自然霉變玉米對仔豬腸道微生態(tài)的影響

雷曉婭 陳代文 毛湘冰 毛 倩 陳 洪 張 玲 段緒東 余 冰

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)四川省重點(diǎn)實驗室，雅安 625014)

自然霉變玉米對仔豬腸道微生態(tài)的影響

雷曉婭 陳代文 毛湘冰 毛 倩 陳 洪 張 玲 段緒東 余 冰*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)四川省重點(diǎn)實驗室，雅安 625014)

本試驗旨在研究自然霉變玉米對仔豬生長性能、腸道形態(tài)和腸道微生物數(shù)量及其代謝產(chǎn)物的影響。15頭35日齡的PIC仔豬按體重相近的原則隨機(jī)分為3個處理，分別為對照組(飼喂玉米－豆粕型基礎(chǔ)飼糧)、霉變玉米組(飼喂由自然霉變玉米100%替代基礎(chǔ)飼糧中正常玉米的飼糧)和采食量配對組(飼喂基礎(chǔ)飼糧，采食量與霉變玉米組相同)，每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)1頭仔豬。試驗期21 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在試驗前2周，霉變玉米組仔豬的平均日增重和平均日采食量與對照組相比有降低的趨勢(P＞0.05)，而全期平均日增重顯著高于采食量配對組(P＜0.05)，料重比顯著低于采食量配對組(P＜0.05)。霉變玉米組仔豬空腸絨毛高度與隱窩深度的比值顯著低于對照組和采食量配對組(P＜0.05)，隱窩深度顯著高于采食量配對組(P＜0.05)。霉變玉米組仔豬第2周末直腸中乙酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量顯著低于采食量配對組(P＜0.05)。霉變玉米組仔豬第3周末盲腸中大腸桿菌數(shù)、乳酸桿菌數(shù)和丙酸含量顯著高于對照組(P＜0.05)，氨含量有提高的趨勢(P＞0.05)。結(jié)果表明，自然霉變玉米可損傷仔豬空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高仔豬盲腸中大腸桿菌數(shù)和乳酸桿菌數(shù)，改變仔豬腸道微生物區(qū)系，進(jìn)而影響仔豬健康。

霉變玉米;仔豬;生長性能;腸道菌群;代謝產(chǎn)物

玉米等飼料原料在田間及貯運(yùn)過程中均容易發(fā)生霉變，動物攝入含霉菌毒素的飼料后，會出現(xiàn)生產(chǎn)性能下降、胃腸道功能紊亂、機(jī)體氧化損傷、免疫抑制和抗病力減弱等毒性效應(yīng)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的危害。大量研究表明，霉菌毒素會降低動物的采食量和日增重［1－5］，同時，殘留在動物產(chǎn)品中的霉菌毒素及其代謝產(chǎn)物可以通過食物鏈危害人類的健康［6－7］。胃腸道既是養(yǎng)分消化吸收的主要部位，也是抵御攝入天然毒素的第1道屏障。有研究表明，霉菌毒素會損傷動物腸道結(jié)構(gòu)，降低養(yǎng)分消化吸收［8］。動物消化道內(nèi)存在大量微生物，腸道微生物區(qū)系的平衡對于動物的健康起著非常重要的作用。但動物攝入被霉菌毒素污染的飼糧后，霉菌毒素對腸道微生物區(qū)系有什么樣的影響，還未見報道。因此，本試驗旨在從腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和微生態(tài)環(huán)境變化2個方面考察自然霉變玉米對仔豬生長性能和腸道健康的影響，并通過采食量配對組的設(shè)定來進(jìn)一步剖析效應(yīng)產(chǎn)生的可能原因。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

15頭35日齡的PIC仔豬按體重相近的原則隨機(jī)分為3個處理，分別為對照組(飼喂正常玉米－豆粕型基礎(chǔ)飼糧)、霉變玉米組(飼喂由自然霉變玉米100%替代基礎(chǔ)飼糧中正常玉米的飼糧)和采食量配對組(飼喂基礎(chǔ)飼糧，飼喂量與霉變玉米組相同)，每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)1頭仔豬。試驗期21 d。

霉變玉米為自然霉變所得，經(jīng)檢測主要為黃曲霉毒素B1(AFB1)污染，含量為216.52μg/kg;其營養(yǎng)成分為:粗蛋白質(zhì) 12.42%、能量16.90 MJ/kg、鈣 0.028 7% 和磷 0.302 7%。

1.2 試驗飼糧

基礎(chǔ)飼糧(玉米－豆粕型)參照美國 NRC(1998)5～10 kg仔豬的營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)配制為粉料。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。將基礎(chǔ)飼糧中正常玉米用霉變玉米100%替代后構(gòu)成霉變玉米組飼糧。

1.3 飼養(yǎng)管理

試豬飼養(yǎng)于代謝籠中，自由飲水，每天飼喂4次(08:00、12:00、16:00 和20:00)。每次以采食后料槽略有少量余料為度，采食量配對組每次均少量供給，推遲2 h等霉變玉米組采食完成后計算出采食量，再結(jié)算補(bǔ)給應(yīng)給予的飼料量。試驗期間每天記錄采食量。豬舍溫度控制在26～28℃。消毒按常規(guī)程序進(jìn)行。

1.4 樣品采集

1.4.1 飼料樣品

按照國標(biāo)(GB/T 14699.1—2005)《飼料采樣法》的要求分別采集粉碎后的霉變玉米、正常玉米以及不同處理的飼糧各1 kg，再按照四分法將樣品減少到200 g，于－20℃冰箱保存待測。

1.4.2 十二指腸和空腸

在試驗第22天早上仔豬麻醉致死剖解后，分離腸道，用生理鹽水沖洗干凈，剪取十二指腸和空腸前段3～4 cm，放入10%中性福爾馬林固定液中，待測腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4.3 后腸內(nèi)容物

在試驗第15天早上喂料后2 h，用無菌棉簽刺激仔豬肛門，收集仔豬直腸內(nèi)容物;在試驗第22天喂料后2 h進(jìn)行麻醉剖解，于冰面上收集盲腸和直腸內(nèi)容物。所有內(nèi)容物液氮速凍后轉(zhuǎn)入－70℃冰箱貯存，待測腸道微生物數(shù)量及代謝產(chǎn)物含量。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 飼料中霉菌毒素含量

采用酶聯(lián)免疫法測定霉變玉米和正常玉米以及各處理飼糧中黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的含量。按照ROMER試劑盒說明書進(jìn)行測定。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(as-fed basis) %

1.5.2 生長性能

試豬于試驗起始、第15天和第22天早上空腹稱重，計算各階段平均日增重(ADG);每天結(jié)算采食量，計算各階段平均日采食量(ADFI);根據(jù)平均日增重和平均日采食量計算料重比(F/G)。

1.5.3 腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)

將置于10%中性福爾馬林固定液中的十二指腸和空腸組織經(jīng)脫水、浸蠟、包埋和切片等處理，再經(jīng)蘇木精－伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。每個樣品均選擇8個典型的視野(絨毛完整及走向平直)測定十二指腸和空腸絨毛高度和隱窩深度，計算絨毛高度與隱窩深度比值。樣品在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實驗室測定。

1.5.4 后腸內(nèi)容物微生物數(shù)量

按照OMEGA試劑盒說明書提取盲腸和直腸內(nèi)容物DNA，采用本試驗室Qi等［9］建立的熒光定量PCR方法測定并計算盲腸和直腸中大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌以及總菌數(shù)量。各菌PCR引物和探針序列見表 2，PCR反應(yīng)體系見表 3。SYBR Prem ix Ex Taq購自 TaKaRa，Real Master Mix(Probe)購自TIANGEN?？偩鶳CR擴(kuò)增程序為95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ～64 ℃ 25 s，39個循環(huán);大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌PCR擴(kuò)增程序均為95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ～64 ℃ 25 s，49 個循環(huán)。

表2 各菌PCR引物和探針序列Table 2 Sequences of primers and probe for PCR of bacteria

表3 各菌PCR反應(yīng)體系Table 3 PCR reaction system of bacteria μL

1.5.5 后腸內(nèi)容物微生物代謝產(chǎn)物含量

第2周末直腸及第3周末盲腸和直腸內(nèi)容物的揮發(fā)性脂肪酸含量采用氣相色譜法測定，氨含量采用比色法測定，揮發(fā)性脂肪酸和氨含量測定的具體操作步驟參照陳洪［10］的方法進(jìn)行;乳酸采用化學(xué)比色法測定，具體操作參照南京建成試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，數(shù)據(jù)處理與分析采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件，將對照組和霉變玉米組以及霉變玉米組和采食量配對組分別進(jìn)行t檢驗，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 霉菌毒素含量

玉米及飼糧霉菌毒素含量見表4?？梢?，霉變玉米主要受黃曲霉毒素B1污染，含量超標(biāo)，進(jìn)而導(dǎo)致霉變玉米組飼糧黃曲霉毒素B1也超標(biāo)，而脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮可檢出，但含量未超標(biāo)。

表4 飼料中主要霉菌毒素含量(飼喂基礎(chǔ))Table 4 M ycotoxin contents in diets(as-fed basis) μg/kg

2.2 不同處理對仔豬生長性能的影響

不同處理對仔豬生長性能的影響結(jié)果見表5。與對照組相比較，霉變玉米組仔豬的平均日增重和平均日采食量在試驗前2周及全期均有降低的趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)。而與采食量配對組相比，霉變玉米組仔豬的全期平均日增重顯著增加(P＜0.05)，全期料重比則顯著降低(P＜0.05)。

表5 不同處理對仔豬生長性能的影響Table 5 Effects of different treatments on growth performance of piglets

2.3 不同處理對仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

不同處理對仔豬腸道形態(tài)的影響結(jié)果見表6。與對照組相比，霉變玉米組仔豬空腸絨毛高度與隱窩深度的比值顯著降低(P＜0.05);與采食量配對組相比，霉變玉米組仔豬空腸絨毛高度以及絨毛高度與隱窩深度均顯著降低(P＜0.05)，隱窩深度顯著提高(P＜0.05)。

表6 不同處理對仔豬腸道形態(tài)的影響Table 6 Effects of different treatments on the intestinalmorphology of piglets μm

2.4 不同處理對仔豬后腸微生物數(shù)量的影響

不同處理對仔豬后腸菌群的影響結(jié)果見表7。與對照組相比，霉變玉米組仔豬第3周末直腸內(nèi)容物乳酸桿菌數(shù)以及盲腸內(nèi)容物大腸桿菌數(shù)和乳酸桿菌數(shù)均顯著提高(P＜0.05);與采食量配對組相比，霉變玉米組仔豬的直腸和盲腸內(nèi)容物中各菌數(shù)均無顯著差異(P＞0.05)。

表7 不同處理對仔豬后腸菌群的影響Table 7 Effects of different treatments on intestinal flora of piglets

續(xù)表7

2.5 不同處理對仔豬后腸微生物代謝產(chǎn)物的影響

不同處理對仔豬后腸微生物代謝產(chǎn)物的影響結(jié)果見表8。與對照組相比，霉變玉米組仔豬第3周末直腸和盲腸內(nèi)容物中丙酸含量及直腸內(nèi)容物中丁酸含量均顯著提高(P＜0.05);第3周末直腸內(nèi)容物氨含量及盲腸內(nèi)容物中乳酸含量均有提高的趨勢(P＞0.05)。與采食量配對組相比，霉變玉米組仔豬的第2周末直腸內(nèi)容物乙酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量顯著降低(P＜0.05)，第3周末盲腸內(nèi)容物中丙酸含量顯著提高(P＜0.05);第3周末直腸和盲腸內(nèi)容物氨含量均有提高的趨勢(P＞0.05)。

表8 不同處理對仔豬后腸微生物代謝產(chǎn)物的影響Table 8 Effects of different treatments on metabolic products of intestinalm icroorganism s in piglets

續(xù)表8

3 討論

3.1 不同處理對仔豬生長性能的影響

本試驗所用自然霉變玉米主要以黃曲霉毒素B1(168.66μg/kg)污染為主。黃曲霉毒素會抑制豬的生長發(fā)育，導(dǎo)致免疫器官發(fā)育受阻，抑制免疫功能，損害生殖功能等。Harvey等［11］研究發(fā)現(xiàn)2.5 mg/kg黃曲霉毒素組生長豬體增重顯著低于對照組;Schell等［12］研究發(fā)現(xiàn)922 μg/kg黃曲霉毒素可極顯著降低仔豬平均日采食量和平均日增重;史瑩華等［13］報道0.1 mg/kg黃曲霉毒素可導(dǎo)致生長豬平均日增重極顯著降低12.90%，料重比極顯著提高7.54%。本試驗也發(fā)現(xiàn)與對照組相比，自然霉變玉米組飼糧導(dǎo)致仔豬平均日增重和平均日采食量的降低，但與采食量配對組相比，霉變玉米組仔豬平均日增重增加，料重比降低。該結(jié)果表明，在本試驗條件下自然霉變玉米導(dǎo)致仔豬平均日增重的降低主要是降低了平均日采食量。馮光德［5］研究發(fā)現(xiàn)在1～7 d、8～14 d和1～14 d，自然霉變玉米組肉鴨平均日增重較采食配對組分別極顯著增加了4.63%、18.25%和13.83%;霉變玉米組肉鴨全期料重比較正常玉米組和采食配對組分別極顯著降低了4.90%和5.56%。此外，葉濤［14］用含嘔吐毒素為主的自然霉變玉米飼喂生長肥育豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生長育肥豬的飼料轉(zhuǎn)化效率因霉變玉米的使用而得以改善(即料重比降低)。產(chǎn)生上述結(jié)果的可能原因包括2個方面:一方面玉米自然霉變過程中可能產(chǎn)生一些未知成分，如蛋白酶和淀粉酶等消化酶，使得可溶性糖和還原糖含量提高，進(jìn)而對仔豬產(chǎn)生一定的促生長作用［15］;另一方面，采食量配對組仔豬因采食量的受限可能導(dǎo)致維持需要的增加，從而使采食量配對組仔豬的料重比增加。

3.2 不同處理對仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

小腸是消化道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的主要部位。小腸絨毛主要負(fù)責(zé)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，絨毛高度越高說明成熟細(xì)胞越多，吸收功能越強(qiáng);隱窩深度反映細(xì)胞的生成率，隱窩深度越淺，說明細(xì)胞成熟率上升，分泌功能增強(qiáng)［16］。絨毛高度與隱窩深度的比值綜合反映了小腸的吸收功能，比值越大養(yǎng)分吸收能力越強(qiáng)。蘇軍［8］研究發(fā)現(xiàn)隨飼糧中霉變玉米替代比例的增加，仔豬十二指腸和空腸前段的絨毛高度呈顯著線性或二次曲線降低，十二指腸前段隱窩呈顯著線性加深，空腸前段隱窩呈顯著線性或二次曲線加深。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，霉變玉米顯著降低空腸絨毛高度以及絨毛高度與隱窩深度比值，顯著增加隱窩深度，表明自然霉變玉米能損傷仔豬空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，與前人研究結(jié)果一致。空腸結(jié)構(gòu)的損傷將抑制養(yǎng)分的吸收，進(jìn)而影響霉變玉米組仔豬的生長性能。

3.3 不同處理對仔豬腸道菌群和微生物代謝產(chǎn)物的影響

正常動物的腸道微生物區(qū)系處于動態(tài)平衡中。健康仔豬從十二指腸到結(jié)腸，雙歧桿菌、乳桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、類桿菌、梭菌和腸球菌8種細(xì)菌數(shù)量都隨腸段后移而逐漸增加［17－18］。在腸道中，揮發(fā)性脂肪酸主要來源于梭形桿菌等厭氧菌對碳水化合物和未消化蛋白質(zhì)的發(fā)酵［19］，氨是腸道腐敗菌分解未消化的蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的［20］。

動物攝入含黃曲霉毒素B1的食物后，約有50%黃曲霉毒素B1在十二指腸被吸收，未被吸收的黃曲霉毒素B1進(jìn)入后腸，若腸道黏膜受損，則病原微生物較易定植，且因形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收可能受限，致使進(jìn)入后腸的營養(yǎng)物質(zhì)增多，造成微生物發(fā)酵異常。當(dāng)肝臟結(jié)構(gòu)功能異常時，腸道微生態(tài)環(huán)境也將遭到破壞。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)自然霉變玉米飼糧提高仔豬第3周末盲腸內(nèi)容物大腸桿菌數(shù)、乳酸桿菌數(shù)和丙酸含量以及直腸內(nèi)容物乳酸桿菌數(shù)、丙酸和丁酸含量，氨含量有提高的趨勢。可能是由于霉菌毒素造成仔豬腸道受損，進(jìn)入后腸養(yǎng)分增加，被乳酸桿菌和大腸桿菌利用，促進(jìn)其數(shù)量及代謝產(chǎn)物丙酸的增加。結(jié)果表明，本試驗條件下，霉變玉米飼糧會改變仔豬后腸菌群結(jié)構(gòu)，而變化的原因及帶來的可能影響有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

自然霉變玉米(含168.66μg/kg黃曲霉毒素B1)有降低仔豬平均日采食量和平均日增重的趨勢，并可損傷空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高盲腸大腸桿菌數(shù)和乳酸桿菌數(shù)，改變腸道微生物區(qū)系。

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*Corresponding author，associate professor，E-mail:ybingtian@yahoo.com.cn

(編輯 陳 鑫)

Effects of Maize Contam inated with Naturally-Occuring M ycotoxins on Intestinal Microecology in Piglets

LEIXiaoya CHEN Daiwen MAO Xiangbing MAO Qian CHEN Hong ZHANG Ling DUAN Xudong YU Bing*
(Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University，Key Laboratory for Animal Disease-resistance Nutrition of China Ministry of Education，Ya’an625014，China)

This experiment was conducted to study the effects of maize contam inated with naturally-occuring mycotoxins on growth performance，intestinalmorphology，intestinalm icrobial populations and theirmetabolic products in piglets.Fifteen PIC piglets(35 days of age)were random ly allocated to 3 dietary treatments with 5 replicates per treatment and 1 piglet per replicate.Piglets in group 1 were fed a basal diet(normalmaize，control group);piglets in group 2 were fed the dietwith contam inated maize(normalmaize in the group 1 was 100%replaced bymycotoxin-contam inatedmaize，contaminatedmaize group);group 3 was a pair-fed group.For the pair-fed group，the basal dietwas pair-fed to piglets at the level of feed intake of piglets fed the contam inated maize diet.The trial lasted for 21 d.The results showed that contam inated maize trended to decrease the arerage daily gain(ADG)and arerage daily feed intake(ADFI)compared with the control group during the first two weeks(P＞0.05)，whereas during thewhole trial period，ADG in the contam inated maize group was significantly higher and feed/gain ratio(F/G)was significantly lower than those in the pair-fed group(P＜0.05).The ratio of villus height to crypt depth of jejunum in the contam inated maize group was significantly lower than that in the control and pair-fed group(P＜0.05)，and the crypt depth was significantly higher than that in the pair-fed group(P＜0.05).Compared with the pair-fed group，the levels of acetic acid and total volatile fatty acids in rectum contents in the contam inated maize group were decreased significantly on the second weekend(P＜0.05).On the third weekend，the number ofEscherichia coliandLactobacillusand the level of propionic acid in cecum contents in the contam inated maize group were significantly higher than those in the control group(P＜0.05)，and the concentration of ammonia trended to be increased(P＞0.05).In conclusion，maize naturally contam inated with mycotoxins can damage mucosal morphology of jejunum，increase the number ofEscherichia coliandLactobacillusin cecum contents，break the balance of intestinal flora，and then influence the health of piglets.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(10):1790-1799］

maize contam inated with naturally-occuring mycotoxins;piglets;growth performance;intestinal flora;metabolic products

S828

A

1006-267X(2011)10-1790-10

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.10.020

2011－04－13

四川省科技支撐計劃“生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)鏈關(guān)鍵技術(shù)研究與集成示范”(09ZC1292)

雷曉婭(1986—)，女，四川什邡人，碩士研究生，從事豬的營養(yǎng)研究。E-mail:leixiaoya11@163.com

*通訊作者:余 冰，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail:ybingtian@yahoo.com.cn