Y染色體AZFc區(qū)缺失與原發(fā)性男性不育相關(guān)性研究

(昆山市錦溪人民醫(yī)院男性科，江蘇 昆山215300）

姚衛(wèi)國(guó)(興化市第五人民醫(yī)院男性科，江蘇 興化225766）

不孕不育一直是生殖健康領(lǐng)域亟待解決的重大科學(xué)問(wèn)題。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，世界上有8%～15%的育齡夫婦患有不育癥，其中由男方原因引起的不育占一半左右。造成男性不育的原因很多，主要包括生精障礙、輸精管道梗阻、附屬性腺器官異常、性功能異常、全身性疾病引起的不育等。其中又以精子發(fā)生障礙最為常見(jiàn)。而在精子發(fā)生障礙的患者中有大約30%的患者是由于遺傳學(xué)的異常引起的 。自Tiepolo等發(fā)現(xiàn) “無(wú)精子癥因子(azoospermia Factor）”以來(lái)，Y染色體微缺失被認(rèn)為是原發(fā)性男性不育的重要原因，并成為男性不育研究的熱點(diǎn)[1]。

“無(wú)精子癥因子”分布于Y染色體長(zhǎng)臂的三個(gè)不同區(qū)域，被稱(chēng)為AZFa、AZFb和AZFc[2]。與其他染色體不同，Y染色體上約95%的區(qū)域不會(huì)與X染色體發(fā)生重組，所以被稱(chēng)為非重組區(qū)(non-recombining region，NRY），也稱(chēng)為男性特異區(qū)(MSY），其上某些序列經(jīng)過(guò)了自我復(fù)制，相互之間高度同源，即存在回文序列(palindrome）結(jié)構(gòu)，Y染色體的這種特殊的結(jié)構(gòu)容易發(fā)生非等位同源重組，進(jìn)而產(chǎn)生各種大片段的缺失，AZFc區(qū)域尤其容易發(fā)生缺失，因?yàn)樵搮^(qū)域完全由回文序列結(jié)構(gòu)構(gòu)成，從而容易誘發(fā)該區(qū)內(nèi)的各種缺失再發(fā)[3-4]。例如，典型AZFc缺失亞型b2／b4缺失發(fā)生在擴(kuò)增子b2和擴(kuò)增子b4之間。b2／b4缺失使整個(gè)AZFc區(qū)域(包含8個(gè)基因，其中3個(gè)編碼睪丸特異性蛋白）缺失，是我們所知的與精子生成障礙緊密相關(guān)的確定的病因[5]（圖1）。在AZFc區(qū)的結(jié)構(gòu)被鑒定之后，AZFc區(qū)部分缺失以及導(dǎo)致這些缺失的潛在的分子機(jī)制的探究引起了更多的關(guān)注[6]。

圖1 AZFc區(qū)重復(fù)序列結(jié)構(gòu)及STS位點(diǎn)布局

gr／gr部分缺失和b2／b3部分缺失是AZFc區(qū)部分缺失的兩種主要缺失形式。gr／gr部分缺失是由于順向重復(fù)序列(g1-r1-r2和g2-r3-r4）間發(fā)生同源重組，造成AZFc區(qū)中約1．6Mb長(zhǎng)的片斷及其上基因拷貝被去除。b2／b3部分缺失是在gr／rg倒位或b2／b3倒位的基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展而來(lái)，造成AZFc區(qū)中約1．8Mb長(zhǎng)的片斷及其上基因拷貝被去除。但是學(xué)術(shù)界對(duì)它們?cè)诰由蛇^(guò)程中的影響作用存在爭(zhēng)論。

本課題以昆山市錦溪人民醫(yī)院與興化市第五人民醫(yī)院為樣本采集點(diǎn)，開(kāi)展了以醫(yī)院人群為基礎(chǔ)的分子流行病學(xué)病例—對(duì)照研究，我們采用了多種特殊的序列示蹤位點(diǎn)(STS）標(biāo)志物相結(jié)合的辦法[6-8]，檢測(cè)原發(fā)性不育和正常人群樣本缺失情況。從分子水平探討Y染色體AZFc區(qū)部分缺失同男性原發(fā)性不育之間的關(guān)系，為高危人群的篩檢和更好的開(kāi)展輔助生育工作提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1．1 對(duì)象

本研究病例來(lái)自昆山市錦溪人民醫(yī)院、興化市第五人民醫(yī)院的男性不育門(mén)診病例；對(duì)照來(lái)自昆山市錦溪人民醫(yī)院自愿參加生殖內(nèi)分泌激素水平和血清代謝物水平檢測(cè)的，有正常生育史的男性醫(yī)院內(nèi)對(duì)照。病例和對(duì)照均來(lái)自中國(guó)東部的漢族人群，并且年齡匹配。

研究對(duì)象的選擇和排除標(biāo)準(zhǔn)：所有原發(fā)不育病例均無(wú)生育史，并且通過(guò)體格檢查，精液常規(guī)檢查，血清FSH，LH和T檢測(cè)和核型分析。通過(guò)這些檢測(cè)確診原發(fā)不育病例393例，年齡25～38歲，并且根據(jù)WHO男性不育診斷手冊(cè)[8]，將其分為3組，即：無(wú)精病人191例、少精病人 [精液密度：（0．1～20）×106／ml]121例、不育／精子生成正?；颊?精液密度：＞20×106／ml）81例。所有對(duì)照均有近期生育史(1年內(nèi)），并且進(jìn)行了體格檢查。最終入選對(duì)照214例。研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，且完成流行病學(xué)調(diào)查和提供血液標(biāo)本。

1．2 方法

1．2．1 基因組DNA提取 采集靜脈血5ml，采用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，用紫外分光光度法(A260／280比值）確定DNA純度，OD260測(cè)定DNA濃度。

1．2．2 Y染色體AZFc區(qū)缺失類(lèi)型檢測(cè) 序列標(biāo)簽位點(diǎn)(Sequence Tagged Site，STS）是一類(lèi)在基因組上用以區(qū)分不同片段的特征序列，長(zhǎng)度從幾十個(gè)堿基到幾百個(gè)堿基不等。當(dāng)染色體上的某個(gè)區(qū)域有缺失發(fā)生時(shí)，這段區(qū)域連同其上的STS位點(diǎn)會(huì)被一同去除。所以，對(duì)候選缺失區(qū)域上各種STS位點(diǎn)的檢測(cè)，可以確定缺失發(fā)生所涉及的具體DNA片段。STS位點(diǎn)可以直接通過(guò)PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)，具有高效和快速的優(yōu)點(diǎn)，適合大樣本人群的檢測(cè)。因此我們選用該方法檢測(cè)AZFc區(qū)部分缺失。AZFc區(qū)部分缺失檢測(cè)包括三個(gè)PCR體系：體系一：sY1206、sY1161、sY639；體系二：sY1291、sY254、sY160；體系三：sY1201，sY1191，sY1125。其中sY1191和sY1291具有最高的信息量，sY1191缺如代表b2／b3缺失，sY1291缺如代表gr／gr缺失，若sY1191和sY1291同時(shí)缺如代表AZFc全缺失。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，對(duì)于理論頻數(shù)小于5的采用Fisher’精確概率法。采用Wloof檢驗(yàn)計(jì)算相對(duì)危險(xiǎn)度及95%可信區(qū)間。對(duì)各種缺失類(lèi)型與原發(fā)性男性不育相關(guān)性進(jìn)行單因素統(tǒng)計(jì)分析。全部統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)分析軟件為Stata 9．0。

2 結(jié) 果

2．1 AZFc全缺失在不同生精狀態(tài)組間的分布

在本研究中共檢測(cè)AZFc全缺失28例，且全部來(lái)自病例組(其中21例來(lái)自無(wú)精組，7例來(lái)自少精組），而在正常對(duì)照組中沒(méi)有檢測(cè)到。

2．2 AZFc區(qū)部分缺失在不同生精狀態(tài)組間的分布

通過(guò)對(duì)研究對(duì)象AZFc區(qū)部分缺失(gr／gr和b2／b3）的檢測(cè)，分析gr／gr部分缺失和b2／b3部分缺失在不同精子生成狀態(tài)組間的頻率分布情況(見(jiàn)表1）。在214例正常對(duì)照中，共檢測(cè)到18例gr／gr部分缺失、9例b2／b3部分缺失，而在393例原發(fā)性男性不育病例中，共檢測(cè)到41例gr／gr部分缺失、36例b2／b3部分缺失樣本。b2／b3部分缺失在原發(fā)性男性不育組和正常對(duì)照組間的頻率分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(OR=2．49，95%CI：1．18～5．28，P=0．014），而gr／gr部分缺失在這兩個(gè)組之間的分布沒(méi)有差異。上述結(jié)果提示b2／b3部分缺失會(huì)增加原發(fā)性男性不育的風(fēng)險(xiǎn)性。

造成男性不育的因素很多，那么b2／b3部分缺失是通過(guò)什么途徑引起男性不育的呢？為了探討這個(gè)問(wèn)題，隨后我們將原發(fā)性男性不育細(xì)分為無(wú)精組、少精組、不育／精子生成異常組(包括無(wú)精和少精）以及不育／精子生成正常組。在191例無(wú)精病人中，總計(jì)檢測(cè)到gr／gr部分缺失21例、b2／b3部分缺失17例；在121例少精病人中，檢測(cè)到gr／gr部分缺失13例，b2／b3部分缺失11例；在81例不育／精子生成正常組中，檢測(cè)到gr／gr部分缺失7例，b2／b3部分缺失8例。通過(guò)對(duì)AZFc區(qū)部分缺失在不同生精表型組間分布頻率的分析，我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，b2／b3部分缺失在無(wú)精組(OR=2．53，95%CI：1．10～5．83，P=0．025）、少精組(OR=2．43，95%CI：0．98～6．06，P=0．05）及不育／精子生成異常組(OR=2．49，95%CI：1．15～5．40，P=0．017）的頻率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1）。

上述結(jié)果表明，b2／b3部分缺失會(huì)增加原發(fā)性男性不育發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性，而且這種風(fēng)險(xiǎn)性是通過(guò)精子生成障礙引起的。

表1 gr／gr和b2／b3部分缺失在不同生精表型組間的分布

3 討 論

近年來(lái)，Y染色體微缺失及AZFc區(qū)部分缺失成為男性不育研究的熱點(diǎn)。在世界范圍內(nèi)，不同研究人群因?yàn)榉N族等方面的原因Y染色體缺失的發(fā)生頻率各異，從5%到20%各不相等[9-13]。與典型AZF區(qū)缺失相比，AZFc區(qū)部分缺失表型存在多樣性。通過(guò)STS組合分析方法[9]，我們對(duì)該人群中兩種主要缺失類(lèi)型進(jìn)行了檢測(cè)分析：gr／gr部分缺失和b2／b3部分缺失。我們研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)漢族男性人群中g(shù)r／gr部分缺失和b2／b3部分缺失的頻率要顯著高于其他不同人群。

在中國(guó)漢族人群這393名男性不育患者中，gr／gr部分缺失的頻率(10．43%）要比美國(guó)研究人群所檢測(cè)出的結(jié)果(2．2%）高出很多，甚至要高于對(duì)歐美生精功能受損的患病人群所檢測(cè)出的結(jié)果（3．7%～5．1%）[14-17]。這也許是因?yàn)檠芯繉?duì)象不同的遺傳背景造成的，而最近一項(xiàng)有關(guān)東亞人群的研究（病例組和對(duì)照組gr／gr部分缺失的患病率分別是10．3%和10．1%）也證實(shí)了這一點(diǎn)[18]。本研究與歐洲的一些相關(guān)的研究結(jié)果不同[19]，病例組和對(duì)照組在gr／gr缺失頻率上沒(méi)有明顯的差異(分別為10．43%和8．41%），提示gr／gr部分缺失與中國(guó)漢族人群中原發(fā)性男性不育無(wú)顯著關(guān)聯(lián)[20]。考慮到我們所研究的人群是中國(guó)漢族男性人群，特定的遺傳背景也許再一次發(fā)揮了效力。

首次被Sjoerd Repping’s課題組所闡釋的b2／b3部分缺失曾一度被人們所忽視。他們對(duì)1563位男性進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有25例缺少sY1191位點(diǎn)，但卻具有該位點(diǎn)兩側(cè)的STSs。在經(jīng)過(guò)原位雜交熒光測(cè)定的確證之后，他們發(fā)現(xiàn)這種特殊缺失類(lèi)型發(fā)生在b2／b3擴(kuò)增子之間[16]。由于其發(fā)生頻率較低，b2／b3部分缺失對(duì)男性不育影響程度仍然是未知的[21]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，b2／b3部分缺失的發(fā)生率在原發(fā)性男性不育組(9．16%）與正常對(duì)照組(4．21%）之間，具有顯著差異(P=0．014）。那么b2／b3部分缺失是通過(guò)什么途徑影響男性不育的呢？隨后我們將病例樣本細(xì)分為無(wú)精組、少精組以及不育／精子生成正常組。結(jié)果顯示b2／b3部分缺失在無(wú)精組(P=0．025）、少精組(P=0．050）以及不育／精子生成異常組(P=0．017）的發(fā)生率顯著高于正常對(duì)照組，而在不育／精子生成正常組中的發(fā)生率與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異(P=0．062）。綜上可以得出：b2／b3部分缺失與精子生成障礙之間有著顯著關(guān)聯(lián)，即b2／b3部分缺失會(huì)增加精子生成障礙的風(fēng)險(xiǎn)性。

AZFc區(qū)是正常生精功能所必需的，b2／b3缺失使AZFc上1．8Mb的長(zhǎng)度丟失，其中包括12個(gè)睪丸特異表達(dá)的基因或轉(zhuǎn)錄子。與使AZFc區(qū)上1．6Mb長(zhǎng)度丟失的gr／gr部分缺失相比，b2／b3部分缺失多出三個(gè)基因拷貝缺失，包含1個(gè)BPY2拷貝、1個(gè)TTTY4拷貝和1個(gè)TTTY17拷貝?？紤]到這兩種部分缺失與男性不育關(guān)聯(lián)程度的不同，一種可能的原因就是存在與精子發(fā)生相關(guān)的特定的基因拷貝。其次，盡管是相同的基因，不同拷貝的缺失可能會(huì)有不同的結(jié)局，而這最有力的證據(jù)來(lái)自DAZ基因家族。已知DAZ基因家族有4個(gè)高度同源的拷貝，它們?cè)诠δ苌峡赡懿⒉煌耆嗤琜19]。Ferlin的研究發(fā)現(xiàn)DAZ1／2缺失和DAZ3／4缺失對(duì)生精功能損傷程度不同，為上述推斷提供了有力的佐證。

總的來(lái)說(shuō)，此種關(guān)聯(lián)性研究為后續(xù)的功能學(xué)研究起到了一定的鋪墊作用。我們需要更大規(guī)模人群樣本來(lái)驗(yàn)證這種關(guān)聯(lián)的存在，全面闡述AZFc區(qū)不同基因及其不同拷貝在精子發(fā)生中的作用，為男性不育的診斷和治療提供新的思路。考慮到AZFc區(qū)部分缺失可能遺傳給男性后代[21-23]，因此，在行IVF（in-vitro fertilization）或ICSI(intracytoplasmic sperm injection）治療之前有必要對(duì)男性 AZF微缺失以及部分缺失的情況進(jìn)行檢查，并告之不育夫婦可能發(fā)生的遺傳學(xué)后果，為其提供遺傳學(xué)咨詢(xún)，以降低不良遺傳后果的發(fā)生率。

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