銀杏葉提取物總黃酮含量分析方法的研究

鄭啟波

(哈爾濱仁皇藥業(yè)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150030)

銀杏葉為銀杏科植物，味苦、甘澀、性平，活血養(yǎng)心、斂肺澀腸。主治胸痹心痛，喘咳痰嗽，泄瀉痢疾。銀杏葉提取物(EGB)具有廣泛的藥理作用，其提取物(extract of Ginkgo Biloba，EGB)中主要活性成分為黃酮類和萜類內酯。它們在改善心腦血管循環(huán)、老年性外周循環(huán)障礙及老年癡呆癥方面具有很好的療效，有抑制血小板凝聚酶、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗癌等作用［1］。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥:UV－4600型紫外可見分光光度計(瑞典Pharmacia公司)，高效液相色譜儀，配備有600E型泵系統，966型二極管陣列檢測器，RCMC18(8.0 cm × 1.0 cm，粒度:5 μm);蘆丁、槲皮素(中國藥品生物制品檢定所)、山柰酚、異鼠李素(Sigma公司)、鹽酸、甲醇、乙醇、丙酮均為分析純。

1.2 提取工藝:取200 g干銀杏葉粉碎，浸泡在2000 mL 70%乙醇中，在水浴上熱回流提取2次，每次各3 h，過濾，2次濾液合并，在水浴上減壓蒸餾，除去溶劑，用石油醚脫脂2次水溶液濃縮至原體積的1/10，后用20%乙醇懸浮，過濾，濾液中加入少量的硼砂，在水浴上減壓蒸餾，回收乙醇，水液在水浴上濃縮成漿液狀，控制在60℃溫度下真空干燥，得提取物 29.35 g［2－3］。

1.3 實驗方法

1.3.1 分光光度法

1.3.1.1 標準液及標準曲線。①標準液的配制:精密稱取蘆丁對照品23 mg，置于100 mL容量瓶中，用30%乙醇溶解，定容，備用。②標準曲線的制作:分別精密吸取上述蘆丁的標準液0.5、1、2、3、4 mL 各置于 10 mL 容量瓶中，加 30%乙醇5 mL、5%NaNO2溶液 0.3 mL，搖勻，放置 5 min 后加入10%AL(NO3)3溶液 0.3 mL，6 min 后再加入 1 mol/L NaOH溶液2 mL，混勻，用30%乙醇定容，10 min后于波長510 nm處進行測定。吸收度(A)與其濃度(C，mg/mL)用最小二乘法求得回歸方程;A=0.9881C+0.01072，r=0.9998，線性范圍11.5～92μg/mL。

1.3.1.2 樣品的測定。精密稱取銀杏葉提取物約0.02 g 5份，各置10 mL量瓶中加30%乙醇溶液，按上述方法測定吸收度，用回歸方程計算總黃酮的百分含量［4］，結果為32.70%、32.04%、32.17%、32.40%、31.98%。

1.3.2 高效液相色譜法

1.3.2.1 色譜條件。色譜柱:RCMC18(8.0 cm ×1.0 cm，粒度:5μm);流動相:甲醇 －0.4%磷酸溶液(55:45);流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL;檢測波長:360 nm;柱溫:25 ℃。

1.3.2.2 溶液制備。對照品溶液的制備:精密稱取經五氧化二磷干燥過夜的槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品適量(15.6，17.0，10.0 mg)置 100 mL 量瓶中，加甲醇微熱使溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。

1.3.2.3 樣品測定。標準曲線的制作:精密量取上述對照品溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置 10 mL 量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，各進樣20μL，按上述色譜條件測定，以對照品濃度C(μg·mL－1)為橫坐標，峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線，結果如下。

槲皮素:A=80 074C －52 255，r=0.999 4，線性范圍為15.6 ～78.0 μg·mL－1

山柰素:A=63 168C+35 558，r=0.998 2，線性范圍為17.0 ～85.0 μg·mL－1

異鼠李素:A=60 465C+20 840，r=0.999 6，線性范圍為10.0 ～50.0 μg·mL－1

精密稱取銀杏葉提取物0.2 g 5份，按上述色譜條件測定，分別計算槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量［5－6］，按公式總黃酮醇含量=(槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量)× 2.51，結果為 30.96%、30.85%、31.02%、31.65%、31.82%。

回收率測定:精密稱取銀杏葉提取物0.1 g，共5份，分別精密加入槲皮素、山柰素、異鼠李素混合對照品溶液10 mL(濃度分別為 0.156，0.170，0.100 mg·mL－1)，按上述方法測回收率，得平均回收率為98.9%，RSD=1.12%(n=5)。

2 結果與討論

實驗中，采用紫外可見分光光度法和高效液相色譜法對銀杏葉提取物總黃酮進行含量測定。結果顯示，UV測得總黃酮平均含量33.87%;HPLC以槲皮素對照品法測得為31.26%。經比較認為，紫外可見分光光度法作為一種簡便、準確的質量控制方法，可應用于工廠的實際生產工作中。

實驗過程中發(fā)現銀杏葉提取物(主要總黃酮)含量有多羥基易氧化成分，隨著在提取過程中的溫度升高和加熱時間的延長，顏色明顯加深，若在加熱過程中加入少量的硼砂和亞硫酸氫鈉，可能是對酚羥基的保護作用，則結果有明顯的改善。

3 分析與應用

在開發(fā)銀杏制劑的時候，為了保持活性成分的穩(wěn)定，應該對提取物中氧化因素加以考慮，在工藝過程中采取必要的抗氧化措施。以蘆丁為對照品，取銀杏葉提取物約0.02 g置于10 mL量瓶中，同上操作，以試液作空白，分別加入NaNO2溶液(0.1 ～ 0.4 mL)，AL(NO3)3溶液(0.1 ～0.4 mL)和NaOH 溶液(0.5～4.0 mL)，測得的吸收度基本不變，說明黃酮類化合物與三價鋁離子形成的絡合物是穩(wěn)定的。在系統中分別加入蘆丁含量20倍的各種糖類如蔗糖、乳糖、葡萄糖，再測其吸光度，變化也很小，說明糖類不干擾總黃酮的測定。用試劑作空白消除了顯色前黃酮顏色的干擾。測試溫度均為25℃，以消除溫度對絡合物穩(wěn)性的影響。

4 結論

本文通過紫外可見分光光度法和高效液相色譜法對提取物中的銀杏葉總黃酮含量的測定，進行了相互的比較，從而確立了紫外可見分光光度法為銀杏葉總黃酮含量測定常用方法中較為快速、簡便、準確的方法。同時以高效液相色譜法作為測量手段，以總黃酮的回收率作為指標，對銀杏葉的提取工藝進行探討，確定了提取溶劑、時間及干燥溫度等提取工藝參數，為工業(yè)化生產提供了重要參考依據。

［1］劉桂霞，孫玉瑋，金兆祥.銀杏葉的研究進展［J］.國外醫(yī)藥.植物藥分冊，1994，9(1):10.

［2］沙懷，陳桂先，馬莉，等.銀杏葉中總黃酮的提取與測定［J］.中國藥房，1995，6(5):13 －14.

［3］莊向平，虞慶英，楊更生，等.銀杏葉中總黃酮的測定和提取方法［J］.中草藥，1992，23(3):122.

［4］李梅，楊正鴻，王堅毅.紫外分光光度法測定復方銀杏葉膠囊中銀杏葉總黃酮含量［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，1998，18(2):85.

［5］國家藥典委員會.中國藥典:Ⅰ部［S］.北京:化學工業(yè)出版社，2005:597.

［6］陶巧風，黃宗玉，范秀林.高效液相色譜法測定銀杏葉制劑中黃酮含量［J］.中成藥，1993，15(12):14.