分子標(biāo)記技術(shù)在黃瓜育種中的應(yīng)用

張 佩 芝

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝分院，哈爾濱 150069)

分子標(biāo)記(molecular marker)是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶及等位酶。狹義的分子標(biāo)記指的就是DNA標(biāo)記，而這個界定現(xiàn)在被廣泛采納。在國家“863計劃”的支持下，我國科研人員利用分子標(biāo)記技術(shù)掌握了一批大農(nóng)作物重要經(jīng)濟(jì)性狀的改良方法，并應(yīng)用于遺傳育種實(shí)踐中，同時建立了分子標(biāo)記輔助育種與常規(guī)育種相結(jié)合的技術(shù)體系，提高了定向育種的效率和水平。

在重要的園藝作物黃瓜上，則開展了黃瓜抗病性(霜霉病、炭疽病、白粉病、枯萎病、細(xì)菌性角斑病)、黃瓜全雌性、黃瓜性別分化等重要性狀的分子標(biāo)記技術(shù)研究，構(gòu)建了一批有應(yīng)用價值的分離群體，獲得了一批重要性狀的分子標(biāo)記或QTL；在國際上首次對黃瓜性別決定基因進(jìn)行定位，構(gòu)建了黃瓜歐亞生態(tài)型間的飽和永久分子圖譜。利用黃瓜白粉病分子標(biāo)記技術(shù)對育種材料進(jìn)行抗性鑒定和篩選，選出抗白粉病單株40余個。由于分子標(biāo)記技術(shù)在黃瓜育種中的重要地位，本文綜述了分子標(biāo)記技術(shù)在黃瓜育種中的應(yīng)用現(xiàn)狀，以期為今后黃瓜育種提供理論指導(dǎo)。

1 分子標(biāo)記遺傳圖譜的建立

分子標(biāo)記遺傳圖譜是指以遺傳標(biāo)記間重組頻率為基礎(chǔ)的染色體或基因內(nèi)位點(diǎn)的相對位置的線性排列圖。它可為基因定位與克隆及基因組結(jié)構(gòu)和功能的研究提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。但由于黃瓜的遺傳基礎(chǔ)狹窄，其遺傳圖譜相對大田作物如水稻、小麥等較為落后，經(jīng)典的遺傳圖譜僅由一百多個顏色、形態(tài)和抗病性等基因組成6個連鎖群[1]。

人們通過對黃瓜的栽培種的雜交與研究，深入地探索黃瓜的遺傳規(guī)律得到豐碩成果：Kennard等[2]利用RFLP、RAPD、同工酶、形態(tài)和抗病性所產(chǎn)生的標(biāo)記，進(jìn)行了黃瓜遺傳圖譜的構(gòu)建，得到58個位點(diǎn)的遺傳圖譜，分屬10個連鎖群，該圖譜覆蓋的基因組總長度約為766cm，標(biāo)記間平均距離約為21cm[3]；Danin-Poleg等[4]以GY14×PI183967為材料，用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了黃瓜的遺傳圖譜，將14個SSR標(biāo)記定位到8個連鎖組群中，整合圖譜總長為783.2cm，并發(fā)現(xiàn)其中有9個標(biāo)記與甜瓜相同；張海英等[5]利用黃瓜歐洲溫室生態(tài)型栽培種高代自交系“歐洲八號”和華北露地生態(tài)型品種“秋棚”雜交獲得的140份重組自交系，構(gòu)建了包含有141個AFLP標(biāo)記、89個RAPD標(biāo)記、4個SSR標(biāo)記等234個標(biāo)記的連鎖圖譜，由9個連鎖組群組成，覆蓋整個基因組727.5cm，平均圖距3.1cm。整合工作的進(jìn)行，使黃瓜遺傳圖譜的密度和覆蓋基因組的長度顯著增加，為基因定位和分子標(biāo)記輔助育種提供了理論依據(jù)[6]。

2 相關(guān)基因的定位

生物的性狀是由基因控制的，想獲得優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)性狀就要尋找與質(zhì)量性狀基因緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記。目前，隨著新的分子標(biāo)記技術(shù)不斷成熟、黃瓜遺傳圖譜的日趨完善，與黃瓜重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因的定位也取得了很大進(jìn)展。發(fā)表的黃瓜各類形態(tài)學(xué)基因已達(dá)到132個。顧興芳等[7]運(yùn)用AFLP技術(shù)，采用集群分析法(BSA)進(jìn)行與黃瓜果實(shí)苦味基因連鎖的分子標(biāo)記的研究，找到了與苦味基因連鎖的兩個顯性AFLP標(biāo)記；陳學(xué)好等[8]用65條ISSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，其中引物N92在親本和DNA池之間擴(kuò)增出一條大小為850bp多態(tài)性片段，經(jīng)F2代群體135個單株驗(yàn)證，該片段穩(wěn)定出現(xiàn)，在單性結(jié)實(shí)植株中表現(xiàn)為無帶，在非單性結(jié)實(shí)植株中表現(xiàn)為有帶，可以作為鑒別單性結(jié)實(shí)與非單性結(jié)實(shí)的標(biāo)記引物。

3 親緣關(guān)系的分析與種質(zhì)資源多樣性的檢測

分子標(biāo)記能夠有效地進(jìn)行種質(zhì)親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性的研究。該技術(shù)在黃瓜上也有這深入的研究和報道：Dijkhuizen等[9]利用RFLP標(biāo)記評價兩組黃瓜種質(zhì)的遺傳多樣性。在第一組16個品系中，RFLP標(biāo)記反映了與同工酶分析一致的品種間的親緣關(guān)系；第二組35個栽培品種中，RFLP分析揭示了與形態(tài)及實(shí)際系譜關(guān)系相一致的品種間的親緣關(guān)系，認(rèn)為RFLP可用于黃瓜分類鑒定和品種保護(hù)；Staub等[10]用同工酶和RAPD標(biāo)記評價了38個黃瓜品系的多態(tài)性。顧興芳等使用AFLP技術(shù)對國內(nèi)外多個生態(tài)型的15份黃瓜品種進(jìn)行了遺傳親緣關(guān)系分析，所用14個引物組合有9個組合得到的譜帶清晰、齊全。陳勁楓等采用SSR和RAPD兩種分子標(biāo)記對黃瓜屬22份不同類型材料的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，野黃瓜與黃瓜間的遺傳距離小于其與甜瓜間的距離[11]。

黃瓜的品種分類方法較多，包括地理分布和形態(tài)等不同變種或類型的界定方式。我國的黃瓜育種研究存在育種材料親緣過分單一的問題，育種工作進(jìn)展艱難。因此對黃瓜各種生態(tài)類型之間的親緣關(guān)系的研究，有助于合理引進(jìn)國外種質(zhì)資源和充分利用野生種質(zhì)資源，有效地進(jìn)行親本選擇選配，提高育種效率。

4 分子標(biāo)記在黃瓜育種中的輔助選擇作用

植物育種中分子標(biāo)記輔助選擇是通過分析與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記來判斷目標(biāo)基因是否存在。對目標(biāo)性狀進(jìn)行正確選擇和有效分離是植物育種的中心環(huán)節(jié)。分子標(biāo)記輔助育種是現(xiàn)代分子生物學(xué)與傳統(tǒng)遺傳育種的結(jié)合，借助分子標(biāo)記對育種材料從DNA分子水平上進(jìn)行選擇，可以對與目標(biāo)性狀連鎖的單個或多個基因進(jìn)行檢測、定位和跟蹤，并可以檢測是否有不良性狀基因的連鎖，減少了育種選擇的盲目性，從而達(dá)到作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等綜合性狀的高效改良，提高育種效率[3]。

Witkowicz等[12]利用NILs結(jié)合BSA法，找到了與黃瓜性別表現(xiàn)相關(guān)的AFLP標(biāo)記。黃瓜性別分化由3個主要基因控制：F、M和G，通過基因互作共同決定黃瓜性別；陳勁楓等[13]也利用RAPD結(jié)合BSA法對黃瓜性別特異基因進(jìn)行了分子標(biāo)記篩選，發(fā)現(xiàn)全雌性單株都含有特異片段B11-1000，并以ACC合酶基因的特異引物檢測分離群體單株，發(fā)現(xiàn)該酶基因不具有性別特異性，這與前人研究結(jié)果不同。黃瓜全雌性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲得，為早期進(jìn)行性別鑒定提供了理論指導(dǎo)。利用分子標(biāo)記的方法在黃瓜育種中起到了巨大的作用，即讓所得品種更快捷地達(dá)到育種目標(biāo)，又準(zhǔn)確地使基因更好的表達(dá)，為育種工作更好更快地完成提供了理論基礎(chǔ)。

5 品種純度鑒定

在植株育種中最大的困難之一就是品種純度的鑒定，常規(guī)的鑒定方法是根據(jù)田間表型性狀進(jìn)行鑒定，后來發(fā)展為利用同工酶的方法，但是兩種方法均存在著不同程度的缺陷。現(xiàn)在的分子標(biāo)記育種彌補(bǔ)了以上兩種方法的缺點(diǎn)，該方法快速(數(shù)小時或數(shù)天)、準(zhǔn)確、簡便、成本也不太高，在幼苗或種子階段就可鑒定出品種的純度。

Matsuura等[14]發(fā)現(xiàn)利用RFLP分析可快速檢測黃瓜雜交一代F1品種的純度。孫敏等從102個RAPD引物中篩選出應(yīng)用于黃瓜種子純度鑒定的引物32條，并建立了應(yīng)用于鑒定親本和雜交種子的RAPD指紋圖譜。Truksa等利用3個黃瓜親本材料，分析了其RAPD多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性程度較差，認(rèn)為RAPD分析不適于驗(yàn)證黃瓜雜交種純度。

在黃瓜育種上，常規(guī)方法乃至部分改良方法中均不同程度地存在一些缺點(diǎn)，而新興的技術(shù)——分子標(biāo)記育種能夠在某種程度上彌補(bǔ)常規(guī)方法的不足。分子標(biāo)記育種的知識體系龐大而系統(tǒng)，它是具有特異性和針對性的，通過今后更加系統(tǒng)深入的研究，該技術(shù)有著廣闊的前景，對以后的黃瓜種質(zhì)資源創(chuàng)建、管理以及利用必將發(fā)揮更加巨大的作用。

[1]Pierce LK，et al.黃瓜的基因和連鎖群[J].中國蔬菜，1993，(4):54～57.

[2]KENNARD W K，POETTER.K，DIJKHUIZEN A，et al Linkages.amongRFLP，RAPD isozyme disease-resistance and morphological markers in narrow and wide crosses of cucumber[J].Theor.Appl.Genet.，1994，(89):42～48.

[3]孫振久，王亞娟，張顯.黃瓜分子標(biāo)記輔助育種研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報，2006，26(6):1290～1294.

[4]DANIN-POLEG Y，REIS N，BAUDRACCO-ARNAS S.Simple sequece repeats inCucumis mapping and map merging[J].Genome，2000，(43):963～974.

[5]ZHANG H Y，GE F W，WANG Y J，XU Y，CHEN Q J.Construction of a renference linkage map for cucumber[J].Acta Horticultural Sinica，2004，31(5)：617～622.

[6]魏惠軍，杜勝利，馬德華.分子標(biāo)記在黃瓜遺傳育種研究中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報，1999，(2)：28～29.

[7]顧興芳，張素勤，張圣平.黃瓜果實(shí)苦味Bt基因的AFLP分子標(biāo)記[J].園藝學(xué)報，2006，33(1):140～142.

[8]陳學(xué)好，王佳，徐強(qiáng)，嵇怡，梁國華.一個與黃瓜單性結(jié)實(shí)基因連鎖ISSR標(biāo)記[J].分子植物育種，2008，3(1)：85～88.

[9]Dijkhuizen A， et al. RFLP variation and genetic relationships in cultivated cucumber Euphytica，1996，90(1):87～97.

[10]Staub JE.Comparation of isozyme and random amplified polymorphic DNA data for determining intraspecific variation in cucumis.Genetic Resources and Crop Enalrtion，1997，44(3):257～269.

[11]王桂玲，秦智偉.分子標(biāo)記技術(shù)在黃瓜育種中的應(yīng)用[J].世界農(nóng)業(yè)，2005，(1)：46～47.

[12]WITKOWICZ J，URBANCZYK-WOCHNIAK E，PRZYBECKI Z.AFLP marker polymorphism in cucumber (Cucumis sativusL.) nearisogenic lines differing in sex expression[J].Cell.Mol.Biol.Lett.，2003，8(2):375～381.

[13]陳勁楓，婁群峰，余紀(jì)柱，莊飛云.黃瓜RAPD基因的分子標(biāo)記[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2003，19(4):11～14.

[14]Matsuura S， et al. An approach for rapid checking of seed purity by RFLP Analysis of nuclear DNA in F1 hybrid of cucumber L. Joural of the Japanese Society for Horticultural Science，1994，63(2):379～383.