VEGF和P53在翼狀胬肉中的表達(dá)

鄭琦 鄭 根主 許燕紅

翼狀胬肉是指球結(jié)膜及纖維血管組織呈翼狀侵入角膜淺層，由一種結(jié)膜組織的增殖變性引起的病變。翼狀胬肉是我國常見的眼表疾病，其患病率較高，達(dá)到2% ～5%，患病總?cè)藬?shù)達(dá)2 000 萬 ～ 5 000 萬［1，2］。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是目前研究發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的血管形成促進(jìn)因子，它可以增強(qiáng)微血管的通透性，刺激內(nèi)皮細(xì)胞分裂，增加組織因子和某些蛋白酶的產(chǎn)生，為成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷入提供條件基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的生長和新生毛細(xì)血管網(wǎng)的建立提供營養(yǎng)。紫外線致球結(jié)膜變性，結(jié)膜上皮細(xì)胞抑癌基因p53突變，細(xì)胞周期調(diào)控基因p21/p27kip1表達(dá)下降導(dǎo)致球結(jié)膜上皮細(xì)胞周期紊亂，結(jié)膜上皮細(xì)胞的端粒酶活性異常增高，凋亡調(diào)控基因Bc1/Bax比值上調(diào)導(dǎo)致變性結(jié)膜上皮細(xì)胞具有無限增殖活性;有研究認(rèn)為翼狀胬肉是結(jié)膜組織正常凋亡過程失敗的結(jié)果。本項(xiàng)目研究VEGF和P53在翼狀胬肉中表達(dá)，通過對VEGF和P53在翼狀胬肉中的表達(dá)的研究，為探索翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)為臨床藥物研究提供理論支持，從而對降低翼狀胬肉的發(fā)生率及復(fù)發(fā)率也將具有一定指導(dǎo)意義，為預(yù)防治療翼狀胬肉提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選 擇本院2009年1至11月門診初發(fā)的進(jìn)行期翼狀胬肉手術(shù)患者中選標(biāo)本30例作為病例組(術(shù)后經(jīng)病理檢查確診是翼狀胬肉的標(biāo)本)其中男15例，女15例;年齡33～68歲，平均年齡(48.0±5.0)歲;平均病程11個(gè)月。同期正常結(jié)膜(斜視手術(shù)患者結(jié)膜)30例作為對照組，其中男14例，女16例;年齡34～68歲，平均年齡(47.4±2.3)歲。所有病例均排除其他角膜、結(jié)膜疾患，排除青光眼、虹膜炎及其他眼底疾患，排除全身疾患。

1.2 試劑與儀器 免 疫組化試劑:多聚賴氨酸、一抗(VEGF、P53、河北博海生物工程開發(fā)有限公司分裝美國SANTA CRUZ公司產(chǎn)品)、SP、Dab(購于河北博海生物工程開發(fā)有限公司)儀器設(shè)備顯微鏡:日本奧林巴斯 BX51T-PHD-J11;CMOS:日本奧林巴斯;多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng):美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus;切片機(jī):德國萊卡RM2015;離心機(jī):北京離心機(jī)廠LDZ5-2型;電子天平:瑞士METTER AE100型;移液器:德國EPPENDORF;干燥箱:日本三洋MIR-153型;低溫冰箱:日本三洋MDF-382E型;恒溫水浴箱:江蘇太倉醫(yī)用儀器廠 DSHZ-300型;醫(yī)用微波爐:浙江臨安愛迪儀器廠YWY781B型。

1.3 方法 取試驗(yàn)組和對照組標(biāo)本固定，脫水，包埋組織塊;HE染色。再行取材固定和包埋、切片，脫蠟、入水，加第一抗體，加第二抗體，加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，復(fù)染，顯微鏡觀察，選擇病例組和對照組的陽性和陰性組織相，進(jìn)行×100和×400的顯微照相，選擇有意義的組織相，經(jīng)登錄、編號、采集、分析、讀取數(shù)據(jù)、最后存盤。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) VEGF結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):以血管內(nèi)皮和細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒為陽性染色，以細(xì)胞漿內(nèi)無或少量棕色或棕黃色顆粒為陰性染色。P53結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):光鏡下觀察，細(xì)胞核呈淺黃色或深棕色染色的細(xì)胞為P53陽性細(xì)胞;細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈淺黃色或深棕色的細(xì)胞為假染色以及無棕黃色染色的細(xì)胞均視為P53陰性細(xì)胞。表達(dá)的強(qiáng)弱均以IHS為準(zhǔn)，免疫組化評分(immunohi-stochemical scores，IHS)方法見參照文獻(xiàn)［3］，結(jié)合陽性細(xì)胞百分比及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱兩個(gè)方面評分:a為陽性細(xì)胞百分比(無陽性細(xì)胞=0，陽性細(xì)胞占1%～10%=1，11% ～50%=2，51% ～80%=3，81% ～100%=4)，b為陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱(陰性=0，弱陽性=1，中度陽性=2，強(qiáng)陽性=3)，a，b兩項(xiàng)乘積即為該例組織的IHS。陽性細(xì)胞數(shù)表示陽性細(xì)胞占總體細(xì)胞的比例。每張切片在高倍顯微鏡下(×400)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野陽性細(xì)胞率，取平均值作為該標(biāo)本的陽性細(xì)胞率。設(shè)置b的原因是可能同樣的陽性細(xì)胞數(shù)會(huì)出現(xiàn)顯色不同。HE染色結(jié)果:HE結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞核被蘇木精染成鮮明的藍(lán)色，細(xì)胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強(qiáng)的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，研究病例組與正常組間均采用染色強(qiáng)度及染色陽性率乘積的IHS評分，成組設(shè)計(jì)兩樣本比較的秩和檢驗(yàn)，兩樣本比較的秩和檢驗(yàn)和Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下比較 對照組即正常結(jié)膜分為上皮層和基質(zhì)層。上皮層由3～5層細(xì)胞組成，表層為扁平細(xì)胞，中層為多邊形細(xì)胞，基底層為立方形或柱形細(xì)胞?；|(zhì)層為疏松結(jié)締組織，其間有散在的毛細(xì)血管，少量成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。病例組胬肉伴有上皮細(xì)胞增生，并見上皮囊腫，上皮增生變厚，厚薄不均，上皮下見較豐富的毛細(xì)血管，伴瞼裂斑改變，符合翼狀胬肉病理改變。

2.2 免疫組化 (1)病例組與對照組的VEGF:VEGF蛋白主要定位在血管內(nèi)皮和細(xì)胞漿表達(dá)細(xì)胞漿呈現(xiàn)棕色，胞核無著色，陽性部位主要在上皮中的杯狀細(xì)胞。2組VEGF IHS數(shù)值比較:病例組IHS的平均秩次為44.60，對照組IHS的平均秩次為16.40，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。(2)病例組與對照組的P53:P53抗體主要在細(xì)胞核表達(dá)，呈現(xiàn)棕色。2組P53 IHS數(shù)值比較:病例組IHS的平均秩次為15.88，對照組IHS的平均秩次為45.12，Z 值為 －6.626，P 值為 0.001，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(3)病例組VEGF和P53的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)果顯示VEGF和P53均在翼狀胬肉中均為高表達(dá)。VEGF和P53在翼狀胬肉中的表達(dá)具有一定相關(guān)性(r= －6.626，P ＜0.01)。

3 討論

翼狀胬肉形成是多因素參與的復(fù)雜病理過程，主要成分是大量增生的成纖維細(xì)胞，并由其導(dǎo)致相應(yīng)的病變，而細(xì)胞因子在成纖維細(xì)胞增生方面起著重要的作用。有研究表明紫外線照射的增加會(huì)引起B(yǎng)owman’s膜的生物學(xué)發(fā)生改變，產(chǎn)生刺激翼狀胬肉生長的免疫因子，最具代表性的就是血管刺激生長因子(VEGF)，可以導(dǎo)致大量血管和成纖維細(xì)胞的增生和退變。

翼狀胬肉是眼科常見病，翼狀胬肉的復(fù)發(fā)率高，生長相對頑固。過去被認(rèn)為是一種結(jié)膜組織的變性疾病，研究表明翼狀胬肉是一組織增生性結(jié)膜疾病，其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，可能與細(xì)胞異常增殖和凋亡異常有關(guān)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)，VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的血管形成促進(jìn)因子，它具有增強(qiáng)微血管的通透性，刺激內(nèi)皮細(xì)胞分裂，增加組織因子和某些蛋白酶的產(chǎn)生等作用。VEGF不僅能特異性地刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、促進(jìn)血管形成、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的遷移，能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞合成和分泌基質(zhì)金屬蛋白酶、加速基質(zhì)降解及趨發(fā)炎性細(xì)胞，同時(shí)還具有促血管通透作用，使血管內(nèi)大分子物質(zhì)溢出，從而有利于血管外基質(zhì)的形成，為血管內(nèi)皮的遷移及血管形成提供物質(zhì)，最終促使新毛細(xì)血管生成并促進(jìn)功能成熟［4，5］。在紫外線氧化應(yīng)激引起的DNA損傷中，P53基因是最常見的被損傷的基因之一。P53基因參與細(xì)胞的DNA的修復(fù)與合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、凋亡，控制細(xì)胞的周期，是引起人類腫瘤最常見的突變基因。P53基因產(chǎn)物組織細(xì)胞進(jìn)入S期，參與抑制細(xì)胞增生，并促使DNA損傷的細(xì)胞進(jìn)入程序化死亡。突變型P53基因可翻譯成異常P53蛋白，并在細(xì)胞內(nèi)聚集胬肉組織上皮細(xì)胞胞質(zhì)中P53蛋白呈陽性表達(dá)，且胬肉周圍看似正常的結(jié)膜上皮亦表達(dá)陽性，上皮下組織則為陰性。胬肉上皮細(xì)胞異常表達(dá)P53蛋白，提示胬肉上皮細(xì)胞呈增生活躍狀態(tài)。戶外工作者的P53蛋白表達(dá)明顯增多，提示紫外線可引起P53蛋白的異常表達(dá)［6］。本研究應(yīng)用免疫組化學(xué)染色，翼狀胬肉患者標(biāo)本P53蛋白表達(dá)陽性，而正常結(jié)膜均為陰性。有研究認(rèn)為P53基因是十分重要的腫瘤抑制基因，其與細(xì)胞的生長、分化關(guān)系密切，50%的腫瘤組織P53蛋白表達(dá)增加［7］，一些癌前期病變及良性增生性組織也表達(dá)P53蛋白［8］。翼狀胬肉上皮細(xì)胞異常表達(dá)P53蛋白提示翼狀胬肉上皮細(xì)胞的生物學(xué)特征不同于正常結(jié)膜，其上皮細(xì)胞呈增生活躍狀態(tài)。以往對翼狀胬肉的研究表明，其上皮下成纖維細(xì)胞增生活躍，結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為翼狀胬肉應(yīng)為一種良性增生性疾病。

組織學(xué)上，翼狀胬肉是由萎縮的結(jié)膜上皮和增生肥大的血管化組織及彈性退變結(jié)締組織構(gòu)成。近年來的研究表明，翼狀胬肉更趨向是一種組織增生性疾病，并可能與細(xì)胞的增殖與凋亡有關(guān)。翼狀胬肉組織超微結(jié)構(gòu)研究表明，彈性纖維與膠原纖維的增生和變性是翼狀胬肉較為突出的病理改變，臨床表現(xiàn)為新生的組織不斷生長、增厚，并逐漸侵入角膜，手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)，此特點(diǎn)與腫瘤組織相似，而腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因是細(xì)胞異常增殖和凋亡失衡［9－11］。

我們研究與翼狀胬肉發(fā)生發(fā)展相關(guān)的細(xì)胞因子，為預(yù)防和控制翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)，為生物科技研制相關(guān)治療翼狀胬肉的試劑提供一定的幫助，同時(shí)為相關(guān)職業(yè)的職業(yè)病的防護(hù)提供臨床干預(yù)方法。通過對VEGF和P53在翼狀胬肉中的表達(dá)及相關(guān)性研究，為研究翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù);選擇性的VEGF和P53拮抗藥物可以有效減少翼狀胬肉的發(fā)生，為臨床藥物研究提供理論支持。

盡管研究顯示有很多相關(guān)環(huán)境因素造成翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展，但是翼狀胬肉的發(fā)病記住仍不十分清楚，研制臨床藥物需要多種因子的拮抗劑及多種因子的協(xié)同劑，還需要大量的臨床藥物試驗(yàn)，今后仍需要大樣本的、前瞻性的隊(duì)列研究，以便更為深入的揭示其發(fā)病機(jī)制。

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