新型層析快速檢測(cè)技術(shù)及其在食品安全中的應(yīng)用

劉道峰鄧省亮賴衛(wèi)華

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌 330029）

新型層析快速檢測(cè)技術(shù)及其在食品安全中的應(yīng)用

劉道峰1鄧省亮2賴衛(wèi)華1

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌 330029）

分別介紹量子點(diǎn)、熒光微球、上轉(zhuǎn)磷光、納米磁珠為代表的新型標(biāo)記物免疫層析，非免疫學(xué)層析，替代抗原層析等新型層析快速檢測(cè)技術(shù)，綜述其原理、優(yōu)勢(shì)及其在食品安全相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀，并對(duì)今后層析檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。

新型；層析檢測(cè)；食品安全；應(yīng)用

目前，以膠體金標(biāo)記為代表的免疫層析方法已廣泛應(yīng)用于食品安全相關(guān)檢測(cè)中。膠體金（colloidal gold）是氯金酸在還原劑的作用下，形成可控大小的金顆粒，在試紙條上金顆粒聚集達(dá)到一定密度時(shí)，能出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的粉紅色，因而膠體金可以標(biāo)記生物分子并作為免疫層析反應(yīng)的指示物。目前，對(duì)于膠體金免疫層析檢測(cè)方法，中國(guó)已初具產(chǎn)業(yè)化規(guī)模并有較多成熟產(chǎn)品問(wèn)世，如：檢測(cè)鹽酸克侖特羅試紙條靈敏度已達(dá)到2ng/mL，萊克多巴胺檢測(cè)限已達(dá)到3ng/mL。

類似常用的還有膠體硒、乳膠微球等吸收光譜型標(biāo)記物［1－3］，但由于這些傳統(tǒng)層析檢測(cè)方法有一定弊端，如此類物質(zhì)物易受光學(xué)干擾，僅能定性或半定量分析，且要求標(biāo)記物大量聚集至一定濃度后才能產(chǎn)生可視的信號(hào)（如膠體金需達(dá)到107個(gè)/mm2，才會(huì)形成肉眼可見(jiàn)的紅色［4］），因此，這也限制了傳統(tǒng)層析方法在食品安全領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

1 新型標(biāo)記物免疫層析法及其在食品安全中的應(yīng)用

目前，已經(jīng)應(yīng)用于免疫層析標(biāo)志物的新型納米材料包括量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）、熒光微球、上轉(zhuǎn)磷光納米粒子（up－converting phosphor，UCP）、納米磁珠等幾大類。這些新興的標(biāo)記方法有效規(guī)避了吸收光譜型標(biāo)記物須大量聚集才能顯色的缺點(diǎn)，也有效減少了樣本的本底干擾，在層析檢測(cè)中顯示了更大的潛力。

1.1 量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析

量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）又稱熒光半導(dǎo)體納米顆粒，用于生物探針的量子點(diǎn)主要由第二副族和第六主族的元素組成，如硒化鎘（CdSe）、硫化鋅（ZnS）、碲化鎘（CdTe）、硫化鎘（CdS）等［5］。粒徑多介于1～10nm，極小的粒徑，外觀似點(diǎn)狀，故得名為量子點(diǎn)。

受量子尺寸效應(yīng)和量子限域效應(yīng)的影響，半導(dǎo)體量子點(diǎn)顯示出獨(dú)特的發(fā)光特性［6］，主要表現(xiàn)在：① 其發(fā)光特性除了與量子點(diǎn)的材料相關(guān)外還與其顆粒尺寸密切相關(guān)，一定范圍內(nèi)，粒徑越大，發(fā)射光的頻率越低，波長(zhǎng)越長(zhǎng)；② 激發(fā)光譜很寬，可以使用小于其發(fā)射波長(zhǎng)10nm的任意波長(zhǎng)激發(fā)光來(lái)激發(fā)量子點(diǎn)，而量子點(diǎn)的發(fā)射光譜譜峰較窄且無(wú)拖尾，單色性好，因此可以用同一激發(fā)光源來(lái)激發(fā)不同的量子點(diǎn)，這使得在同一系統(tǒng)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)項(xiàng)目中量子點(diǎn)有了極大優(yōu)勢(shì)；③量子點(diǎn)有著很大的Stoke位移，可有效避免激發(fā)光與發(fā)射光的重疊，這使得發(fā)射光的判別更為明顯，檢出更為容易，更有利于提高檢測(cè)靈敏度；④ 量子點(diǎn)具有遠(yuǎn)大于生物分子的熒光壽命，在大部分生物分子熒光猝滅后，可以有效地降低自然本底的干擾。此外，經(jīng)一系列化學(xué)修飾后的量子點(diǎn)可以擁有穩(wěn)定的水溶特性與更好的生物相容性［7－9］。經(jīng)穩(wěn)定的核殼包裹的量子點(diǎn)也顯示出更好的光化學(xué)穩(wěn)定性與更低的細(xì)胞毒性。所以，近年來(lái)在食品安全相關(guān)的層析檢測(cè)中受到了研究者較熱門的關(guān)注，有著較廣泛的應(yīng)用［10，11］。

Zou等［12］報(bào)道了一種新的檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥－毒死蜱（三氯吡啶醇，trichloropyridinol）殘留的傳感器，該傳感器基于量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析方法并結(jié)合一便攜式量子點(diǎn)層析試紙條的讀取儀。據(jù)讀取儀掃描T線（檢測(cè)線）量子點(diǎn)光強(qiáng)度，可以將檢測(cè)結(jié)果定量化，在最佳條件下，該傳感器有較寬的線性范圍，標(biāo)準(zhǔn)品最低檢出濃度為1.0ng/mL。實(shí)現(xiàn)了以量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析為基礎(chǔ)的待測(cè)物的“超靈敏”定量分析。Tully等［13］也將量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析方法應(yīng)用于單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）外膜蛋白的檢測(cè)，驗(yàn)證了抗Int A及Int B兩組蛋白的單抗對(duì)李斯特氏菌檢出的有效性，對(duì)李斯特氏菌的最低檢出濃度為1.5×104CFU/mL。張國(guó)華等［14］應(yīng)用該方法檢測(cè)萊克多巴胺（ractopamine，Rac），所得的Rac快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)限為3ng/mL。Peng等［15］通過(guò)量子點(diǎn)－BSA－生物素－親和素－抗體作為結(jié)合墊探針，建立了能同時(shí)檢測(cè)5種化學(xué)物殘留的間接競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法，其中，地塞米松（dexamethason，DEX）的定量檢測(cè)線性范圍為0.33～10μg/kg，慶大霉素（gentamicin，GM）0.28～10μg/kg，氯硝安定（clonazepam，CZP）為0.16～25μg/kg，頭孢噻呋（ceftiofur，CEF）0.32～25μg/kg，甲孕酮（medroxyprogesterone acetate，MPA）0.17～10μg/kg，同時(shí)檢測(cè)上述物質(zhì)的最低檢出濃度：DEX，0.13μg/kg；GM，0.16μg/kg；CZP，0.07μg/kg；CEF，0.14μg/kg；MPA，0.06μg/kg。檢測(cè)加標(biāo)豬肉樣本并與傳統(tǒng)方法比對(duì)，準(zhǔn)確性較高，顯示了量子點(diǎn)在體系中同時(shí)檢測(cè)多種物質(zhì)的優(yōu)勢(shì)。

1.2 熒光微球標(biāo)記免疫層析

熒光微球是指將熒光染料通過(guò)物理吸附法、自組裝法、化學(xué)鍵合法、共聚法、包埋法等［16］方法吸附或包埋到粒子內(nèi)而形成的直徑在納米至微米級(jí)（0.01～10μm）范圍內(nèi)，受激發(fā)光源激發(fā)能發(fā)出熒光的固體微粒。在微球殼結(jié)構(gòu)的作用下，它具有相對(duì)穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，粒度均一、單分散性好、穩(wěn)定性好、發(fā)光效率高、重復(fù)性好，有較好的生物相容性。形成微球后染料熒光猝滅大大減少，發(fā)射強(qiáng)而穩(wěn)定，且基本不受外界環(huán)境介質(zhì)變化的影響［17］。

Nathalie等［18］以包裹磺酰羅丹明B的微球?yàn)闃?biāo)記物的免疫層析方法檢測(cè)葡萄球菌腸毒素B，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間為30min，在緩沖液中檢測(cè)限接近20pg/mL，加標(biāo)于不同樣本基質(zhì)，靈敏度依然能夠得到保持，優(yōu)于相同條件膠體金標(biāo)記層析法（0.312ng/mL）約15倍，加之，因熒光微球有效防止了熒光染料向溶液中泄露，檢測(cè)限更優(yōu)于直接標(biāo)記羅丹明染料的層析方法（0.625ng/mL），該方法與其他主要細(xì)菌毒素均無(wú)交叉反應(yīng)，展示了熒光微球標(biāo)記免疫層析的明顯優(yōu)勢(shì)。范放等［19］以熒光納米顆粒為標(biāo)記物，研制了檢測(cè)O139群霍亂弧菌的免疫層析試紙條，用該試紙條檢測(cè)人工污染O139群霍亂弧菌的海魚(yú)肉，檢測(cè)靈敏度為3.5×104CFU/mL，比前人［20］的膠體金免疫層析試紙條3.4×105高一個(gè)數(shù)量級(jí)。朱海等［21］將熒光微球與呋喃唑酮代謝物單克隆抗體共價(jià)耦聯(lián)在一起，以競(jìng)爭(zhēng)法作為反應(yīng)模式來(lái)制備出呋喃唑酮代謝物免疫層析試紙條，所制備的免疫層析試紙條僅與呋喃唑酮代謝物AOZ有交叉反應(yīng)，而與非目標(biāo)檢測(cè)物之間無(wú)交叉反應(yīng)，其靈敏度達(dá)1.0ng/mL，可滿足相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求，通過(guò)肉眼觀察檢測(cè)線和質(zhì)控線之間的亮度，還可進(jìn)行半定量檢測(cè)。

1.3 上轉(zhuǎn)磷光標(biāo)記免疫層析

上轉(zhuǎn)磷光材料（up－converting phosphor，UCP）是新近發(fā)展起來(lái)的一種示蹤納米晶體顆粒材料，由包埋于氧化硫等惰性材料中的兩種不同鑭系元素離子（分別作為光吸收子和發(fā)射子）組成［22］。在紅外線（波長(zhǎng)＞780nm）激發(fā)下，上轉(zhuǎn)磷光顆粒吸收2個(gè)或2個(gè)以上光子的低能量，并可發(fā)射更高能譜（更高頻率）不同區(qū)段單波長(zhǎng)的可見(jiàn)光（波長(zhǎng)475～670nm），故為上轉(zhuǎn)磷光［23］。由于上轉(zhuǎn)磷光顆粒猝滅的時(shí)間更長(zhǎng)和天然生物材料不具備上轉(zhuǎn)磷光的特性［24］，所以檢測(cè)可不受載體或樣品自然磷光的干擾；加之，磷光上轉(zhuǎn)發(fā)生于晶格中，故磷光顆粒的光學(xué)性質(zhì)不受環(huán)境和加樣條件的限制，使得上轉(zhuǎn)磷光免疫層析技術(shù)靈敏度高，應(yīng)用范圍廣。

王靜等［25］建立了一種腸出血性大腸桿菌O157的上轉(zhuǎn)磷光免疫層析快速檢測(cè)方法，每次最低可檢測(cè)500個(gè)細(xì)菌，對(duì)奶粉、咖啡粉、餅干、蛋糕、綠豆糕、果凍、燕窩、果汁等樣品中的人工染菌均可檢測(cè)，最低檢測(cè)濃度為5×103CFU/mL。高于常規(guī)膠體金免疫層析試紙條10～100倍［26，27］，體現(xiàn)了上轉(zhuǎn)磷光免疫層析方法簡(jiǎn)便快速，特異性和靈敏性好，適用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。郭艷宏等［28］合成了稀土銪2SiO2納米顆粒，用其與氯霉素單克隆抗體結(jié)合制備氯霉素類殘留物免疫檢測(cè)探針，并制備免疫層析試紙條，用于牛奶中氯霉素和氯霉素琥珀酸鹽同步檢測(cè)，簡(jiǎn)便快速，30min內(nèi)出結(jié)果。加入1ng/mL的氯霉素、氯霉素琥珀酸鹽均能阻斷T線顯色，與甲砜霉素、慶大霉素、磺胺二甲基嘧啶之間無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好，未發(fā)現(xiàn)非特異性吸附和基質(zhì)背景熒光干擾的問(wèn)題。Niedbala等［29］采用研制的UCP標(biāo)記雙抗夾心免疫層析法對(duì)E.coliO157∶H7進(jìn)行檢測(cè)，在含有109雜菌的25g牛肉陰性樣本基質(zhì)中最低加入的103CFU/mL目的菌，可在10min內(nèi)被檢出，且0到107CFU/mL間的變異系數(shù)均小于10%，穩(wěn)定性好。同時(shí)也采用UCP標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法對(duì)多種興奮劑進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果理想。Hong等［30］研制的檢測(cè)鼠疫耶爾森氏菌抗體的10通道上轉(zhuǎn)磷光免疫層析試紙條裝置，可以同時(shí)檢測(cè)多種鼠疫耶爾森氏菌抗體，與ELISA對(duì)照檢測(cè)表現(xiàn)了較高的符合率 （R2＝0.93～0.99），平均變異系數(shù)為10.3%，表現(xiàn)了較好的穩(wěn)定性。

1.4 納米磁珠標(biāo)記免疫層析

目前對(duì)指示物的檢測(cè)基本上都是靠肉眼觀察定性結(jié)果或者基于光電效應(yīng)的儀器檢測(cè)，在檢測(cè)過(guò)程中，無(wú)論是肉眼還是光學(xué)儀器檢測(cè)NC膜上T線和C線（質(zhì)控線）上的信號(hào)，基本上只能檢測(cè)到膜表面到其10μm以下的部分。通常使用的硝化纖維膜厚度為100μm級(jí)別，指示物質(zhì)在纖維膜上層析時(shí)在整個(gè)膜上從底到頂均有分布，這樣多達(dá)90%的指示物未被測(cè)量到，這對(duì)于檢測(cè)的靈敏度是個(gè)極大的損失。納米磁性顆粒（magnetic nanoparticle，MNs）現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生物分離，酶的固定化，細(xì)胞的特異性捕獲、濃縮等領(lǐng)域［31，32］，目前正在被嘗試著用于取代傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)中指示物質(zhì)。由于納米磁性顆粒的“穿透性”，儀器對(duì)磁珠的磁信號(hào)檢測(cè)可以不受膜的厚度的影響，能夠檢測(cè)膜上從底到頂所有的磁珠，便可有希望大大提高靈敏度。加之，食品生物類材料大都不具備磁性，選擇磁性顆粒標(biāo)記可有效避免本底干擾。

袁航［33］建立了磁標(biāo)記用于大分子的雙抗夾心及用于小分子的競(jìng)爭(zhēng)免疫層析檢測(cè)法，其中磁標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法以鹽酸克倫特羅（clenbuterol）為目標(biāo)物質(zhì)，分別達(dá)到了現(xiàn)有ELISA 方法的靈敏度（0.5ng/mL），而檢測(cè)時(shí)間縮短至20min，與成熟使用的膠體金檢測(cè)試紙比對(duì)，所測(cè)107例樣本，符合率達(dá)到100%，優(yōu)于參比的產(chǎn)品。這確認(rèn)了納米磁珠標(biāo)記免疫層析方法及其應(yīng)用于食品安全檢測(cè)的有效性。Wang等也進(jìn)行了相關(guān)的研究［34］，結(jié)果表明，磁珠標(biāo)記層析的檢測(cè)時(shí)間主要跟磁珠粒徑相關(guān)，而信號(hào)的強(qiáng)度主要由磁珠中磁性物質(zhì)的含量有關(guān)，選用更小粒徑與磁性物質(zhì)含量更高的磁珠作免疫層析的標(biāo)記物更有利于快速、靈敏度的納米磁珠標(biāo)記免疫層析。

2 新型非免疫學(xué)層析及其在食品安全中的應(yīng)用

近年來(lái)互補(bǔ)的核酸鏈之間的特異性結(jié)合，也被研究者應(yīng)用于層析方法中，新的物質(zhì)也可以被層析的方法檢出，由于它們的結(jié)合力更強(qiáng)、特異性更高而有望從反應(yīng)動(dòng)力學(xué)上提高檢測(cè)靈敏度。

Wang等［35］利用核酸與核酸之間的特異性結(jié)合，通過(guò)量子點(diǎn)標(biāo)記層析法對(duì)赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)原理：結(jié)合墊用量子點(diǎn)標(biāo)記一段核酸配子（核酸單鏈），而在T線噴涂能與該配子大部分區(qū)段特異性互補(bǔ)的另一條核酸鏈Probe1，C線再噴涂一條Probe2。當(dāng)樣本中存在OTA時(shí)，經(jīng)過(guò)結(jié)合墊，會(huì)與標(biāo)記量子點(diǎn)的配子作用，導(dǎo)致配子無(wú)法與T線（檢測(cè)線）的Probe1雜交，而不顯顏色，由于量子點(diǎn)標(biāo)記配子的5′端有一段18個(gè)堿基的poly A，故無(wú)論樣本是否含有OTA，配體都會(huì)與C線上的Probe2相結(jié)合，使C線顯色，保證檢測(cè)有效。該新型的層析方法檢測(cè)限低至1.9ng/mL，完全滿足WHO對(duì)OTA的限量要求。量子點(diǎn)標(biāo)記配體的思路使檢測(cè)的靈敏度高于膠體金免疫層析，更重要的是極高的選擇性使方法尤其適于對(duì)復(fù)雜樣本溶液的檢測(cè)。

再如，商品化的 Milenia GenLine HybriDetect試劑盒，適用于任何擴(kuò)增產(chǎn)物快速檢測(cè)。只需要在設(shè)計(jì)擴(kuò)增時(shí)，設(shè)計(jì)一條FITC標(biāo)記的探針，和生物素標(biāo)記的引物。其檢測(cè)原理為生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與FITC標(biāo)記的特異探針雜交、FITC標(biāo)記的特異探針與抗FITC抗體的金標(biāo)物結(jié)合后，將該免疫復(fù)合物滴加到試紙條上，免疫復(fù)合物通過(guò)層析膜擴(kuò)散到檢測(cè)線時(shí)，生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物被生物素配體捕獲，形成具有顏色的T線。不被捕獲的免疫復(fù)合物繼續(xù)擴(kuò)散到質(zhì)控線被特異性抗體所捕獲，形成具有顏色的C線。已有研究者［36］將此層析方法結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（LAMP）技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物的快速檢測(cè)，方便、快捷、成本低廉，有效增補(bǔ)了中國(guó)轉(zhuǎn)基因食品的快速檢測(cè)方法，有良好的應(yīng)用前景。

3 新型替代抗原層析及其在食品安全中應(yīng)用

當(dāng)前，對(duì)于食品中有毒有害小分子抗原的層析檢測(cè)方法通常是建立在以噴涂該小分子或蛋白－小分子偶聯(lián)物作競(jìng)爭(zhēng)抗原基礎(chǔ)上的有毒檢測(cè)體系。由于多數(shù)檢測(cè)物標(biāo)品昂貴、進(jìn)口受限，毒性抗原還存在對(duì)層析檢測(cè)產(chǎn)品的生產(chǎn)及使用操作人員的健康產(chǎn)生危害等問(wèn)題，如黃曲霉毒素（AF）、赭曲霉毒素（OTA）等毒性強(qiáng)烈且標(biāo)品難以獲得，制約了層析檢測(cè)方法的應(yīng)用和推廣。

20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)，為傳統(tǒng)的免疫學(xué)分析方法提供了新的思路?？蓪⒖箼z測(cè)物的抗體作為靶分子，從噬菌體展示肽庫(kù)中淘選出抗原的模擬表位，利用抗原模擬表位和目標(biāo)分子能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體的特性，在層析檢測(cè)系統(tǒng)中可以采用模擬表位替代傳統(tǒng)的偶聯(lián)抗原，從而達(dá)到檢測(cè)的目的。

Lai等［37］建立了以模擬表位肽為競(jìng)爭(zhēng)物的膠體金標(biāo)免疫層析法，10ng/mL的OTA樣本可在10min內(nèi)被此方法檢出，T線以篩選的模擬表位肽替代了OTA－BSA的復(fù)合物，避免了真菌毒素OTA的使用，為真菌毒素的免疫層析檢測(cè)嘗試了新的方法。

目前，關(guān)于模擬肽的篩選及其在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用已成為研究的熱點(diǎn)，相信有更多的成功篩選會(huì)被應(yīng)用于層析檢測(cè)方法中。

4 展望

在食品安全領(lǐng)域，高靈敏度、高選擇性、多樣性、定量化已成為層析檢測(cè)方法的主流方向與發(fā)展趨勢(shì)。如何使這些新技術(shù)更快地實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化并應(yīng)用于實(shí)踐，滿足國(guó)家對(duì)不同樣品及不同待檢測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)的要求，將成為研究者努力的方向。

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Application of novel chromatographic detection techniques for food safety

LIU Dao－feng1DENG Sheng－liang2LAI Wei－h(huán)ua1

（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330047，China；2.Institute of Microbiology，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang，Jiangxi330029，China）

The novel chromatographic detection techniques were introduced，represented by nonimmune chromatography，immunochromatography based on mimotope peptide and immunochromatography with new labels，such as quantum dots，fluorescent microsphere，upconverting phosphor and magnetic nanobeads，and their application for food safety.The principle，advantages，the trend and prospect for development of chromatographic detection in the future were also discussed in the paper.

novel；chromatographic detection；food safety；application

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.069

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：30960301）

劉道峰（1988－），男，南昌大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：defoelau＠163.com

賴衛(wèi)華

2011－08－10