魚油對脂多糖刺激仔豬腸道損傷的保護(hù)作用

吳志鋒 劉玉蘭 洪 宇 朱惠玲 侯永清 丁斌鷹

(武漢工業(yè)學(xué)院，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023)

魚油對脂多糖刺激仔豬腸道損傷的保護(hù)作用

吳志鋒 劉玉蘭*洪 宇 朱惠玲 侯永清 丁斌鷹

(武漢工業(yè)學(xué)院，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023)

本試驗(yàn)旨在研究魚油對脂多糖(LPS)刺激仔豬腸道損傷的保護(hù)作用。試驗(yàn)選用32頭(28±3)日齡、體重為(8.91±0.74)kg的杜洛克×長白×大白仔豬，隨機(jī)分為4組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)(欄)2頭豬，公母各1頭。試驗(yàn)采用2×2因子設(shè)計，主因子包括:1)飼糧處理(5%魚油或5%玉米油);2)免疫應(yīng)激(注射LPS或生理鹽水)，試驗(yàn)期19 d。試驗(yàn)第19天，每個飼糧組1/2的豬注射150μg/kg BW的LPS，另1/2注射無菌生理鹽水作為對照。注射LPS 4 h后屠宰仔豬，取小腸樣品待測。結(jié)果表明:1)LPS刺激導(dǎo)致空腸、回腸黏膜絨毛高度和隱窩深度顯著下降(P＜0.05)，魚油顯著提高了回腸黏膜絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度(P＜0.05)。2)LPS刺激導(dǎo)致空腸黏膜麥芽糖酶、乳糖酶和蔗糖酶活性顯著降低(P＜0.05);魚油顯著提高了空腸蔗糖酶活性(P＜0.05)，同時魚油對回腸乳糖酶活性的影響與LPS刺激存在顯著的互作關(guān)系(P＜0.05)，即對生理鹽水組，魚油顯著提高了回腸乳糖酶活性(P＜0.05)。3)LPS刺激顯著提高了空腸和回腸中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)含量(P＜0.05)，魚油顯著降低了空腸中TNF-α含量(P＜0.05)，對空腸中PGE2含量有抑制趨勢(P＜0.10)。4)LPS刺激導(dǎo)致空腸和回腸黏膜中核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-κB)蛋白表達(dá)水平顯著提升(P＜0.05)，而魚油則有效降低了回腸中NF-κB蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)。結(jié)果提示:魚油緩解了LPS導(dǎo)致仔豬的腸道損傷，魚油可能通過影響腸道中NF-κB蛋白的表達(dá)來抑制炎性介質(zhì)的分泌，從而發(fā)揮保護(hù)作用。

魚油;免疫應(yīng)激;仔豬;炎性介質(zhì);NF-κB

免疫應(yīng)激在養(yǎng)豬生產(chǎn)中普遍存在，是抑制豬生長的重要因素之一，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。免疫應(yīng)激是由飼養(yǎng)環(huán)境中的病原體或非病原體，如細(xì)菌、病毒和內(nèi)毒素等刺激豬的免疫系統(tǒng)所致［1］。當(dāng)機(jī)體受到病原體或非病原體刺激時，免疫系統(tǒng)常處于一種高度的激活狀態(tài)，尤其是炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素 -6(IL-6)等過量分泌，從而產(chǎn)生免疫應(yīng)激問題［2］。免疫應(yīng)激中受影響最大的是腸道。研究表明，免疫應(yīng)激損害腸黏膜的完整性，導(dǎo)致腸道消化酶活性下降，從而影響了營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收［3］。魚油富含n-3多不飽和脂肪酸(PUFA)，已成為特定的免疫營養(yǎng)素［4-5］。目前，已有研究證明，n-3 PUFA能調(diào)控感染、創(chuàng)傷等情況下機(jī)體過度的炎性反應(yīng)，起到營養(yǎng)和藥理的聯(lián)合作用［4］。除了其營養(yǎng)和免疫作用外，在醫(yī)學(xué)上的研究表明，n-3 PUFA對危重癥患者的腸黏膜損傷有防護(hù)作用［6］。同時在試驗(yàn)動物上的研究表明，從深海魚油中提取的n-3 PUFA可以減少小鼠腸道細(xì)菌易位，保護(hù)腸黏膜屏障［7］。但是關(guān)于n-3 PUFA對豬的調(diào)控作用尚未見報道。鑒于n-3 PUFA對腸道的保護(hù)作用，推測魚油可能對緩解仔豬免疫應(yīng)激導(dǎo)致的腸道損傷有一定作用。因此，本研究用大腸桿菌脂多糖(LPS)刺激仔豬建立免疫應(yīng)激模型［8］，研究魚油對仔豬腸道黏膜結(jié)構(gòu)及屏障功能的影響，旨在探討魚油對LPS刺激導(dǎo)致的仔豬腸道損傷的調(diào)節(jié)作用及機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物和飼糧

試驗(yàn)選用32頭(28±3)日齡、體重為(8.91±0.74)kg的杜洛克×長白×大白仔豬，按體重相近原則隨機(jī)分為4組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)(欄)2頭豬，公母各1頭。試驗(yàn)期19 d。飼糧參照NRC(1998)5～10 kg斷奶仔豬的營養(yǎng)需要量配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

1.3 腸道樣品采集

仔豬屠宰后剖開腹腔取小腸，把小腸分為十二指腸、空腸和回腸，將小腸從其腸系膜處取下并立即放入冰塊中。于空腸和回腸中部各取5 cm腸段置于4%多聚甲醛中固定，同時各取10 cm腸段用剪刀剖開，并用4℃生理鹽水輕輕沖洗腸內(nèi)容物，用濾紙吸干水分，再用手術(shù)刀鈍面輕輕刮取腸黏膜，分裝在5 m L無菌凍存管中，立即放入液氮中速凍，再轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱中凍存。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 小腸黏膜形態(tài)

將4%多聚甲醛固定的腸段常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅染色。光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察、取圖和拍照，從組織切片上選10個典型視野(絨毛完整、走向平直)，測量小腸黏膜的絨毛高度和隱窩深度，其平均值作為測定數(shù)據(jù)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4.2 小腸黏膜二糖酶活性

準(zhǔn)確稱取一定量黏膜，按1∶9加入生理鹽水放入玻璃勻漿器中勻漿，冷凍離心(4℃，3 000 r/m in，10 m in)，分離上清液，制備成10%的黏膜勻漿，待測黏膜中二糖酶的活性，采用酶偶聯(lián)法(葡萄糖氧化酶-過氧化物酶偶聯(lián)法)測定二糖酶活性。二糖酶測定試劑盒購自上海榮盛生物技術(shù)有限公司。

1.4.3 小腸黏膜炎性介質(zhì)

取10%的黏膜勻漿液，TNF-α采用ELISA試劑盒(R＆D System，美國)測定;前列腺素 E2(PGE2)采用125IRIA試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)測定。

1.4.4 小腸黏膜核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-κB)蛋白水平

這個老陳啊，都躺在醫(yī)院里了，還口齒牙硬。當(dāng)我告訴老陳他被撞后是樓上的那個女人打的120時，老陳的臉再一次紅了，吭哧了半天，才說那天他見到那個女人后，就把那條內(nèi)褲拿給她，誰知她不承認(rèn)是自己的。老陳說他問遍了其他的人家，大家都說不是自己的，所以他認(rèn)定是那個女人的。誰想老陳塞給那個女人，那個女人又塞給他，一來二往，老陳的手就觸到了那個女人不該觸的地方。那個女人反應(yīng)也快，抬手就給了老陳一耳光。打過之后，那個女人才意識到自己有些過分了。

采取蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)分析方法。取約0.2 g腸道黏膜溶解在7倍體積的蛋白裂解液中，勻漿后10 000×g4℃離心10 m in獲得總蛋白。以相同總蛋白質(zhì)量作為變性蛋白質(zhì)的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)至聚偏乙烯(PVDF)膜上進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，4℃過夜。一抗為兔源NF-κB p65抗體(#3034，購于 Cell Signaling Technology，1∶1 000 稀釋)和鼠源β-肌動蛋白(β-actin)抗體(sc-47778，購于Santa Cruz Biotechnology，1∶1 000 稀釋)。洗膜后二抗(武漢博士德生物工程有限公司)室溫下孵育2 h，二抗分別為羊抗兔IgG-HGP和羊抗鼠IgGHRP，1∶10 000稀釋。洗膜后用 ECL試劑(Pierce公司)熒光顯色，于A lpha Innotech成像系統(tǒng)中檢測及分析條帶強(qiáng)度。NF-κB p 6 5蛋白水平以NF-κB p65的強(qiáng)度和β-actin的強(qiáng)度比值表示。

1.5 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。舍溫保持在20～22℃。豬欄面積1.20 m ×1.10 m。粉料飼喂，乳頭式飲水器，自由采食和飲水。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用SPSS 16.0進(jìn)行雙因子方差分析。模型主效應(yīng)包括飼糧處理、免疫應(yīng)激及二者的互作。以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0.10為具有顯著性趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚油對LPS刺激仔豬腸道形態(tài)的影響

小腸黏膜形態(tài)的結(jié)果見圖1和表2。由表2可知，LPS刺激導(dǎo)致各腸段絨毛高度和隱窩深度均顯著下降(P＜0.05)，魚油顯著提高了回腸黏膜絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度(P＜0.05)。從圖1可看出，生理鹽水組空腸絨毛完整且較長;LPS組空腸絨毛排列不整齊，絨毛脫落較嚴(yán)重，而LPS刺激后相比于玉米油，飼糧中添加魚油時絨毛恢復(fù)較好，形態(tài)較完整。

圖1 空腸形態(tài)光鏡圖Fig.1 The lightm icroscope photograph of jejunum(100 × )

表2 魚油對脂多糖刺激仔豬腸道形態(tài)的影響Table 2 Effect of fish oil on intestinalmorphology of piglets challenged with lipopolysaccharide

2.2 魚油對LPS刺激仔豬腸道二糖酶活性的影響

由表3可見，LPS刺激導(dǎo)致空腸黏膜麥芽糖酶、乳糖酶和蔗糖酶活性顯著降低(P＜0.05)。魚油對回腸乳糖酶活性的影響與LPS刺激存在顯著的互作關(guān)系(P＜0.05)，即對生理鹽水組，魚油顯著提高了回腸乳糖酶活性(P＜0.05)，而對 LPS組的豬則無影響。魚油顯著提高了空腸蔗糖酶活性(P＜0.05)。

表3 魚油對脂多糖刺激仔豬腸道二糖酶活性的影響Table 3 Effect of fish oil on intestinal disaccharidase activities of piglets challenged with lipopolysaccharide U/mg prot

2.3 魚油對LPS刺激仔豬腸道黏膜中炎性介質(zhì)的影響

從表4可見，LPS刺激顯著提高了空腸、回腸中 TNF-α、PGE2含量(P＜0.05)，魚油顯著降低了空腸中TNF-α含量(P＜0.05)，同時有緩解空腸中PGE2上升的趨勢(P＜0.10)。

2.4 魚油和LPS刺激對仔豬腸道黏膜中NF-κB蛋白水平的影響

由圖2和表5可知，LPS刺激后，空腸和回腸黏膜中 NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著提高(P＜0.05)，而魚油則有效降低了回腸中NF-κB蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)。

表4 魚油對脂多糖刺激仔豬腸道黏膜中炎性介質(zhì)的影響Table 4 Effect of fish oil on inflammatory parameters of intestinal mucosa in piglets challenged with lipopolysaccharide pg/mg prot

圖2 空腸和回腸黏膜中NF-κB代表性Western Blot蛋白條帶Fig.2 The representative protein bands from Western blot for NF-κB in the jejunum and ileum mucosa

表5 魚油對脂多糖刺激仔豬腸道黏膜中NF-κB蛋白水平的影響Table 5 Effect of fish oil on intestinalmucosa NF-κB protein expression of piglets challenged with lipopolysaccharide

3 討論

LPS模型是動物營養(yǎng)學(xué)中常用的豬免疫應(yīng)激模型［9］。LPS是革蘭氏陰性菌膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)，能引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，出現(xiàn)如厭食、嗜睡和發(fā)熱等癥狀［5］。此外，LPS刺激也會損害腸黏膜的完整性，破壞腸道結(jié)構(gòu)和功能，如給豬腹膜注入LPS后，觀察發(fā)現(xiàn)腸黏膜血流量減少50%，腸黏膜通透性明顯增加［10］。

小腸黏膜絨毛高度與隱窩深度是小腸吸收面積和成熟腸細(xì)胞數(shù)量多少的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，與仔豬消化吸收功能密切相關(guān)，是決定仔豬對腹瀉敏感性強(qiáng)弱的因素之一［11］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS刺激損害腸黏膜的完整性，這與Sukhotnik等［12］的研究結(jié)果一致。飼糧中添加魚油顯著提高回腸黏膜絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度。這表明魚油在一定程度上加速了回腸上皮細(xì)胞的更新代謝，緩解了LPS應(yīng)激導(dǎo)致的腸絨毛萎縮。

乳糖酶、蔗糖酶和麥芽糖酶是小腸重要的二糖酶，主要存在于小腸絨毛頂端，對小腸的消化及吸收功能有重要意義，同時也是監(jiān)測小腸功能受損最敏感的指標(biāo)之一［13］。本研究表明LPS刺激降低了空腸黏膜麥芽糖酶、乳糖酶和蔗糖酶活性，表明LPS刺激損傷了腸道的消化吸收功能。飼糧中添加魚油提高了回腸乳糖酶和空腸蔗糖酶活性，表明魚油具有提高腸道黏膜二糖酶活性的功能。這與前面提到的魚油維持小腸黏膜的正常形態(tài)的結(jié)果密切相關(guān)。只有完整的腸黏膜形態(tài)與結(jié)構(gòu)，才有益于黏膜二糖酶的分泌，才能使養(yǎng)分得以更好地消化、吸收，進(jìn)而促進(jìn)了仔豬生長［14］。同時也有報道，加魚油的腸外營養(yǎng)可促進(jìn)嚴(yán)重創(chuàng)傷后腸道血供和腸屏障功能的恢復(fù)，降低全身系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生［15］。對腸道缺血再灌注損傷大鼠，腸內(nèi)營養(yǎng)添加n-3 PUFA可促進(jìn)腸黏膜修復(fù)，維護(hù)腸屏障功能，減少內(nèi)毒素移位和減輕系統(tǒng)炎癥反應(yīng)［16］。

動物在發(fā)生免疫應(yīng)激反應(yīng)時，應(yīng)激原會刺激單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生并分泌TNF-α等炎性細(xì)胞因子［2］。PGE2是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，花生四烯酸通過環(huán)氧化酶和脂氧化酶途徑代謝產(chǎn)生許多生物活性物質(zhì)，其中PGE2是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要代謝產(chǎn)物，也是一種重要的炎性介質(zhì)［5］。研究表明，炎性介質(zhì)在腸道損傷起到?jīng)Q定性作用［17］，其過量分泌將造成腸道黏膜的完整性和上皮細(xì)胞吸收功能受損［18］。在本試驗(yàn)中，LPS刺激導(dǎo)致腸道炎性介質(zhì)TNF-α和PGE2上升，說明仔豬的腸道發(fā)生炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)和功能的損傷。而魚油顯著抑制了腸道黏膜中TNF-α的上升、減緩了PGE2水平的上升趨勢，說明魚油具有緩解腸道炎癥從而緩解腸道結(jié)構(gòu)和功能損傷的作用。與此類似，我們前期的研究表明，與玉米油組相比，添加7%的魚油飼糧顯著緩解了LPS刺激仔豬血漿 IL-1β、PGE2含量的上升［5］。同時也有研究報道，與玉米油和禽脂相比，魚油能顯著降低肉雞腸道組織PGE2水平［19］。此外，魚油的主要成分二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)可顯著降低人胃癌BGC-823細(xì)胞PGE2濃度［20］。這可能是n-3 PUFA與能置換細(xì)胞膜磷脂中的花生四烯酸，競爭相同的環(huán)氧化酶途徑，減少了來源于花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，從而抑制過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展［21］。

NF-κB屬于Rel蛋白家族成員，主要參與調(diào)節(jié)與機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)及包括白細(xì)胞粘附有關(guān)的蛋白質(zhì)分子的基因轉(zhuǎn)錄。典型的NF-κB是由p65和p50 2個亞基組成，在胞漿中通過與其抑制蛋白-κB家族緊密結(jié)合，以無活性的形式存在。外界信號可以通過活化IκB激活NF-κB，研究發(fā)現(xiàn)，LPS可通過破壞的上皮屏障進(jìn)入循環(huán)并激活NF-κB［22］，NF-κB 進(jìn)入核內(nèi)與靶基因 κB 序列結(jié)合，調(diào)控特定基因轉(zhuǎn)錄?；罨腘F-κB核因子可以促進(jìn)TNF-α等炎性細(xì)胞因子的分泌［23］和環(huán)氧化二酶(COX-2)激活，COX-2進(jìn)一步促進(jìn)PGE2產(chǎn)生［24］，而這些炎性介質(zhì)的大量產(chǎn)生是導(dǎo)致腸道損傷的重要原因之一［25］。本試驗(yàn)研究表明，LPS刺激促進(jìn)腸道黏膜NF-κB的表達(dá)，而魚油通過降低回腸黏膜中NF-κB的蛋白表達(dá)，抑制了PGE2和TNF-α的過量分泌來起到保護(hù)腸道的作用。與此相似，有試驗(yàn)報道，魚油灌胃可以抑制移植腸中NF-κB的活性，并可以顯著降低移植小腸中TNF-α和 IL-6 的表達(dá)［26］。Zhao等［27］發(fā)現(xiàn)在人 THP-1 細(xì)胞株中，α-亞麻酸及DHA通過抑制NF-κB的活性發(fā)揮抗炎作用。此外，Li等［21］亦證明在 HK-2細(xì)胞中，EPA和 DHA能下調(diào) LPS誘導(dǎo)的 NF-κB活化從而發(fā)揮抗炎的作用。

4 結(jié)論

魚油緩解了免疫應(yīng)激下仔豬的腸道損傷，其機(jī)制可能是魚油降低了腸道黏膜組織中NF-κB蛋白表達(dá)起到抑制炎性因子的分泌，從而發(fā)揮保護(hù)作用。

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*Corresponding author，associate professor，E-mail:yulanflower@126.com

(編輯 田艷明)

Fish Oil Supp lem entation Protects against Intestinal M ucosa Injury Induced by Lipopolysaccharide Challenge in Piglets

WU Zhifeng LIU Yulan*HONG Yu ZHU Huiling HOU Yongqing DING Bingying
(Hubei Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science，Wuhan Polytechnic University，Wuhan430023，China)

This experimentwas conducted to study the protective effects of fish oil on intestinalmucosa injury of piglets challenged with lipopolysaccharide(LPS).Thirty-two crossbred(Duroc×Landrace×LargeWhite)piglets weaned at(28 ±3)d of age with body weight of(8.91 ±0.74)kg were used in a 2 ×2 factorial design.The piglets were random ly assigned to 4 groups with 4 replicates per group and 2 piglets per replicate.Themain factors consisted of diet(5%corn oil or 5%fish oil)and immunological challenge(LPS injection or physiological saline injection).The experiment lasted for 19 days.On day 19，half of piglets in every diet group were injected intraperitoneally with either 150μg/kg BW of LPS or an equivalent amount of sterile saline.At4 h after LPS challenge，the pigletswere slaughtered to collect intestinalmucosa samples for analysis.The results showed as follows:1)LPS challenge reduced the villus height and crypt depth in jejunum and ileum(P＜0.05).Fish oil supplementation improved villus height，crypt depth and the ratio of villus height to crypt depth in ileum(P＜0.05).2)LPS challenge reduced the activities of lactase，sucrase and maltase in jejunum(P＜0.05).The sucrase activity of piglets fed fish oilwas improved in jejunum(P＜0.05).The lactase activity of piglets fed fish oil and injected physiological salinewas increased in ileum(P＜0.05).3)LPS challenge increased tumor necrosis factor-α (TNF-α)and prostaglandin E2(PGE2)contents in jejunum and ileum(P＜0.05).Piglets fed fish oil had lower TNF-α level than piglets fed corn oil(P＜ 0.05).Fish oil supplementation inhibited PGE2contents in jejunum(P＜0.10).4)LPS challenge increased nuclear transcription factor-kappaB(NF-κB)protein expression in jejunum and ileum(P＜0.05).Fish oil suppressed NF-κB protein expression in ileum(P＜0.05).These results suggest that fish oil can alleviate intestine damage induced by LPS challenge.Additionally，the protective effects of fish oil on the intestine are associated with decreasing the production of intestinal pro-inflammatory parameters through inhibiting NF-κB expression.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(10):1775-1782］

fish oil;immunological stress;piglet;pro-inflammatory parameters;NF-κB

S 828;S816.7

A

1006-267X(2011)10-1775-08

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.10.018

2011-04-14

新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃(NCET-10-0158);國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30972109);湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(重點(diǎn)2010CDA 050;面上2009CDB006);武漢市科技計劃項(xiàng)目(201171034320)

吳志鋒(1986—)，男，湖北仙桃人，碩士研究生，從事豬的營養(yǎng)生理與機(jī)理調(diào)控研究。E-mail:molang1027@yahoo.com.cn

*通訊作者:劉玉蘭，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail:yulanflower@126.com