殼聚糖對大腸桿菌攻毒仔豬生長性能和免疫力的影響

肖定福 唐志如 印遇龍 張 彬 馮澤猛 冉茂良

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128;2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125;3.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶 400715)

殼聚糖對大腸桿菌攻毒仔豬生長性能和免疫力的影響

肖定福1，2唐志如2，3*印遇龍2張 彬1馮澤猛2冉茂良1

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128;2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125;3.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶 400715)

本試驗旨在探討飼糧中添加殼聚糖對早期斷奶仔豬生長、腹瀉和免疫力的影響。試驗選擇50頭21日齡、平均體重(6.62±0.59)kg的斷奶仔豬，隨機(jī)分為5組，每組10個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。預(yù)試期采用大腸桿菌攻毒(1×109個細(xì)胞/頭)，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加50 mg/kg金霉素和200、300、400 mg/kg殼聚糖。試驗期21 d。結(jié)果表明:1)與對照組相比，各試驗組平均日采食量提高(P＞0.05)，料重比和腹瀉率降低，平均日增重分別提高了 15.8%、9.2%、16.8%和21.1%(P＞0.05)。2)與對照組相比，各殼聚糖組血清免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)水平以及回腸黏膜白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA相對表達(dá)量均升高，金霉素組均下降，其中300和400 mg/kg殼聚糖組的血清IgG和IgM水平與金霉素組差異顯著(P＜0.05)，400 mg/kg殼聚糖組血清IgG水平還與對照組差異顯著(P＜0.05)，殼聚糖組IL-1β和TNF-αmRNA相對表達(dá)量與金霉素組差異顯著(P＜0.05)，300和400 mg/kg殼聚糖組IL-6 mRNA表達(dá)量與金霉素組差異顯著(P＜0.05)。結(jié)果提示，飼糧中添加殼聚糖能促進(jìn)仔豬生長，降低腹瀉率，提高非特異性免疫力，且作用效果隨飼糧中殼聚糖濃度的增加有增強(qiáng)的趨勢。

殼聚糖;仔豬;生長性能;免疫力;細(xì)胞因子

畜產(chǎn)品安全性己受到全球范圍日益廣泛的關(guān)注，禁止使用抗生素添加劑成為一種必然的趨勢，研究和開發(fā)無污染、無公害、無殘留的新型綠色添加劑來替代飼用抗生素已成為當(dāng)今動物營養(yǎng)領(lǐng)域研究的熱點之一。殼聚糖帶正電荷，具有良好的生物相容性、無毒、無免疫抗原性、無刺激性及可降解性等特點［1］。殼聚糖的溶解性與其分子量和脫乙酰度有關(guān)，適當(dāng)?shù)头肿恿亢透呙撘阴６鹊臍ぞ厶窃跈C(jī)體內(nèi)可被胃酸、溶菌酶、卵磷脂分解酶等降解，降解過程中產(chǎn)生的低分子寡聚糖大部分能被機(jī)體吸收［2］。因殼聚糖具有抗菌［3－4］、增強(qiáng)免疫［5］、抗氧化［6］及促生長［7－8］等作用，在生物學(xué)領(lǐng)域被廣闊的研究應(yīng)用。殼聚糖以豐富的資源及優(yōu)良的性質(zhì)為其在飼料中的運(yùn)用創(chuàng)造了良好的條件。在我國，殼聚糖作為豬飼料添加劑的研究還處于探索階段。本研究就飼糧中添加不同水平殼聚糖對21日齡斷奶仔豬平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)、腹瀉率、血清免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)水平以及回腸黏膜白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA表達(dá)量的影響進(jìn)行研究，以探討飼糧中添加殼聚糖對早期斷奶仔豬生長性能和免疫力的調(diào)控效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

殼聚糖，由中科院大連化學(xué)物理研究所提供，經(jīng)本實驗室純化，用酸堿滴定法［9］測得其脫乙酰度(D.D)為91.25%，分子量22 ku，外觀為淡黃色粉末。

試驗用攻毒大腸桿菌(E.coli)菌株為3種導(dǎo)致仔豬下痢的大腸桿菌典型病原菌株，其血清型分別為E.coli09、0141、064，從中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所選購。每種菌株在LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12 h，以適應(yīng)環(huán)境達(dá)到生長平臺期，按1∶1∶1混合后，于預(yù)試期第4天按每頭豬總大腸桿菌1×109個細(xì)胞給服，分早晚2次給服。

1.2 試驗動物及試驗設(shè)計

選購胎次相近，平均體重(6.62±0.59)kg的21日齡健康“杜×長×大”三元雜交去勢斷奶仔豬50頭，隨機(jī)分為5組，每組10個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬，單欄飼養(yǎng)。

試驗采用單因素完全隨機(jī)分組試驗設(shè)計，分為5個組，對照組(A組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加50 mg/kg金霉素(B組)和200、300、400 mg/kg殼聚糖(C 組、D 組、E 組)。預(yù)試期7 d，正試期21 d。

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1998)斷奶仔豬營養(yǎng)需要配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在全封閉高床豬舍進(jìn)行，每日于08:00、12:00和18:00共投料3次，自由飲水，次日清晨稱剩余料重。

1.4 樣品采集

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后50頭仔豬清晨空腹用前腔靜脈采血10 m L于真空采血管中，編號后分離血清，每個血樣用1.5 m L Eppendorf管分裝成5份，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜跍y定血清生化指標(biāo)。

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，5個組各隨機(jī)取6頭仔豬準(zhǔn)備待宰，將待宰的30頭仔豬剖殺前12 h禁食，采用頸靜脈放血的方法處死，打開腹腔，取出回腸，用冰浴的PBS溶液沖洗外壁和內(nèi)容物。取回腸中段50 cm，沿縱軸剪開腸道，用玻片刮下黏膜，編號后用錫箔紙包裹，迅速浸入液氮中，轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于測定回腸黏膜 IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA相對表達(dá)量。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis) %

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 生長指標(biāo)

正試期第1天08:00空腹稱重并記錄(始重)，正試期第22天08:00空腹稱重并記錄(末重)。記錄正試期所耗飼糧重，計算ADG、ADFI及F/G，正試期每次喂料時觀察糞便，稀軟糞判為腹瀉。

腹瀉率(%)=100×腹瀉仔豬頭次/仔豬總頭次。

1.5.2 血清生化指標(biāo)

采用免疫投射比濁法檢測血清中IgM和IgG水平，試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.5.3 回腸黏膜 IL-1β、IL-6 和 TNF-α mRNA相對表達(dá)量

熒光定量PCR(Real-time PCR)法檢測回腸黏膜IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA相對表達(dá)量。

將－80℃保存的仔豬空腸和回腸黏膜樣品置于盛有液氮的研缽中研成粉末，分裝到1.5 m L的Eppendorf管中，每管50 mg左右，加1 m L Trizol(Invitrogen公司)，凍存于－80℃冰箱備用。根據(jù)豬3－磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease，GAPDH)、IL-1β、IL-6 和 TNF-αmRNA的基因序列，用 Primer Prem ier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物。并用NCBI中Blast初步檢測引物的特異性。引物由寶生物(大連)工程有限公司合成。各引物序列見表2。

表2 仔豬IL-1β、IL-6、TNF-α和GAPDH m RNA引物序列Table 2 Primer Sequences of IL-1β，IL-6，TNF-α and GAPDH genes

RNA提取:按照 Trizol說明提取組織總RNA，并用核酸測定儀測量OD值，OD260/280在1.8～2.2的樣品用于下一步試驗，并將RNA稀釋到1μg/μL，分裝 －80℃保存?zhèn)溆?。cDNA合成按Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

每個樣品做2個重復(fù)，Real-time PCR反應(yīng)體系(10μL):cDNA 1 μL，SYBR(2×)5 μL，ROX 0.2 μL，Primer S(10 μmol)0.2 μL，Primer A(10 μmol)0.2 μL，DEPC-H2O 3.4 μL。反應(yīng)程序:95℃，30 s;95℃，5 s;60℃，30 s;40個循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.1統(tǒng)計軟件GLM程序進(jìn)行方差分析，差異顯著性分析用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;基因表達(dá)量分析以內(nèi)參為對照，采用2－△△Ct法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 殼聚糖對仔豬生長性能及腹瀉率的影響

由表3可見，各組ADG和ADFI平均值高低順序都為E組＞D組＞B組＞C組＞A組，各組間差異不顯著(P＞0.05)，其中ADG平均值E組、D組、B組和C組分別比A組提高21.1%、16.8%、15.8%和9.2%;各組F/G平均值高低順序為 A組＞C組＞D組＞B組＞E組，其中A組與B組、D組、E組差異顯著(P＜0.05)，其余各組間無顯著性差異(P＞0.05)。這說明飼糧中添加殼聚糖能促進(jìn)仔豬生長，提高采食量，降低F/G，作用效果與殼聚糖添加劑量的增大有增強(qiáng)的趨勢，添加400 mg/kg殼聚糖組促生長效果優(yōu)于金霉素組。

各組仔豬試驗開始前腹瀉率為0，大腸桿菌攻毒后腹瀉率為100%。試驗期間各組仔豬腹瀉情況如圖1所示，A組仔豬腹瀉率下降緩慢，到飼養(yǎng)試驗結(jié)束時仍有4頭仔豬處于腹瀉狀態(tài)，B組仔豬腹瀉率前期下降速率高于3個殼聚糖組，但8 d后比E組下降慢，10 d后比D組下降慢，14 d后一直有2頭仔豬處于腹瀉狀態(tài)，而C組17 d后僅1頭豬腹瀉，D組和 E組分別于16、14 d后無腹瀉仔豬。

表3 仔豬生長性能Table 3 The growth performance of weanling pigs

圖1 仔豬腹瀉率Fig.1 The diarrhea ratio of weanling pigs

2.2 仔豬血清IgM和IgG水平測定結(jié)果

由表4可見，金霉素組IgM和IgG水平與對照組相比有所下降，殼聚糖組IgM和IgG水平與對照組相比均有不同程度的提高，D組和E組IgM 水平與B組差異顯著(P＜0.05)，E組IgG水平與A組和B組均差異顯著(P＜0.05)，D組IgG水平與B組差異顯著(P＜0.05)。

2.3 仔豬回腸黏膜IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA相對表達(dá)量

如圖2所示，仔豬回腸黏膜 IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA相對表達(dá)量C組、D組、E組與對照組相比均有不同程度的升高，B組比對照組有所下降。其中IL-1βmRNA相對表達(dá)量B組與其他4組差異顯著(P＜0.05);IL-6 mRNA相對表達(dá)量D組、E組與 B組差異顯著(P＜0.05);TNF-α mRNA相對表達(dá)量C組、D組、E組與B組差異顯著(P＜0.05)。結(jié)果說明，與對照組相比，仔豬飼糧中添加殼聚糖引起回腸黏膜中 IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)量增加，但未引起大量增加。

表4 仔豬血清IgM和IgG水平Table 4 The serum IgMand IgG levels of weanling pigs

3 討論

3.1 殼聚糖對仔豬機(jī)體免疫力的影響

在體液免疫中，IgG、IgM和免疫球蛋白 A(IgA)濃度的大小代表體液免疫功能的水平，濃度大時代表體液免疫功能強(qiáng)。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白抗體，約占血清免疫球蛋白總量的85%，在動物體內(nèi)不僅含量高，而且持續(xù)時間長，是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體，也是動物機(jī)體抗感染免疫的主力。本研究表明，飼糧中添加200、300和400 mg/kg殼聚糖均可提高21日齡斷奶仔豬血清中IgG和IgM水平，而金霉素組IgG和IgM水平降低，添加300和400 mg/kg殼聚糖組與金霉素組還存在顯著性差異，說明隨仔豬飼糧中殼聚糖添加濃度增大血清中IgG和IgM水平有上升趨勢。

圖2 仔豬回腸黏膜IL-1β、IL-6、TNF-a mRNA相對表達(dá)量Fig.2 The relative expression levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αmRNA in the ileum mucosa of weanling pigs

消化道黏膜免疫系統(tǒng)在抵御病原菌的入侵，維護(hù)機(jī)體的健康方面起著非常重要的作用。在細(xì)胞免疫中，白介素1(IL-1)主要由巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生，具有活化血管內(nèi)皮、組織損傷、發(fā)熱、淋巴細(xì)胞活化和誘導(dǎo)急性期蛋白質(zhì)合成等活性。IL-6和TNF-α是被激活的巨噬細(xì)胞分泌的2種重要的細(xì)胞因子，IL-6可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖并參與T淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)、自然殺傷(NK)細(xì)胞和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)的活化。IL-1、IL-6和TNF-α在提高機(jī)體免疫機(jī)能的同時，可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，是具有抗炎和促炎雙重作用的細(xì)胞因子，但其過量釋放導(dǎo)致機(jī)體過度的炎癥反應(yīng)，從而引起多器官損害，因此也是應(yīng)激性損傷的直接介導(dǎo)物，血清中IL-6和IL-1β水平是應(yīng)激時炎癥反應(yīng)最具代表性的指示物［10］。殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中胺基可被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別，激活巨噬細(xì)胞，趨化白細(xì)胞，刺激其產(chǎn)生淋巴因子和炎性介質(zhì)［2，11］。Tang 等［7］報道，飼糧中添加250 mg/kg殼寡糖可通過啟動腸相關(guān)淋巴免疫系統(tǒng)促進(jìn)細(xì)胞因子IL-1基因表達(dá)，提高血液中IL-1、白介素2(IL-2)、IL-6及IgA、IgM、IgG濃度。本研究表明，殼聚糖可提高21日齡斷奶仔豬回腸黏膜中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)量，還得出其與殼聚糖添加濃度呈一定的遞增關(guān)系，但3個殼聚糖組只與金霉素組差異顯著，與對照組無顯著性差異，更未見引起極顯著差異，提示添加殼聚糖未引起細(xì)胞因子大量釋放，在抗炎癥和提高免疫力的同時不會造成組織損傷。因此，可以認(rèn)為殼聚糖能增強(qiáng)仔豬非特異性免疫力。

3.2 殼聚糖對仔豬生長性能的影響

肉仔雞飼糧中分別添加 0.02%、0.05%、0.10%、0.30% 、0.50% 的殼聚糖，飼喂小劑量殼聚糖(0.02% ～0.30%)飼糧時，均呈現(xiàn)不同程度的促生長作用，尤以添加0.05%時促生長作用最明顯，添加更高水平時，免疫功能有所增強(qiáng)，但生長性能卻有下降趨勢，添加3%的殼聚糖對肉仔雞的生產(chǎn)性能有負(fù)效應(yīng)［12］，飼糧中添加不同水平(50、100、150 mg/kg)殼聚糖均能提高肉仔雞ADG和免疫器官重量，以添加100 mg/kg殼聚糖效果最好［13］。在斷奶仔豬飼糧中分別添加0.01%、0.02%、0.04%、0.06% 的殼聚糖，進(jìn)行21 d飼養(yǎng)試驗，得出殼聚糖能提高仔豬ADG和ADFI，降低仔豬 F/G［14］。Tang 等［7］認(rèn)為殼聚糖促生長機(jī)理為促進(jìn)垂體分泌生長激素(GH)，提高肝臟生長激素釋放激素(GRH)特異結(jié)合活性，從而促進(jìn)胰島素樣生長因子－Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因表達(dá)，提高血液中IGF-Ⅰ濃度，并通過介導(dǎo)而起促生長作用。本研究表明，飼糧中添加 200、300、400 mg/kg殼聚糖能促進(jìn)仔豬生長，提高采食量，降低料重比，且隨殼聚糖添加劑量的增加對生長性能的作用效果增強(qiáng)，其中添加400 mg/kg殼聚糖組促生長效果優(yōu)于金霉素組。

仔豬早期斷奶后，一方面由于母源抗體的逐漸減少，以及斷奶應(yīng)激降低了仔豬自身循環(huán)抗體水平并抑制了細(xì)胞免疫力和免疫水平，使仔豬抗病能力減弱而易感染病原微生物;另一方面由于斷奶后消化酶活力下降，胃酸分泌不足及胃腸道上皮組織萎縮，使斷奶仔豬消化道發(fā)生紊亂，容易發(fā)生腹瀉。殼聚糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌(St.aureus)具有很好的抑制作用，目前關(guān)于殼聚糖抑菌機(jī)理主要有以下2種觀點:一種是根據(jù)殼聚糖的聚陽離子性質(zhì)提出的以細(xì)菌帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜為靶位的機(jī)制，殼聚糖有正電荷的質(zhì)子化銨，通過吸附在細(xì)胞表面，形成一層高分子膜，阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸，同時使其發(fā)生凹陷、變形和泄漏，從而起到抑菌殺菌作用;另外一種是以細(xì)菌分子中的DNA為靶位的抗菌機(jī)制，分子量小的殼聚糖通過滲透進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，吸附細(xì)胞體內(nèi)帶有陰離子的細(xì)胞質(zhì)，并發(fā)生絮凝作用，擾亂細(xì)菌DNA分子的轉(zhuǎn)錄，使之由內(nèi)部瓦解衰亡，從而殺滅細(xì)菌［15］。本試驗所用仔豬是經(jīng)大腸桿菌攻毒引起腹瀉的，200、300和400 mg/kg殼聚糖均能降低仔豬腹瀉率，且隨殼聚糖濃度的遞增降低腹瀉率效果增強(qiáng)，證實了殼聚糖的抑菌作用，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

①殼聚糖能促進(jìn)仔豬生長，提高采食量，降低F/G和腹瀉率，且隨濃度的增大有增強(qiáng)的趨勢，添加300和400 mg/kg殼聚糖作用效果無明顯差異，添加400 mg/kg殼聚糖促生長效果優(yōu)于50 mg/kg金霉素。

②殼聚糖能提高仔豬血清中IgG和IgM水平，對回腸黏膜中 IL-1β、IL-6和 TNF-αmRNA相對表達(dá)量有一定的提高，且隨殼聚糖添加濃度的增大有升高的趨勢，并可提高仔豬非特異性免疫力。

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*Corresponding author，professor，E-mail:tangzhiru2326@yahoo.com.cn

(編輯 武海龍)

Effect of Chitosan on G row th Perform ance and Imm unity in Weanling Pigs Challenged withEscherichia coli

XIAO Dingfu1，2TANG Zhiru2，3*YIN Yulong2ZHANG Bin1FENG Zemeng2RAN Maoliang1
(1.College of Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha410128，China;2.Subtropical Agriculture Ecological Research Institute，Chinese Academy of Sciences，Changsha410125，
China;3.College of Animal Science and Technology，Southwest University，Chongqing400715，China)

The experimentwas conducted to study effects of chitosan on growth performance and immunity in weanling piglets.Fifty pigletswith an average body weight of(6.62 ±0.59)kg were challenged with enterotoxigenicEscherichia coli(1×109cell per head)during adaptation period and random ly assigned to 5 groups with 10 replicates per group and 1 piglet in each replicate.The piglets in control group were fed basal diet，and the others in experimental groups were fed the basal diet supplemented with 50 mg/kg chlortetracycline，200，300 or 400 mg/kg chitosan，respectively.The experiment lasted for 21 days.The results showed as follows:1)compared with the control group，in every experimental group，average daily feed intake was improved(P＞0.05)，the ratio of feed to gain and diarrhea ratio were decreased，and the average daily gain was increased by 15.8%，9.2%，16.8%and 21.1%(P＞ 0.05)，respectively.2)Compared with the control group，the serum immunoglobulin G(IgG)and immunoglobulin M(IgM)levels，relative expression levels of interleukin-1β (IL-1β)，interleukin-6(IL-6)and tumor necrosis factor-α (TNF-α)mRNA in ileum mucosa were improved in the chitosan groups，but decreased in the chlortetracycline group.The IgG and IgM levels in the 300 and 400 mg/kg chitosan groups were significant higher than those in the chlortetracycline group(P＜0.05)，and the IgG level in the 400 mg/kg chitosan group was significant higher than that in the control group(P＜0.05).The relative expression level of IL-1β and TNF-α mRNA in the three chitosan groupswas significant higher than those in the chlortetracycline group(P＜0.05)，and the relative expression levels of IL-6 mRNA in the 300 and 400 mg/kg chitosan groups were significant higher than that in the chlortetracycline group(P＜0.05).These results indicate that supplemented with 200，300 and 400 mg/kg chitosan in diets can improve growth performance，decrease diarrhea ratio and enhance non-specific immunity of weanling piglets，furthermore，those effects have enhancing trend with increasing the concentration of chitosan in diets.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(10):1783-1789］

chitosan;weanling pigs;growth performance;immunity;cytokine

S828

A

1006-267X(2011)10-1783-07

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.10.019

2011－04－25

湖南省自然科學(xué)基金青年項目(10JJ4013);西南大學(xué)博士基金(SWU111002);國家863項目(2008AA10Z316)

肖定福(1977—)，女，湖南婁底人，博士研究生，從事動物營養(yǎng)生理研究。E-mail:xiaodingfu2001@yahoo.com.cn

*通訊作者:唐志如，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail:tangzhiru2326@yahoo.com.cn