棉花蛋白提取方法及其蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

林必博

（楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

蛋白質(zhì)組是指由一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織的基因組所表達(dá)的全部相應(yīng)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象的學(xué)科，其主要研究技術(shù)雙向電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）可在同一張凝膠上分離上千種蛋白質(zhì)，具有大規(guī)模、高通量的特點(diǎn)[1]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究不僅可以分析有機(jī)體內(nèi)基因組所表達(dá)的整套蛋白質(zhì)，而且可提供大量有機(jī)體在各種生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的信息，深入揭示有機(jī)體代謝調(diào)控的本質(zhì)。棉花（Gossypum hirsutum L.）是最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的纖維作物，也是重要的油料植物[2]，其研究一直以來(lái)受到廣泛關(guān)注。

本文主要介紹了棉花蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，用于蛋白質(zhì)樣品提取的2-DE方法以及棉花蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展。

1 棉花蛋白質(zhì)樣品提取方法

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量好壞決定于2-DE是否能獲得高分辨率的凝膠圖譜和后續(xù)分析的準(zhǔn)確性。通常來(lái)講，所取材料的成分越復(fù)雜，蛋白質(zhì)樣品的制備越困難。棉花組織特別是研究的重點(diǎn)對(duì)象棉纖維和胚珠，是一種典型的頑拗性植物組織，含有多糖、酚類復(fù)合物、脂類、萜類以及大量的次級(jí)代謝物。因此，如何從棉花組織中提取高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯得尤為關(guān)鍵。Graves等[3]采用水法對(duì)棉花胚和纖維中的總蛋白進(jìn)行了提取。林金科等[4]則采用尿素法進(jìn)行了棉花蛋白質(zhì)的提取，但2-DE凝膠圖譜效果并不理想。徐子劍等[5]的研究也證明了2-DE凝膠圖譜效果并不理想。目前，棉花蛋白質(zhì)組學(xué)研究中蛋白質(zhì)樣品的提取，主要參考常用于植物組織總蛋白質(zhì)提取的三氯乙酸/丙酮沉淀法[6]和酚抽提法[7]。

1.1 三氯乙酸/丙酮沉淀法

三氯乙酸/丙酮沉淀法的要點(diǎn)：在二硫鍵還原劑二硫蘇糖醇（DTT）或β-巰基乙醇存在的情況下，采用含10%三氯乙酸（TCA）的丙酮溶液反復(fù)對(duì)液氮研磨后的組織樣品進(jìn)行沉淀。操作步驟[8]：（1）在液氮中將胚珠研磨成粉末，懸浮于至少5倍體積的含10%TCA和0.07%β-巰基乙醇的丙酮中（－20℃預(yù)冷），充分振蕩混勻，－20℃靜置 2 h 以上；（2）40000g，4 ℃離心 15 min，棄上清，將沉淀懸浮于－20℃的0.07%β-巰基乙醇的丙酮中，充分振蕩；（3）40000g，4 ℃離心15 min，棄上清；（4）將步驟（2），（3）重復(fù) 3 次；（5）將沉淀真空冷凍干燥，得到粗蛋白干粉。

1.2 酚抽提法

酚抽提法的要點(diǎn)：在二硫鍵還原劑二硫蘇糖醇（DTT）或β-巰基乙醇存在的情況下，采用Tris-HCl（pH值為8.65）提取緩沖液對(duì)液氮研磨的組織樣品粉末進(jìn)行蛋白質(zhì)抽提，然后加入This-HCl（pH值為8.0）飽和酚，在室溫下振蕩使蛋白質(zhì)分布于酚相，而后用乙酸銨甲醇溶液從酚相中進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀。主要操作步驟[9]：（1）植物組織用液氮研磨至粉末，加入3倍體積的提取緩沖液（500mmol/L Tris-HCl（pH 值為 8.65），50mmol/L EDTA，100mmol/L KCl，2 mmol/L DTT）和3倍體積This-HCl（pH值為8.0）飽和酚勻漿 1 min；（2）12000 g，20℃離心 10min，收集酚相以及界面，丟棄水相與沉淀；（3）酚相加入10倍體積含0.1 mmol/LNH4Ac的預(yù)冷甲醇溶液，-20℃過(guò)夜；（4）離心，沉淀懸浮于含0.1 mmol/L NH4Ac的冷甲醇，洗滌3次，冷丙酮洗滌1次；（5）將沉淀真空冷凍干燥，得到粗蛋白干粉。

1.3 三氯乙酸/丙酮沉淀法和酚抽提法提取效果的對(duì)比

從2種方法的操作程序比較來(lái)看，酚抽提法較三氯乙酸/丙酮沉淀法使用了相對(duì)較多的藥品和試劑，需要更長(zhǎng)的時(shí)間，且酚具有較大的毒性和腐蝕性。劉康等[9]分別用這2種方法提取棉花胚珠和纖維總蛋白質(zhì)，用三氯乙酸/丙酮沉淀法提取得到的蛋白質(zhì)獲得率為2.3 mg/g，雙向電泳后，用膠體考馬斯亮藍(lán)染色法染色后檢測(cè)的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)極少；銀染色后蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)沒(méi)有明顯的增加。而用酚抽提法得到的蛋白質(zhì)獲得率達(dá)到10.4 mg/g，是三氯乙酸/丙酮沉淀法的近5倍，雙向電泳后，用膠體考馬斯亮藍(lán)染色法染色后檢測(cè)的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)可以達(dá)到923個(gè)；銀染色可以檢測(cè)到1061 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。蛋白質(zhì)點(diǎn)在凝膠圖譜上pH值3～10的范圍均有分布，但主要集中在pH值4.3～8.6范圍。這表明酚抽提法獲得的蛋白質(zhì)種類較多，pI分布范圍較寬，蛋白質(zhì)容易溶解。賴童飛等[8]以棉花初生壁形成期的胚珠為材料，通過(guò)蛋白質(zhì)產(chǎn)率、純度測(cè)定以及凝膠電泳圖譜上蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)量對(duì)三氯乙酸/丙酮沉淀法和酚抽提法進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示，酚抽提法獲得的蛋白產(chǎn)率高、質(zhì)量好、種類多?？梢?jiàn)，酚抽提法比三氯乙酸/丙酮沉淀法能取得更好的效果。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，三氯乙酸/丙酮沉淀法可有效抑制蛋白水解酶和修飾酶活性，但對(duì)高分子量蛋白質(zhì)溶解性較差，難于沉淀低分子量蛋白質(zhì)，造成了損失，同時(shí)一些可溶性多糖和酚類多聚體雜質(zhì)也被提取，因此，提取的蛋白質(zhì)樣品產(chǎn)率低，且含有較多的雜質(zhì)；而酚抽提法中，This-HCl（pH值為8.0）飽和酚對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的溶解能力，使核酸和可溶性多糖分散于水相中[10]，且可以有效減少蛋白質(zhì)分子與其他分子間的相互作用[11]，所提取的蛋白質(zhì)樣品不僅產(chǎn)率高，而且具有較好的純度。

盡管現(xiàn)有資料均表明，酚抽提法比三氯乙酸/丙酮沉淀法在蛋白質(zhì)提取方面具有優(yōu)勢(shì)，且這2種方法所提取的蛋白質(zhì)在種類上存在一定差異。研究發(fā)現(xiàn)，酚抽提法能更有效地對(duì)酸性區(qū)域以及高分子量和低分子量蛋白進(jìn)行提取[8]，分析其原因是酚抽提法遠(yuǎn)離了酸性環(huán)境，提高了對(duì)占總數(shù)蛋白半數(shù)以上的酸性蛋白的溶解度；而三氯乙酸/丙酮沉淀法對(duì)高分子量蛋白質(zhì)溶解性較差和難以沉淀低分子量蛋白質(zhì)的性質(zhì)，決定了這2類蛋白質(zhì)的丟失，這是2種方法所提取蛋白質(zhì)在種類上存在差異的主要原因。以向日葵等其他植物為材料，對(duì)這2種方法提取效果的比較研究也得到了類似的結(jié)果[12-14]。

Yao等[15]通過(guò)對(duì)酚抽提法進(jìn)行改良，發(fā)現(xiàn)在提取過(guò)程中，添加交聯(lián)聚維酮（PVPP）和十二烷基硫酸鈉（SDS），可獲得更高的蛋白質(zhì)產(chǎn)率，且蛋白質(zhì)溶解性和凝膠上蛋白質(zhì)點(diǎn)的亮度有所提高。

綜上所述，酚抽提法較適合于棉花組織蛋白質(zhì)樣品的提取。但考慮到酚抽提法和三氯乙酸/丙酮沉淀法所提取蛋白質(zhì)在種類上的差異，在實(shí)際使用中這二者應(yīng)根據(jù)需要相互配合，以便取得更加全面的蛋白質(zhì)表達(dá)信息。此外，值得注意的是，由于棉花組織之間的差異，這2種方法可能有不同的效果，但目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

2 棉花蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

目前，棉花蛋白質(zhì)組學(xué)的研究依然處于探索階段，現(xiàn)有的報(bào)道主要集中在棉纖維的發(fā)育過(guò)程和抗逆性方面。

2.1 棉花發(fā)育蛋白質(zhì)組學(xué)分析

采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究，可深入分析與發(fā)育相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，有助于進(jìn)一步揭示棉纖維發(fā)育的調(diào)控機(jī)理。早在1988年，Graves等[3]就探索利用2-DE來(lái)研究棉花胚珠和纖維蛋白質(zhì)，根據(jù)-6～20DPA蛋白質(zhì)表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)變化，確定了-3 DPA是纖維起始發(fā)育的開(kāi)始。隨后，Turley等[16]在離體培養(yǎng)條件下產(chǎn)生纖維的胚珠中，通過(guò)2-DE發(fā)現(xiàn)了5個(gè)特異表達(dá)的蛋白質(zhì)。但這些研究中，2-DE分離效果并不理想。Ferguson等[7]比較了14 DPA和21 DPA這2個(gè)發(fā)育階段棉花纖維的蛋白質(zhì)2-DE圖譜，發(fā)現(xiàn)了45個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，對(duì)2個(gè)表達(dá)差異比較大的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行N-末端氨基酸測(cè)序，其中1個(gè)被鑒定為細(xì)胞質(zhì)蘋(píng)果酸脫氫酶，但由于未進(jìn)行差異表達(dá)蛋白質(zhì)的全面質(zhì)譜鑒定，因此，缺少進(jìn)一步的信息。

王娟等[17]以陸地棉徐州142為材料，比較了棉花纖維伸長(zhǎng)及初生壁形成期（10DPA）和次生壁增厚期（25 DPA）蛋白質(zhì)組的變化，采用MALDI-TOF-MS鑒定了15個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，并對(duì)5種差異蛋白質(zhì)進(jìn)行了半定量RT-PCR分析。結(jié)果表明，這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)分別屬于F-box家族蛋白、肌動(dòng)蛋白、β-微管蛋白、F1-ATP合成酶、ATP酶β亞基、膜聯(lián)蛋白、磷酸甘油酸酯激酶I、胞質(zhì)蘋(píng)果酸脫氫酶、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、谷氨酰胺合成酶、Cu-Zn超氧化物歧化酶、profilin、4-香豆酸輔酶A連接酶等，反映了棉纖維發(fā)育初生壁形成期至次生壁增厚期，與能量代謝、碳代謝、細(xì)胞周期調(diào)控和發(fā)育等相關(guān)蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，其不足之處是僅分析了2個(gè)階段。Yang等[18]則進(jìn)行了更為全面的研究，對(duì)5～25 DPA棉花胚珠和纖維發(fā)育5個(gè)典型階段的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行了詳細(xì)比較，鑒定了106個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。分析表明，這些蛋白質(zhì)參與能量和碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞應(yīng)答、氧化還原動(dòng)態(tài)平衡等涉及到棉纖維發(fā)育的細(xì)胞和代謝調(diào)控過(guò)程，進(jìn)而揭示了這些蛋白質(zhì)的變化與纖維發(fā)育的可能關(guān)系，為棉纖維發(fā)育過(guò)程中相關(guān)蛋白質(zhì)的功能研究提供了框架。

2.2 棉花抗逆境差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析

目前，已經(jīng)從多方面進(jìn)行了抗逆性研究，但應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究鮮有報(bào)道。李銳等[19]通過(guò)2-DE和質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)低溫前后不同抗冷級(jí)別的棉花品種錦3047和410的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較分析，在抗冷性較強(qiáng)的錦3047中發(fā)現(xiàn)50個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在低溫脅迫前后的表達(dá)量有明顯差異，其中有19個(gè)豐度值變大，絕對(duì)豐度明顯高于抗冷性較弱的410；11個(gè)豐度值變小，絕對(duì)豐度低于410；錦3047特有8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量上升，而在410中幾乎不表達(dá)。通過(guò)質(zhì)譜分析了其中30個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)逆境蛋白占20%，這些蛋白可能與錦3047的抗冷性具有密切關(guān)系。

王雪等[20]以陸地棉低酚棉品種豫無(wú)620為材料，在接種黃萎病菌后24，48，72 h提取葉片蛋白質(zhì)，采用2-DE技術(shù)研究棉花在黃萎病菌脅迫條件下葉片蛋白質(zhì)組的變化。結(jié)果表明，棉苗在黃萎病菌脅迫下，3個(gè)時(shí)間的葉片蛋白質(zhì)圖譜與未接種對(duì)照組均存在顯著差異，病菌脅迫下的棉苗葉片被誘導(dǎo)產(chǎn)生大量新的蛋白質(zhì)，而且在3個(gè)時(shí)間均出現(xiàn)了3個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，其通過(guò)MALDI-TOF-MS分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，分別鑒定為DEAD/H boxRNAhelicase、絲氨酸蛋白酶抑制劑和ODR-3蛋白，推測(cè)這些蛋白可能在棉花對(duì)黃萎病的抗性反應(yīng)中發(fā)揮作用。

3 展望

與國(guó)際棉花生產(chǎn)相比，我國(guó)皮棉總產(chǎn)量居世界第一，但棉纖維品質(zhì)較差[21]。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究，結(jié)合基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、生物信息學(xué)等，將有助于全面揭示棉纖維的發(fā)育機(jī)理和品質(zhì)形成的遺傳基礎(chǔ)，為我國(guó)棉纖維品質(zhì)的改良提供理論依據(jù)。抗逆性是棉花研究的重要方面，進(jìn)一步擴(kuò)展和深入研究蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)棉花的抗逆性，有助于揭示棉花的抗逆機(jī)理，為其新品種的選育提供重要的參考依據(jù)。

亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組是蛋白質(zhì)組學(xué)中的新生力量，分析某一亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組成，不僅可降低樣品復(fù)雜度，使分析簡(jiǎn)單化，而且還可富集亞細(xì)胞的低豐度蛋白，具有重要的研究意義[22]。但目前棉花的蛋白質(zhì)組學(xué)研究?jī)H包括棉纖維、胚珠、子葉、葉片等，有待于深入到亞細(xì)胞水平。有關(guān)棉花的蛋白質(zhì)組學(xué)研究不管是廣度還是深度，仍處于探索階段，大規(guī)模、系統(tǒng)化的研究還相對(duì)匱乏。相信隨著研究工作的開(kāi)展，蛋白質(zhì)組學(xué)研究在棉花中的應(yīng)用將會(huì)更加深入廣泛，為棉花的品質(zhì)改良等研究提供大量信息。

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