白血病干細胞研究現(xiàn)狀

呂俊廷 (綜述), 楊志剛(審校)

(廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,廣東醫(yī)學院檢驗學院, 廣東 湛江 524001)

自從 1994年 Lapidot等[1]首次報道了具有 CD34+/CD38-表型的人急性髓性白血病干細胞(leukem ia stem cells,LSC)以來,人們對 LSC的研究不斷深入。LSC是指白血病細胞中存在的一種類似正常造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSC)的但數(shù)量較少且具有自我更新能力,分化潛能的細胞。是白血病的發(fā)生發(fā)展、耐藥、復發(fā)及預后的影響因素之一。本文將其研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 LSC的來源

對于 LSC的來源,尚沒有明確的結(jié)論。目前存在四種觀點：①來源于 HSC;②來源于部分分化的造血祖細胞;③來源于血液血管干細胞和 GMP(granulocyte macrophage precursors)細胞;④來源于相對成熟的白血病細胞。

第一種觀點是在比較 LSC與 HSC的生物學特點提出來的。LSC與 HSC都具有自我更新和分裂增殖能力;具有多種相同的細胞表面標志性分子和多條相同的自我更新調(diào)節(jié)通路。另外,在細胞端粒酶的活躍表達、抗凋亡調(diào)控通路的活化、膜轉(zhuǎn)運體活性的升高,以及遷徙與轉(zhuǎn)移的能力上,兩者都有著明顯的相似性。有實驗證實,干細胞與腫廇干細胞在一定的條件下還可以相互轉(zhuǎn)化,如胚胎植入體內(nèi)可以誘導成畸胎瘤,而畸胎瘤細胞注入鼠囊胚內(nèi)細胞團可以形成正常胚胎[2]。

第二種觀點的依據(jù)主要來自對白血病不同發(fā)展階段細胞特征的研究。這些研究表明,早期突變可能發(fā)生在造血干細胞上,最終的轉(zhuǎn)化事件改變了造血干細胞或下游祖細胞表型[3]。這里有兩種可能,一是定向祖細胞通過累積額外突變獲得干細胞樣的自我更新能力,二是正常造血干細胞通過累積基因組和(或)基因的表觀遺傳變化,例如丟失了凋亡能力,最終導致其分化到定向細胞階段又獲得自我更新能力。Levis等[4]研究表明,由 t(15;17)平衡易位導致的 M3的致病融合基因 PML-RARα(維 A酸受體 a),僅出現(xiàn)在 CD34-/CD38+的細胞中,不出現(xiàn)在 CD34+/CD38-的干細胞中,說明白血病的轉(zhuǎn)化事件發(fā)生在干細胞的以后階段 -祖細胞,甚至是成熟細胞。另外,已經(jīng)有研究認為急性白血病來源于粒巨祖細胞(granulocyte-macrophage progenitors),其和造血干細胞一樣的自我更新能力是獲得性的[5]。Cozzio等[6]用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導純化HSC、CMP(commonmyeloid progenitors)和 GMP(granulocytemacrophage progenitors),使它們帶有白血病融合基因 MLL-ENL,3種細胞均在小鼠體內(nèi)誘導出急性髓系白血病(acutemyeloid leukemia,AML)模型,第 1次用實驗直接證明了LSC可來自于分化了的祖細胞。

第三種觀點來自于對慢性粒細胞白血病(CML)的研究。BCR-ABL融合基因為 CML的細胞遺傳學標志。Gunsilius等[7]在 CML患者內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)有BCR-ABL融合基因存在,CML干細胞源于 CML患者骨髓中的血液血管干細胞群體,表達 BCR-ABL融合基因。在單細胞水平上證實該細胞群體有成血管內(nèi)皮細胞和造血的潛能,且可在健康小鼠體內(nèi)復制出CML。CML干細胞群體的分離確認證實 CML的基因轉(zhuǎn)化發(fā)生在較 HSC更為原始的血液血管干細胞水平上。Jamie-son等[8]發(fā)現(xiàn)多數(shù)慢粒病人在加速期時體內(nèi) GMP(granulocytemacrophage precursors)細胞內(nèi) βcatenin的核定位增加,在急變期更是顯著,而 β-catenin與自我更新能力相關(guān),這意味著慢粒急變的本質(zhì)是在 GMP細胞水平獲得自我更新能力轉(zhuǎn)化成了 LSC。

第四種觀點認為相對成熟的白血病細胞可以通過逆向分化重新獲得 LSC的性質(zhì)。Tsuji-Takayama等[9]用 5-氮雜胞嘧啶核苷(5-azacytidine,5-AzaC)使小鼠胚胎細胞已分化細胞逆分化成具有細胞 -細胞間界限不太明顯的干細胞樣形態(tài)結(jié)構(gòu)的細胞,而且這些逆轉(zhuǎn)細胞獲得部分干細胞標志物陽性表型。von Melchner等[10]用在全反式維甲酸存在的人胎盤條件培養(yǎng)基(半固體培養(yǎng)基)上連續(xù)傳代,使人前髓細胞性白血病細胞(HL-60)逆轉(zhuǎn)為重新獲得增殖潛能而末端分化(HL-60原來可還原四唑硝基藍 NBT的活性)特征消失的細胞,這些實驗都證明了腫瘤細胞在一定條件下可逆轉(zhuǎn)為腫瘤干細胞或腫廇干細胞樣細胞。

2 LSC免疫表型

免疫表型是細胞功能和身份的標志。LSC具有干細胞的特性,也具有與 HSC相似的免疫表型。目前的研究熱點是尋找 LSC的特殊表型,從而將其同 HSC區(qū)別開來,進行針對于 LSC的特異性治療。1994年,Lapidot等[1]報道了具有 CD34+/CD38-表型的人急性髓性白血病干細胞,這是人類惡性腫瘤干細胞的道次報道。1997年、2000年 Blair等[11,12]報道了具有CD34+/Thy-1(CD90)-和CD34+/c-kit(CD117)-的人急性髓性白血病干細胞,2002年 Peled等[13]報道了具有 Ph+/CD34+/CXCR4+表型的慢性髓細胞白血病干細胞,2005年 Feller等[14]報道了 CD133 and/or CD34的人急性髓性白血病干細胞。2006年Deshpande等[15]通過融合基因 CALM-AF10衍生的AML小鼠模型發(fā)現(xiàn)了 LSC和 HSC的差異,在這個模型中,LSC并不表達髓系抗原而表達淋巴系的特殊標記 -B220。而且在 CALM-AF10衍生的人 AML中也發(fā)現(xiàn)了 B220+群體。2007年 Hosen等[16]研究發(fā)現(xiàn),CD96可能是急性髓性白血病干細胞的一個獨特的表型標志。Jordan等[17]報告了 AML患者 LSC表達CD123,而正常 HSC不表達,van Rhenen等[18]發(fā)現(xiàn)CLL-1在 CD34+CD38-的 LSC上有較高表達,在正常 CD34+CD38-的 HSC上卻沒有表達。對 CD34+的 AML患者,CLL-1是惡性 CD34+CD38-干細胞的一個標記,其表達水平在初診和復發(fā)時無顯著差異。Cox等[19]用原代培養(yǎng)的人類急性淋巴細胞白血病細胞進行研究發(fā)現(xiàn),只有具有 CD34+/CD19-或 CD34+/CD20-細胞表面標志的亞群細胞在移植入 NOD/SCID小鼠后才能引發(fā)人類急性淋巴細胞白血病,即在人類急性淋巴細胞白血病中存在有少量以 CD34+/CD19-或 CD34+/CD20-為特異細胞表面標志的腫瘤干細胞。Jin等[20]用活化的抗 CD44的單克隆抗體Mab(H90)在對正常的組織沒有影響的情況下,可以消除 NOD/SCID小鼠體內(nèi) AML LSC。CD44+可否作為 LSC的一個表面標記,還有待于進一步研究。

目前較公認的急性髓系白血病(M3除外)干細胞的免疫標志為 CD34+CD38-CD71-HLA-DRCD90-CD117-CD123+。至于其它類型的白血病干細胞表面標志,還需更多實驗來支持,但 CD34+/CD38-是 LSC表面標志的金標準。

3 LSC的調(diào)控機制

目前有關(guān) LSC的分子調(diào)控機制報告較多,歸納起來主要包括磷酸肌酸激酶 3(PI3K)、細胞膜酪氨酸激酶 -3(FLT3)、Bm i-1基因、MLL基因 、Notch家族基因 、HOX家族基因 、p53 、GATA-1、STAT-5等,對這些調(diào)控分子的研究有助于我們更深刻了解 LSC的特性,有助于發(fā)現(xiàn)白血病新的治療措施。

4 LSC的耐藥機制

LSC的耐藥機制止前還沒完全闡明,但可能與LSC的幾個固有特征有關(guān)：①LSC通常處于相對靜止或休眠狀態(tài),而當前的抗腫瘤藥主要是靶向迅速增生的分裂期細胞,因此 LSC不受影響。Guzman等[21]的研究表明,平均高達 96%的 LSC處于 G0期。處于這一時期的細胞對常用的化療藥物不敏感,這也使得LSC能夠避開傳統(tǒng)的細胞周期性化療藥物的攻擊,AML患者經(jīng)化療緩解后,未被清除的 LSC還能繼續(xù)維持疾病,最終造成絕大多數(shù)患者仍會復發(fā)。②LSC表面表達多種膜轉(zhuǎn)運蛋白,能夠?qū)?Hoechst 33342等熒光染料以及多種化療藥物排出細胞外,其中 ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)膜轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮了重要的藥物外排作用。以往的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞上的ABC(ATP結(jié)合盒)轉(zhuǎn)運器可以在癌細胞中過度表達,并將已經(jīng)進入細胞內(nèi)的多種抗癌藥物又“泵”出癌細胞,從而誘發(fā)癌細胞的多藥耐藥性,降低抗癌化療藥物的臨床療效。對此,臨床上常利用耐藥逆轉(zhuǎn)劑來應對,但最近 Raaijmakers等[22]的研究發(fā)現(xiàn),常用的耐藥逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米和環(huán)孢菌素 D衍生物PSC833,只能優(yōu)先阻止抗癌藥物米托蒽醌從正常 HSC中泵出,卻無法有效抑制米托蒽醌從 LSC中排出,這也對白血病的治療方法提出了一個新的問題。③高效的 DNA修復機制和凋亡信號的抵制等。

本組篩查對象中發(fā)現(xiàn)實性結(jié)節(jié)的處理采用Fleischner學會處理指南[4]，初始發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)直徑在6mm以上的，需要把結(jié)節(jié)的大小、形態(tài)、密度及所處肺葉的位置在記錄表上詳細填寫，而對于初始發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)在6mm以下的，如果結(jié)節(jié)出現(xiàn)分葉、短毛刺、胸膜凹陷等危險因素的也需要提高警惕，應建議1～3月內(nèi)再次給予低劑量CT掃描復查，觀察結(jié)節(jié)的形態(tài)、大小及密度情況，如果此類結(jié)節(jié)同時存在分葉、短毛刺及胸膜凹陷等多種危險因素的[5]，應建議活檢或直接手術(shù)切除。

5 LSC理論的臨床價值

目前 LSC理論認為,化療可以殺死白血病腫廇細胞,但殺滅不了白血病干細胞,腫瘤干細胞的存在是白血病容易復發(fā)及耐藥的原因之一,白血病干細胞的多少也是影響白血病患者預后因素之一。白血病腫廇細胞在特定條件下可逆轉(zhuǎn)為白血病干細胞,逃避化療藥物的傷害,這是白血病復發(fā)、耐藥及預后不良的原因之一。因此,對 LSC的深入研究,將為白血病的早期診斷及治療提供新的思路和策略。

5.1 LSC在白血病的早期診斷：目前臨床明確診斷AML的條件是要求形態(tài)異常的 AML細胞達到 30%以上,這從病程上講已經(jīng)不是早期診斷,如果能利用抗體選擇方法識別出更特異的 AML LSC表面抗原,則能在AML形態(tài)學特點尚未出現(xiàn)之前,即發(fā)病初期的分子水平上明確 LSC的分子遺傳學標記,實現(xiàn) AML更早期的診斷。

5.2 LSC在白血病的預后判斷：LSC存在是白血病復發(fā)的因素之一,在白血病治療過程中追蹤檢查 LSC的變化,聯(lián)合微小殘留病(MRD)的檢測技術(shù),可以更好地判斷白血病患者的預后。

5.3 LSC在白血病治療上的研究：導致白血病復發(fā)與耐藥的根源是 LSC的存在,只有選擇性地徹底殺死LSC才有望徹底治愈白血病,就目前研究所知,可以有以下幾種思路和策略。

5.3.1 根據(jù) LSC表面特異性分子標記的不同,或其表達的蛋白質(zhì)差異,對其實施靶向殺滅。對于白血病而言,靶向抗原可選擇 CD123(IL-3R)分子,其表達于 LSC而非正常 HSC的特性很適合作為靶向治療的目標。大多數(shù) AML母細胞表面表達 IL-3R。Feuring-Buske等[23]分別用體外培養(yǎng)和移植至 NOD/SCID小鼠體內(nèi)形式證明了白喉毒素 -IL-3融合蛋白(DT388IL3)對白血病母細胞和 LSC群有毒性作用,而對正常前體細胞無毒性。在化療前或化療中同時應用ABCG2抑制劑或抗 ABCG2抗體,可增加 LSC對化療藥物的敏感性,能有效幫助清除 LSC?，F(xiàn)已應用于臨床的吉姆單抗(gemtuzumab)/奧佐米星(ozogamicin)是人源化的抗 CD33單抗和細胞毒抗腫瘤抗生素刺孢霉素(calicheamicin)的偶聯(lián)物,用于治療復發(fā)的 AML,并取得了顯著療效。最近的發(fā)現(xiàn)抗 CD44的單抗可以消除 AML干細胞[20]。

5.3.2 干擾白血病微環(huán)境：LSC需要與其微環(huán)境相互作用才可支持其干細胞特征,如果 LSC細胞不能夠到達微環(huán)境便不能繼續(xù)繁殖。最近研究發(fā)現(xiàn)黏附分子CD44可以介導 LSC在骨髓和脾中歸巢,利用一個可以直接黏附在 CD44上的單克隆抗體 H90,可顯著減少人類 AML細胞移植到 SCID小鼠身上的能力。

5.3.3 誘導 LSC的特異免疫：異基因供體細胞介導的繼發(fā)移植物抗白血病效應,在有些患者可能以 LSC為靶向。Bonnet等[24]報道了用細胞毒性 T淋巴細胞(CTL)克隆特異性針對次要組織相容性抗原,抑制人AML細胞在 NOD-SCID小鼠體內(nèi)的植入,并證實了該抑制作用由 CTL直接針對 LSC介導。該研究表明適當?shù)囊浦参镎{(diào)控及正確鑒定和選擇 T淋巴細胞克隆,能有效引發(fā)抗 LSC免疫反應,防治異基因干細胞移植后的白血病再復發(fā)。

5.3.4 促進分化：通過誘導 LSC分化為成熟細胞,從而失去自我更新能力。目前腫瘤分化誘導治療在維甲酸治療急性早幼粒細胞白血病中取得顯著療效。臨床上診斷為急性早幼粒細胞白血病的病人,使用全反式維甲酸誘導 LSC分化,同時結(jié)合化療藥治療后,約有90%的病人獲得完全緩解,70%的病人治愈。

5.3.5 誘導凋亡：針對腫瘤特異的癌蛋白進行靶向治療可以誘導腫瘤細胞分化成熟,然后象正常細胞一樣凋亡。全反式維甲酸(RA)治療 AML和伊馬替尼(Imatinib)治療費城染色體(Bcr-Abl)陽性的慢性骨髓性白血病(CML)是誘導分化治療腫瘤中兩個成功的例子。Fujisaki等[25]發(fā)現(xiàn) bestain,一種氨基肽酶抑制劑,能選擇性殺傷 ph+的 CML干細胞并且能刺激正常造血?？赡艿臋C制是 CML的 CD34+細胞上 fas受體表達增加,抗 fas受體的 IgM能誘導其凋亡,而bestain就是協(xié)同抗 fas受體的 IgM、TNFα、IFNγ等物質(zhì)誘導慢粒干細胞凋亡的。

5.3.6 針對 LSC的特殊分子調(diào)控機制的靶向治療：FLT3的抑制劑、核因子 NF-κB的蛋白酶抑制劑(MG-132)、PI3K抑制劑等都可以通過其分子調(diào)控途徑作用于 LSC,而對正常的 HSC影響甚少。

5.3.7 多靶點聯(lián)合治療：通過 NF-κB及 PI3K介導的信號傳導通路調(diào)控 LSC生存,以 p53介導的凋亡信號通路調(diào)控 LSC死亡,將阻斷生存信號與激活死亡信號聯(lián)用,能更好的靶向 LSC。

5.3.8 抑制運載體的作用：ABC運載體的高表達使得常規(guī)細胞毒藥物不能對 LSC發(fā)揮應有的作用,從而增加了對 LSC靶向殺傷的難度。通過有效抑制運載體也許可以使藥物進入到細胞內(nèi)對 LSC產(chǎn)生殺傷作用。

5.3.9 削弱增殖能力：Phatak等人使用小分子藥物RHPS4選擇性抑制白血病干細胞的端粒酶催化亞基(hTERC)的活性,結(jié)果造成白血病干細胞增殖能力明顯下降。

5.3.10 未明的機制：Guzman等 研究發(fā)現(xiàn),TDZD-8(4-benzyl,2-methyl,1,2,4-thiadiazo-lidine,3,5-dione)可能通過抑制 PKC和 FLT3信號轉(zhuǎn)導途徑釋放游離的巰基化合物,快速破壞白血病干細胞的完整性,在 2h內(nèi)殺死白血病干細胞,而正常的干細胞則不受影響。但其靶向殺傷的機制還有待研究。[26]

隨著 LSC研究的不斷深入,使我們從一個全新的角度認識了白血病的發(fā)生發(fā)展,為白血病發(fā)病的分子機制研究、疾病監(jiān)控、治療策略以及預后判斷提供理論依據(jù)。下一步的研究目標是進一步了解 LSC的特性,尤其是 LSC的起源,尋找 LSC與HSC之間的根本差異性,為特異性地消除 LSC,并最大程度地減少對正常HSC的影響提供理論基礎(chǔ)。為徹底治愈白血病找到最有效的途徑。

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