骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠腦缺血再灌注損傷的修復(fù)作用

許長春，郭云霞，許科鵬

腦卒中已成為人類致死、致殘的重要原因之一。其發(fā)病率有逐年上升的趨勢。其中以缺血性卒中最為常見。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為腦缺血引起缺血區(qū)神經(jīng)元不可逆死亡。梗死區(qū)周邊的成熟神經(jīng)元不能再生來彌補(bǔ)死亡的神經(jīng)元，因此導(dǎo)致腦缺血預(yù)后不佳。最近的研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）在某些內(nèi)在機(jī)制和微循環(huán)影響下具有類似胚胎干細(xì)胞的高度分化能力，具有取材簡單，來源豐富，可從患者自身獲得而不存在組織相容性的問題，治療時可避免長期應(yīng)用免疫抑制劑對患者的損害，這為細(xì)胞移植治療腦缺血損傷提供了可能。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 成年雄性SD大鼠（上海實驗動物中心提供）34只，質(zhì)量270～320 g，模型制作過程中淘汰4只，30只腦缺血模型大鼠隨機(jī)分為MSCs移植組，缺血對照組各15只。

1.2 MSCs的分離培養(yǎng)及鑒定 采用文獻(xiàn)[1]方法，麻醉狀態(tài)下取SD大鼠雙側(cè)股骨和脛骨，用DHank’s液沖洗骨髓腔收取骨髓，以密度為1.082 g/L的percoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離出骨髓單個核細(xì)胞，移到含10%FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基中，結(jié)合貼壁法以1.0×104個/ml的細(xì)胞密度接種培養(yǎng)，按 1∶2進(jìn)行擴(kuò)增傳代（1～3代）。選取生長良好的原代及1、2、3代細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶室溫消化、離心，收集培養(yǎng)好的大鼠MSCs，將Hoeschst 33342加入大鼠MSCs培養(yǎng)基混懸液中，終質(zhì)量濃度為50 μg/ml，于37℃培養(yǎng)箱中避光共同培養(yǎng)24 h，然后用 D-Hank’s液洗滌 3次以去除未結(jié)合的Hoeschst33342，并收集已結(jié)合Hoeschst33342的細(xì)胞，用不含胎牛血液的細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM-LG將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。

1.2.1 大鼠腦缺血再灌注（MCAO）模型制作 參照文獻(xiàn)[2]的方法，用直徑0.32 nm的尼龍線插入大鼠右側(cè)頸動脈，深度為20～22 mm，阻斷右側(cè)大腦中動脈，120 min后將尼龍線拔出。

1.2.2 MSCs移植 建立MCAO模型24 h后移植組于頸內(nèi)動脈給予MSCS，懸浮液200 μl，細(xì)胞數(shù)為2×106個，對照組頸內(nèi)動脈給與MSCs移植組同等體積的生理鹽水作為對照。

1.2.3 神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評分（NSS） 參照文獻(xiàn)[3]的方法，分別于移植后1、7、14、21 d對MSCs移植組及缺血對照組大鼠進(jìn)行NSS，主要是運(yùn)動，感覺功能，平衡能力及生理反射；總分為18分，正常為0分，分值越高其神經(jīng)損害越嚴(yán)重。

1.2.4 免疫組化驗測 于MSCs移植后1、7、14、21 d各組隨機(jī)處死2只大鼠，4%多聚甲醛500 ml左心室灌注后，斷頭取腦，置4%多聚甲醛后固定24 h，冠狀位切取以缺血區(qū)域為中心的包括側(cè)腦室室管膜下區(qū)、基底節(jié)區(qū)的厚度2 mm的腦組織標(biāo)本，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5 μm，進(jìn)行HE染色后鏡檢。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 檢測數(shù)據(jù)先求出組內(nèi)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 MSCs的鑒定方法與分化 將所培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。發(fā)現(xiàn)MSCs表面標(biāo)記物CD29、CD44呈陽性表達(dá)，而CD14、CD34呈陰性表達(dá)，說明試驗中分離培養(yǎng)的細(xì)胞非造血干細(xì)胞而為MSCs。經(jīng)免疫組化分析，各代細(xì)胞90%表達(dá)Nestin陽性進(jìn)一步證實是MSCs（胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的標(biāo)黃色顆粒物）。

2.2 光鏡下觀察結(jié)果 各組均可見到明顯梗死灶，位于基底節(jié)、皮質(zhì)下白質(zhì)和皮層，缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，可見神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死呈胞體皺縮，核固縮碎裂溶解，胞漿濃縮紅染，神經(jīng)纖維輸送，間質(zhì)水腫明顯，炎癥細(xì)胞浸潤。根據(jù)標(biāo)記發(fā)現(xiàn)MSCs主要存在于腦皮質(zhì)、皮質(zhì)下等處。通過標(biāo)記發(fā)現(xiàn)MSCs移植后1d在海馬、皮質(zhì)及小腦等部位部分MSCs細(xì)胞即可表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物神經(jīng)元特異性核蛋白，且隨著移植時間的延長，標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)目增多。

2.3 NSS變化 MSCs移植后，1、7 d NSS與對照組比較無顯著性差異 （7.8±1.4 vs 7.9±1.1，6.8±1.2 vs 6.9±1.2；P>0.05）， 但 14、21 d 移植組 NSS 均明顯低于對照組 （5.0±1.2 vs 6.2±1.3，4.6±1.4 vs 5.9±1.0；P<0.05）。

3 討 論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓中的一種非造血干細(xì)胞，具有多向分化潛能，可以分化為多種造血以外的組織細(xì)胞，特別是中胚層和外胚層來源的組織細(xì)胞。缺血性腦卒中現(xiàn)有的溶栓抗凝等治療手段仍存在很大的局限性，不能根本改善腦梗死的預(yù)后。新近的研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在一定的條件分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞等[4]。從而為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的手段。動物實驗證明神經(jīng)干細(xì)胞移植可以在一定程度上修復(fù)腦缺血損傷，使神經(jīng)功能得到明顯改善，這說明神經(jīng)干細(xì)胞移植是治療神經(jīng)功能損傷的有效手段，但由于神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量很少，體外培養(yǎng)很難擴(kuò)增，并且存在移植變異排斥等問題，從而使其應(yīng)用受到很大的限制。而MSCs從骨髓中分離得到取材容易，且對健康無害，體外分離培養(yǎng)能快速擴(kuò)增，可以自體移植而且不存在免疫排斥反應(yīng)等問題。因此，MSCs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中占有越來越重要的地位。

本實驗中，筆者用MSCs頸內(nèi)動脈移植治療大鼠缺血性損傷，大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)明顯優(yōu)于對照組，MSCs移植組神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死數(shù)量明顯減少，炎癥細(xì)胞減少，水腫減輕，以上情況提供了行為學(xué)上和病理學(xué)上的實驗依據(jù)，說明以MSCs治療缺血性腦損傷是切實有效的。

一般認(rèn)為MSCs對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)主要有以下幾種機(jī)制：①作為干細(xì)胞，MSCs可能在腦組織中分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞，替代發(fā)生壞死和凋亡的神經(jīng)細(xì)胞，從而起到腦保護(hù)作用，但是分化的比率較低，分別為1%和8%，如此少量的分化細(xì)胞能發(fā)揮多大的神經(jīng)替代功能有待進(jìn)一步的研究；②MSCs激活了存在于皮質(zhì)下區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）[5]，被激活的內(nèi)源性NSC進(jìn)一步定向分化為神經(jīng)細(xì)胞起到腦保護(hù)作用；③MSCs進(jìn)入腦組織內(nèi)部可分泌和（或）促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、血管內(nèi)皮生長因子、神經(jīng)生長因子和干細(xì)胞生長因子等[6]，這一機(jī)制已得到公認(rèn)。

[1]Friedenstein AJ,Gorskaja JF,Kulagina NN.Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs[J].Exploration of Haematol,1976,4(5):267-274.

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[3]Chen J,Li Y,Wang L,et al.Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stronal cells after cerebral ischemia in rats[J].Stroke,2001,32:1005-1011.

[4]ZHANG Hua-biao,XU Yu-ming,ZHANG Su-ming.The experimental study on rat mesenchymal stem cells induced to differentiate into nerve-like cells in vitro[J]Chinese Journal of Neuroimmunology and Neurology,2003,10(4):276.

[5]Sato K,Iwai M,Nagano I,et al.Temporal and spacial changes of BrdU immunoreactivity in amygdala kindling development.Neurol Res,2002,24:593.

[6]Chen X,Li Y,Wang L,et al.Ischemic rat brain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production.Neuropathology,2002,22:275.