酸或賴氨酸小肽能促進酪蛋白的基因表達和乳蛋白合成［2－4］。然而，泌乳反芻動物乳腺對小肽的攝取和利用是一個較復(fù)雜的過程，其具體機制還不清楚。乳腺上皮細胞如何攝取并利用小肽方面，目前仍沒有定論。有研究用反轉(zhuǎn)錄PCR和免疫化學(xué)的方法檢測到大鼠、人和奶牛的乳腺中均有2型小肽轉(zhuǎn)運載體(oligopeptide transporter 2，PepT 2)表達［5－6］，這為進一步研究乳腺對小肽的攝取機制提供了基礎(chǔ)。哺乳動物PepT 2是一種高親和力低容量的小肽轉(zhuǎn)運載體，它利用電子梯度逆濃度轉(zhuǎn)運短鏈肽和肽結(jié)構(gòu)類似物到各種細胞內(nèi)，主要在腎臟上皮細胞內(nèi)表達［7］。PepT 2蛋白由12個跨膜域組成，包含幾個保守的組氨酸(His)殘基，這些His殘基與其結(jié)合轉(zhuǎn)運H+/小肽相關(guān)，對維持蛋白質(zhì)正常功能必不可少［8－9］。另有研究報道，His變性劑焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)能完全阻斷大鼠腎近曲小管細胞(SKPT)對二肽的吸收［10］。因此，本試驗旨在通過研究小肽和DEPC對PepT 2基因表達以及乳蛋白合成的影響，試圖揭示PepT 2在奶牛乳腺小肽攝取過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 奶牛乳腺組織體外培養(yǎng)

取泌乳中期的中國荷斯坦奶牛乳腺組織，清洗并剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小。將組織塊種植于6孔板上(Corning，USA)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)。待組織貼壁后每孔添加2 m L培養(yǎng)液。培養(yǎng)液成分為:基礎(chǔ)培養(yǎng)液DMEM(dulbecco’s modified Eagle’s medium)-F12(Gibco，USA)添加1%谷氨酰胺、100 IU/m L青霉素、100μg/m L鏈霉素、5μg/m L胰島素(Sigma，USA)、500 ng/m L 催乳素(Sigma，USA)、1μg/m L氫化可的松(Sigma，USA)以及10%的胎牛血清(FCS)(杭州四季青)。

1.2 試驗設(shè)計

試驗處理培養(yǎng)液中去除胎牛血清、補充幾種必需氨基酸(表1)，并按以下試驗設(shè)計調(diào)整相應(yīng)氨基酸和小肽的濃度。

表1 培養(yǎng)液中幾種必需氨基酸的最終濃度Table 1 Final concentrations of several essential am ino acids in medium μg/m L

1.2.1 苯丙氨酸二肽等量替代10%總游離苯丙氨酸

以培養(yǎng)液中Phe總量(117μg/m L)10%的二肽結(jié)合Phe(Phe-Phe，純度＞98%，杭州中肽)替代等量的Phe作為試驗培養(yǎng)液孵育乳腺組織48 h。

1.2.2 不同濃度DEPC的添加

在含有10%Phe-Phe(11.7μg/m L)的培養(yǎng)液中分別添加 0、0.01、0.1、0.5 和 1.0 mmol/L 的DEPC用于奶牛乳腺組織的培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24 h。

在不含小肽和含10%Phe-Phe(11.7μg/m L)的培養(yǎng)液中分別添加0和0.5 mmol/L DEPC(由上述試驗得出)用于奶牛乳腺組織的培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24 h。

試驗結(jié)束后，收集乳腺組織和培養(yǎng)液分別用于總RNA的提取和總?cè)榈鞍缀康臏y定。每個試驗重復(fù)3次。

1.3 RNA提取和cDNA合成

用Trizol(Invitrogen，USA)提取乳腺組織中的總RNA。RNA純度以紫外吸光法檢測(OD260nm/OD280nm＞1.80)。抽提的 RNA溶解后立即用于第1鏈cDNA的合成(PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Takara)。合成的cDNA貯存于－20℃冰箱中，備用。

1.4 實時熒光定量PCR(real-tim e PCR)

用實時熒光定量PCR的方法檢測mRNA的表達。αs1－酪蛋白、PepT 2和甘油醛－3－磷酸脫氫酶(GAPDH)的實時熒光定量專用引物見表2。PCR反應(yīng)在96孔板中進行，反應(yīng)體系為2μL cDNA模板加18μL PCR反應(yīng)液(SYBRPrem ix Ex TaqTMReal Time PCR試劑盒，Takara)。用三蒸水替代cDNA模版作為陰性對照。反應(yīng)條件如下:95 ℃，10 s;95 ℃，5 s，40 個循環(huán);60 ℃，34 s。ABI－7500實時定量序列檢測軟件(Applied Biosystems，USA)自動讀取 CT 值。PepT 2、αs1－ 酪蛋白和GAPDH的擴增效率分別為101%、100%和102%。mRNA相對變化值用公式2△△Ct進行計算。

1.5 DNA總量和培養(yǎng)液中總?cè)榈鞍缀繙y定

用Trizol提取組織中的總DNA。紫外吸光法測定DNA的純度(OD260nm/OD280nm＞1.80)和含量。DNA量的多少作為組織/細胞數(shù)量的代表用于校正培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)含量。

用冷的丙酮沉淀培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)，并將蛋白質(zhì)溶于含1 mmol EDTA的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中。隨后，根據(jù) Bradford［11］的方法，用蛋白質(zhì)檢測試劑盒(博士德，武漢)檢測培養(yǎng)液中總蛋白質(zhì)含量，并以此代表培養(yǎng)液中的乳蛋白含量。

以試驗組DNA校正乳蛋白含量［蛋白質(zhì)含量(mg)同DNA含量(μg)的比值］同對照組 DNA校正乳蛋白含量的比值作為最終結(jié)果進行比較。

1.6 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)用Excel軟件進行處理，用SAS 8.0軟件的 PROC-GLM 程序進行統(tǒng)計分析［12］，P＜0.05時差異顯著，P＜0.01時差異極顯著。

表2 實時熒光定量PCR引物Table 2 Oligonucleotide primer sets for real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 Phe-Phe等量替代10%游離Phe對乳蛋白合成的影響

結(jié)果顯示，以Phe-Phe替代培養(yǎng)液中10%的游離Phe(11.7μg/m L)顯著提高了乳腺組織中PepT 2和αs1－酪蛋白的mRNA水平以及培養(yǎng)液中乳蛋白的含量(P＜0.05)(圖1)。

圖1 Phe-Phe對PepT 2和αs1－酪蛋白基因表達及乳蛋白合成的影響Fig.1 Influence of Phe dipeptide on PepT 2 and αs1-casein gene expressions and m ilk protein synthesis

2.2 PepT 2功能抑制對乳腺小肽攝取和乳蛋白合成的影響

PepT 2功能抑制劑——DEPC的添加降低了乳腺組織中αs1－酪蛋白的mRNA豐度。其中，0.5和1.0 mmol/L DEPC 添加組 αs1－ 酪蛋白的基因表達水平均顯著低于對照組(P＜0.05，P＜0.01)(圖2);隨著 DEPC濃度的不斷升高，乳蛋白的合成逐漸降低。同對照組相比，0.1、0.5和1.0 mmol/L DEPC添加組培養(yǎng)液中乳蛋白的含量均顯著降低(P＜0.05)(圖3)。

圖2 DEPC濃度對αs1－酪蛋白基因表達的影響Fig.2 Influence of DEPC concentration on αs1-casein gene expression

圖3 DEPC濃度對乳蛋白合成的影響Fig.3 Influence of DEPC concentration on m ilk protein synthesis

不含小肽組添加0.5 mmol/L DEPC有降低乳腺組織中αs1－酪蛋白基因表達的趨勢(mRNA豐度降低23%)，但差異不顯著(P＞0.05);而10%Phe-Phe組添加0.5 mmol/L DEPC則顯著降低了乳腺組織中αs1－酪蛋白的基因表達，其降低幅度為29%(P＜0.05)(圖4)。

圖4 PepT 2功能抑制對αs1－酪蛋白基因的影響Fig.4 Influence of inhibition of PepT 2 function on αs1-casein gene expression

DEPC對乳蛋白合成的影響結(jié)果見圖5。添加0.5 mmol/L DEPC顯著降低了不含小肽組培養(yǎng)液中乳蛋白的含量(P＜0.05)，極顯著降低了10%Phe-Phe組培養(yǎng)液中乳蛋白的含量(P＜0.01)。其中，不含小肽組乳蛋白含量降低59%，而添加Phe-Phe組乳蛋白含量降低74%。

3 討論

研究證實泌乳小鼠乳腺外植體可以攝取完整形式的蛋氨酸(Met)二肽用于乳蛋白的合成［13］。眾多研究也表明奶牛乳腺可以攝取血液中存在的肽結(jié)合必需氨基酸作為乳蛋白合成的前體物［14－15］。Pan 等［16］比較了不同 Met二肽對奶牛乳腺上皮細胞(MAC-T)中乳蛋白合成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Met-Met、Met-Val和 Leu-Met的乳蛋白合成效率高于游離的 Met。W u等［4］研究結(jié)果也表明，同游離Met和Lys相比，添加Met和 Lys二肽能促進體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞中αs1－酪蛋白的基因表達。本試驗以Phe-Phe等量替代培養(yǎng)液中10%的游離Phe顯著促進了體外培養(yǎng)的乳腺組織中αs1－酪蛋白基因表達和乳蛋白合成，表明乳腺組織可以利用Phe-Phe合成乳蛋白，且利用效率高于等量的游離Phe。該結(jié)果同上述用其他小肽所得結(jié)論一致。同時，Phe-Phe的添加也提高了PepT 2的mRNA表達水平，提示該小肽轉(zhuǎn)運載體在乳腺小肽攝取方面可能發(fā)揮作用。

圖5 PepT 2功能抑制對乳蛋白合成的影響Fig.5 Influence of inhibition of PepT 2 function on m ilk protein synthesis

Brandsch等［10］利用大鼠SKPT表達高親和力載體PepT 2，研究了組氨酸抑制劑DEPC對PepT 2動力學(xué)參數(shù)Vmax、Km的影響。結(jié)果表明，在pH 7.5的環(huán)境下用DEPC處理后，SKPT細胞膜上的PepT 2失去結(jié)合 H+的能力，進而顯著抑制了SKPT對甘氨酸 －肌氨酸(glycylsarcosine，Gly-Sar)的吸收，但并不影響PepT 2和底物結(jié)合的Km值。本試驗為研究PepT 2在乳腺小肽攝取過程中的可能作用，以DEPC抑制PepT 2蛋白轉(zhuǎn)運功能來檢測其對αs1－酪蛋白基因表達和乳蛋白合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.5和1.0 mmol/L DEPC的添加顯著降低了αs1－酪蛋白基因表達和乳蛋白的合成。其機制可能是:小肽轉(zhuǎn)運載體蛋白的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合了DEPC使其蛋白質(zhì)變性，從而破壞了載體蛋白的的轉(zhuǎn)運功能，最終阻斷了乳腺通過小肽轉(zhuǎn)運載體對小肽的攝取，抑制了小肽對乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的促進作用。另外，DEPC還可以抑制植物細胞上的非選擇性陽離子通道(nonselective cation channel，NSCC)，是常用的NSCC抑制劑。為避免PepT 2功能抑制劑(DEPC)通過影響乳腺組織中其他離子通道和轉(zhuǎn)運載體來抑制乳蛋白合成，本試驗比較了不添加和添加 Phe-Phe的情況下，以0.5 mmol/L DEPC抑制PepT 2功能對乳腺組織中乳蛋白合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制PepT 2功能顯著降低了添加Phe-Phe組的αs1－酪蛋白基因表達，但不影響無小肽組的αs1－酪蛋白基因表達。就乳蛋白合成而言，抑制PepT 2功能顯著降低了2組的合成量。然而，添加Phe-Phe組乳蛋白合成量降低了74%，同不添加小肽組(乳蛋白降低59%)相比，添加二肽組乳蛋白合成受PepT 2功能抑制的影響更大。由此可見，無論乳腺組織中其他離子通道和轉(zhuǎn)運載體是否受 DEPC的影響，DEPC都通過破壞PepT 2蛋白功能抑制了乳腺中二肽的轉(zhuǎn)運，進而降低了αs1－酪蛋白基因的表達和乳蛋白的合成。因此，乳腺對小肽的攝取是通過或者至少部分通過PepT 2來實現(xiàn)的。

4 結(jié)論

①奶牛乳腺組織能夠利用Phe-Phe合成乳蛋白，且Phe-Phe用于乳蛋白合成的效率高于等量游離Phe。

②2型小肽轉(zhuǎn)運載體(PepT 2)在乳腺組織小肽攝取過程中發(fā)揮積極作用。

［1］CHEN G，SNIFFEN C J，RUSSELL JB.Concentration and estimated flow of peptides from the rumen of dairy cattle:effects of protein quantity，protein solubility，and feeding frequency［J］.Journal of Dairy Science，1987，70:983.

［2］楊金勇.蛋氨酸、賴氨酸及其二肽對奶牛乳腺上皮細胞酪蛋白αs1基因表達的影響［D］.碩士學(xué)位論文.杭州:浙江大學(xué)，2006.

［3］吳慧慧.必需氨基酸及蛋氨酸二肽供給模式對奶牛乳腺組織αs1酪蛋白合成的影響［D］.博士學(xué)位論文.杭州:浙江大學(xué)，2007.

［4］WU H H，YANG J Y，ZHAO K，et al.Effects of methionine-containing dipeptides on caseinαs1 expression in bovinemammary epithelial cells［J］.Journal of Animal Feed Science，2007，16(Suppl.2):7－12.

［5］GRONEBERG D A，DORING F，THEIS S，et al.Peptide transport in the mammary gland:expression and distribution of PEPT2 mRNA and protein［J］.The American Journal of Physiology:Endocrinology and Metabolism，2002，282:E1172－E1179.

［6］ZHOU M M，WU Y M，LIU H Y，et al.Effects of tripeptides and lactogenic hormones on oligopeptide transporter 2 in bovine mammary gland［J］.Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，doi:10.1111/j.1439 －0396.2010.01110.x

［7］周苗苗，吳躍明.小肽轉(zhuǎn)運載體2及其在乳腺泌乳中的作用［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2009，21(5):603－608.

［8］KLAPPER M，DANIEL H，DORING F.Cytosolic COOH term inus of the peptide transporter PEPT2 is involved in apicalmembrane localization of the protein［J］.The American Journalof Physiology:Cell Physiology，2006，290:C472－C483.

［9］FEIY J，LIUW，PRASAD PD.Identification of the histidyl residue obligatory for the catalytic activity of the human H+/peptide cotransporters PEPT1 and PEPT2［J］.Biochem istry，1997，36:452 －460.

［10］BRANDSCHA M，BRANDSCHA C，GANAPATHY M E.Influence of proton and essential histidyl residues on the transport kinetics of the H+/peptide cotransport systems in intestine(PEPT1)and kidney(PEPT2)［J］.Biophysica Acta，1997，1324:251 －262.

［11］BRADFORD M M.A rapid and sensitivemethod for the quantitation ofm icrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochem istry，1976，72:248－254.

［12］SAS Institute.SASUser’s Guide:Statistics.Version 8.01.Cary，NC.SAS Institute.Inc.，2000.

［13］WANG S，WEBB K E，AKERS M R.Peptidebound methionine can be a source of methionine for the synthesis of secreted proteins by mammary tissue explants from lactating m ice［J］.Journal of Nutrition，1996，126:1662－1672.

［14］REMOND D，BERNARD L，PONCET C.Free and peptide am ino acid net flux across the rumen and the mesenteric-and portal-drained viscera of sheep［J］.Journal of Animal Science，2000，78:1960－1972.

［15］TAGARI H，WEBB K，Jr，THEURER B，et al.Mammary uptake，portal-drained visceral flux，and hepatic metabolism of free and peptide-bound am ino acids in cows fed steam-flaked or dry-rolled sorghum grain diets［J］.Journal of Dairy Science，2008，91:679－697.

［16］PAN Y，BENDER PK，AKERSR M，etal.Methionine-containing peptides can be used as methionine sources for protein accretion in cultured C2C12 and MAC-T cells［J］.Journal of Nutrition，1996，126:232－241.

*Corresponding author，WU Yuem ing，professor，E-mail:ymwu@zju.edu.cn;LIU Jianxin，professor，E-mail:liujx@zju.edu.cn

(編輯 趙天章)

Role of O ligopeptide Transporter 2 in Bovine Mammary G land Phenylalanine Dipeptide Uptake

ZHOU Miaom iao WU Yuem ing*LIU Hongyun ZHAO Ke LIU Jianxin*
(Institute of Dairy Science，Ministry of Education Key Laboratory of Molecular Animal Nutrition，Zhejiang University，Hangzhou310029，China)

This experimentwas conducted to study the role of oligopeptide transporter 2 in small peptides uptake and m ilk protein synthesis in bovine mammary gland.Different doses of Phe dipeptide(0 and 11.7 μg/m L)and DEPC(0，0.01，0.1，0.5 and 1 mmol/L)were added to the culture medium of bovine mammary gland tissues.After incubated in the experimentalmedium，mammary tissues and medium were collected and used for gene expression and m ilk protein determ ination，respectively.The results showed that 1)Phe dipeptide increased oligopeptide transporter 2 andαs1-casein gene expression and m ilk protein quantity in themedium(P＜0.05);2)with increasing of DEPC dose，αs1-casein gene mRNA level(P＜ 0.01)and synthesis ofmilk protein(P＜0.05)were decreased;3)treatmentwith 0.5 mmol/L DEPC significantly decreased αs1-casein gene expression(P＜0.05)and synthesis of m ilk protein(P＜0.01)in Phe dipeptide group，and synthesis ofm ilk protein(P＜0.05)in free Phe group，but had no effect on αs1-casein genemRNA level(P＞0.05)in free Phe group.These results indicate that Phe dipeptide can be used for synthesis of m ilk protein by bovinemammary gland while PepT2 may play an important role in small peptides uptake by bovinemammary gland.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(8):1303-1308］

dipeptides;PepT 2;casein;DEPC;bovinemammary gland tissues

S823

A

1006-267X(2011)08-1303-06

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.08.008

2011－02－25

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2011CB100801);浙江省自然科學(xué)基金(Z305036)

周苗苗(1984—)，女，山東聊城人，博士研究生，從事奶牛乳腺氨基酸和小肽營養(yǎng)研究。E-mail:zhoumm0329@163.com

*通訊作者:吳躍明，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:ymwu@zju.edu.cn;劉建新，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:liujx@zju.edu.cn