啤酒廢酵母中β-D-葡聚糖非降解提取工藝

朱益波，翟麗君，朱 明，齊 斌,*

(1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.大富豪(常熟)啤酒有限公司，江蘇 常熟 215500)

啤酒廢酵母中β-D-葡聚糖非降解提取工藝

朱益波1，翟麗君1，朱 明2，齊 斌1,*

(1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.大富豪(常熟)啤酒有限公司，江蘇 常熟 215500)

采用單因素及正交試驗(yàn)研究新型非降解法提取廢啤酒酵母β-D-葡聚糖工藝。該工藝主要包括誘導(dǎo)自溶、熱水浸提、破壁、脫脂、蛋白酶處理等過程。結(jié)果表明，提取物中總糖質(zhì)量百分含量為84.9%，得率為13.7%。與已有報(bào)道相比具備較高的純度和得率。誘導(dǎo)自溶及熱水浸提處理對(duì)于提取物的得率和純度具有重要影響，蛋白酶處理對(duì)于進(jìn)一步減少蛋白質(zhì)含量和提高產(chǎn)物純度也有顯著作用。整個(gè)提取過程沒有采用強(qiáng)酸、堿和氧化劑有助于保護(hù)產(chǎn)物的生理活性和環(huán)境。

廢啤酒酵母；β-D-葡聚糖；非降解提取

近二十年來，國(guó)內(nèi)的啤酒工業(yè)發(fā)展迅速，已經(jīng)連續(xù)8年蟬聯(lián)世界產(chǎn)量第一。有數(shù)據(jù)表明2010年1～11月份全國(guó)啤酒總產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到近4240萬噸，其中江蘇省同期的產(chǎn)量達(dá)到250萬噸，在全國(guó)30個(gè)主要啤酒生產(chǎn)省市中位列第5位。按照每噸啤酒產(chǎn)生1.5kg廢酵母(干質(zhì)量)計(jì)算[1]，全國(guó)每年產(chǎn)生約6.36萬噸廢啤酒酵母。目前，對(duì)于廢啤酒酵母的綜合利用主要集中在酵母細(xì)胞的氨基酸、肽、蛋白資源，酵母抽提物調(diào)味品，β-葡聚糖、甘露糖以及活性酶類如超氧化物歧化酶等產(chǎn)品的生產(chǎn)與研究[2]。大量研究表明β-D-葡聚糖通過結(jié)合巨噬細(xì)胞特異性受體使其激活，加強(qiáng)了宿主的抵御能力進(jìn)而表現(xiàn)出抗腫瘤、抗菌，促進(jìn)傷口愈合以及免疫調(diào)節(jié)活性[3-5]。酵母細(xì)胞壁中主要成分包括甘露糖肽和β-D-葡聚糖，分別占細(xì)胞壁干物質(zhì)量的40%和60%。因此，大量的廢啤酒酵母成為制備β-D-葡聚糖的首選。但是β-D-葡聚糖的分離技術(shù)主要是基于早先開發(fā)的酸-堿提取法以及次氯酸鈉細(xì)胞直接氧化法。這些方法會(huì)使大量葡聚糖降解，降低葡聚糖的得率并且顯著影響生物學(xué)功能[5-6]。因此基于溫和提取及酶處理的非降解工藝研究正逐步展開[7-8]。本研究旨在廢啤酒酵母自溶的基礎(chǔ)上研究新型β-D-葡聚糖非降解工藝，為廢啤酒酵母的進(jìn)一步綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廢啤酒酵母 大富豪啤酒(常熟)有限公司；中性蛋白酶 南寧龐博生物工程有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外-可見光分光光度計(jì) 日本島津公司；IKA-T18高速分散機(jī) 德國(guó)IKA公司；Alpha1-2真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

廢酵母→洗滌→誘導(dǎo)自溶→熱水浸提→破壁→脫脂→蛋白酶處理→冷凍干燥→葡聚糖

1.3.2 分析方法

粗蛋白含量測(cè)定：采用凱氏定氮法；可溶性蛋白含量測(cè)定：采用福林酚法；總脂肪含量測(cè)定：采用索式抽提法；總糖的測(cè)定：采用苯酚-硫酸法，以總糖的百分含量表示提取物中β-D-葡聚糖的相對(duì)純度；游離α-氨基氮含量測(cè)定：采用甲醛滴定法；細(xì)胞破壁率及自溶率測(cè)定：采用文獻(xiàn)[8]方法。

1.3.3 洗滌

廢啤酒酵母經(jīng)5% Na2CO3洗滌3遍，再用蒸餾水洗1遍，然后4000r/min離心5min，取沉淀。

1.3.4 誘導(dǎo)自溶單因素試驗(yàn)及正交優(yōu)化

分別以pH值、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、菌體質(zhì)量濃度以及誘導(dǎo)溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定各因素水平，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)。自溶結(jié)束后80℃保持15min滅酶，離心洗滌自溶細(xì)胞并保存于4℃，并分別取樣測(cè)定自溶液中游離α-氨基氮含量，計(jì)算游離α-氨基氮得率。

1.3.5 熱水浸提

將自溶酵母細(xì)胞懸浮于50mmol/L pH7.5磷酸緩沖液中至終質(zhì)量濃度100g/L，121℃處理6h，待降至室溫后離心洗滌，沉淀保存于4℃。

1.3.6 細(xì)胞破壁單因素試驗(yàn)及正交優(yōu)化

熱水浸提處理后的細(xì)胞懸浮于磷酸緩沖液，分別以轉(zhuǎn)速、時(shí)間和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為單因素，進(jìn)行高速分散機(jī)破壁處理，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇各因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。

1.3.7 脫脂

取破壁后酵母細(xì)胞按1:4(g/mL)與丙酮配成懸液，水浴回流2h，離心收集上清，沉淀再用丙酮按1:1(g/mL)的比例洗滌3次，離心收集沉淀得到脫脂細(xì)胞壁。

1.3.8 蛋白酶處理

脫脂細(xì)胞壁懸浮于磷酸緩沖液至終濃度質(zhì)量150g/L，在酵母(濕質(zhì)量)中以每克酵母添加10000U的比例加入中性蛋白酶，并于55℃酶解5h，然后加熱至80℃保溫15min，離心洗滌直至上清液不含可溶性蛋白，沉淀即為含酵母細(xì)胞壁提取物。

1.3.9 真空冷凍干燥

將1.3.8節(jié)所得提取物置于冷阱中預(yù)凍6h，抽真空過夜冷凍干燥，4℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)自溶單因素試驗(yàn)及正交優(yōu)化分析

圖1 誘導(dǎo)自溶單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Effects of temperature, pH, [NaCl] and cell density on induced yeast autolysis

圖1表明溫度、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及pH值對(duì)于誘導(dǎo)自溶影響較大，55℃誘導(dǎo)自溶游離氨基酸得率約是40℃條件下的3倍，3% NaCl的添加明顯提高了氨基氮得率，而pH5.5自溶效果則是pH8.0的1.7倍。選擇誘導(dǎo)溫度50、55、60℃；NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、3%；pH4.0、5.0、6.0；菌體質(zhì)量濃度50、100、150g/L進(jìn)行正交優(yōu)化。正交優(yōu)化結(jié)果(表1)表明誘導(dǎo)pH值、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及溫度對(duì)于自溶程度具有較大的影響。雖然NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%和3%對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，但考慮到誘導(dǎo)自溶時(shí)間較長(zhǎng)，3% N aCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)更利于抑制雜菌的生長(zhǎng)，所以選擇3% NaCl自溶更為合適。菌體質(zhì)量濃度對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很小，故選擇150g/L菌懸液為優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。綜上所述誘導(dǎo)自溶優(yōu)化后最適條件分別為pH5.0、3% N aCl、溫度55℃、菌體質(zhì)量濃度150g/L。

表1 誘導(dǎo)自溶正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal array design and corresponding experimental results for optimization of induced yeast autolysis

2.2 廢酵母自溶過程中游離α-氨基氮及可溶性蛋白含量變化

酵母誘導(dǎo)自溶過程實(shí)質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)多種水解酶作用于胞內(nèi)物質(zhì)，最終將其降解成小分子質(zhì)量產(chǎn)物。該過程主要涉及到如磷酸酯酶、核糖核酸酶以及蛋白酶等水解酶類，這些酶原在特定條件下被激活，進(jìn)而作用于相應(yīng)底物，胞內(nèi)的生物大分子被降解后積累于胞內(nèi)，當(dāng)被水解為能通過細(xì)胞壁的小分子時(shí)，水解產(chǎn)物則釋放到胞外。水解酶同時(shí)也發(fā)生自身消化，水解活性隨之降低，自溶作用逐漸停止[9]。本研究在優(yōu)化了誘導(dǎo)自溶條件后，考查了廢酵母細(xì)胞誘導(dǎo)自溶過程中游離α-氨基氮及可溶性蛋白的動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律(圖2)。

游離α-氨基氮及可溶性蛋白在誘導(dǎo)自溶過程中表現(xiàn)出一致的動(dòng)力學(xué)過程：在誘導(dǎo)自溶的前20h，游離α-氨基氮及可溶性蛋白的濃度持續(xù)上升，其中前12h的增長(zhǎng)速度最高，12～20h逐漸減慢，20h以后濃度基本保持穩(wěn)定狀態(tài)。結(jié)果表明胞內(nèi)蛋白在多種蛋白酶的作用下迅速被降解成肽及氨基酸等小分子物質(zhì)，并很快釋放至胞外；可溶性蛋白及游離α-氨基氮表現(xiàn)出一致的動(dòng)力學(xué)曲線表明游離氨基酸和可溶性蛋白同時(shí)釋放到胞外，這一現(xiàn)象可能暗示除了蛋白質(zhì)發(fā)生了迅速的降解外，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜也發(fā)生了較大的變化，以利于自溶物的迅速釋放；24h誘導(dǎo)自溶后，可溶性蛋白含量達(dá)到穩(wěn)定值，表明在該優(yōu)化條件下經(jīng)24h自溶已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，此時(shí)酵母細(xì)胞的自溶率為46%，故24h可以作為自溶作用的最適時(shí)間。

圖2 廢酵母自溶過程曲線Fig.2 Time courses of induced spent yeast autolysis in term ofαamino nitrogen and soluble protein contents in supernatant

2.3 細(xì)胞破壁

圖3 時(shí)間(a)、轉(zhuǎn)速(b)和菌體質(zhì)量濃度(c)對(duì)細(xì)胞破壁率的影響Fig.3 Effects of duration, speed and cell density on percentage of disrupted cells

細(xì)胞破壁單因素試驗(yàn)結(jié)果(圖3)表明破壁時(shí)間、轉(zhuǎn)速以及菌體質(zhì)量濃度對(duì)于破壁效果都有明顯影響。綜合圖中結(jié)果選擇破壁時(shí)間1、2、3min；轉(zhuǎn)速12000、15000、18000r/min；菌體質(zhì)量濃度50、100、150g/L進(jìn)行正交優(yōu)化。研究已經(jīng)表明熱水處理后的酵母細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度要遠(yuǎn)低于新鮮酵母細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度[8]。這可能是由于酵母細(xì)胞經(jīng)熱水處理后，細(xì)胞壁中大量的甘露糖蛋白被去除，從而降低了細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度，提高了細(xì)胞壁的滲透性。該研究考查了在熱水處理后高速分散機(jī)破壁的效果(表2)，結(jié)果表明采用高速分散機(jī)破壁，轉(zhuǎn)速和處理時(shí)間對(duì)破壁率有主要影響。各因素對(duì)破壁率影響的大小為轉(zhuǎn)速＞時(shí)間＞菌體質(zhì)量濃度。最佳條件為轉(zhuǎn)速15000r/min、100g/L菌體質(zhì)量濃度處理3min，破壁率達(dá)到95.5%。

表2 破壁正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results for optimization of cell wall disruption

2.4 提取物成分分析

圖4 提取物成分變化分析Fig.4 Physic-chemical analysis of extract

廢啤酒酵母細(xì)胞經(jīng)上述各項(xiàng)處理后，提取物的成分見圖4所示。經(jīng)自溶處理后，提取物中粗蛋白質(zhì)量百分含量與酵母細(xì)胞相比下降約60%，熱水處理后粗蛋白含量又進(jìn)一步下降約50%，最終經(jīng)蛋白酶處理后粗蛋白質(zhì)量百分含量是2.2%，僅有酵母細(xì)胞粗蛋白含量的5%。經(jīng)各項(xiàng)處理后，總糖質(zhì)量百分含量基本呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)：自溶后與原細(xì)胞相比，上升了約70%；熱水處理后進(jìn)一步上升約30%，進(jìn)一步經(jīng)脫脂和蛋白酶處理后最終總糖質(zhì)量百分含量達(dá)到84.9%，相比酵母細(xì)胞的33.4%提高了154%；脂肪含量的變化表明在脫脂處理之前，總脂肪含量約為3%～5%之間，脫脂后脂肪含量下降到0.68%；各提取過程的固體質(zhì)量(干質(zhì)量)表明：自溶過程對(duì)于細(xì)胞物質(zhì)量的減少最為顯著，經(jīng)自溶后質(zhì)量減少了42.5%，這與約46%的自溶率較為一致，熱水處理后物質(zhì)量減少了39.5%，進(jìn)一步經(jīng)過脫脂處理和蛋白酶處理后，相對(duì)于酵母細(xì)胞，產(chǎn)品最終得率約為13.7%。

上述結(jié)果可以看出，粗蛋白隨著提取過程而逐漸下降，總糖含量逐漸上升。其中酵母自溶和熱水處理對(duì)粗蛋白的去除和總糖含量的提升最為明顯。因此酵母自溶和熱水處理對(duì)于該提取工藝具有重要影響。通過誘導(dǎo)自溶作用不僅可以釋放大量的胞內(nèi)物質(zhì)，也可能促進(jìn)了細(xì)胞膜和細(xì)胞壁成分向有助于提取β-D-葡聚糖的轉(zhuǎn)變。熱水處理后，大量甘露糖蛋白得以去除。有資料表明通過自溶和熱水處理可以去除約83%的甘露糖蛋白，而其中89%是通過熱水過程處理去除，這使得粗蛋白含量進(jìn)一步明顯下降，總糖百分含量進(jìn)一步上升[8]。蛋白酶處理結(jié)果表明，蛋白酶能夠進(jìn)一步減少提取物中蛋白質(zhì)含量，這可能是蛋白酶降解了細(xì)胞壁中殘存的甘露糖蛋白，從而導(dǎo)致粗蛋白含量的降低。

2.5 不同提取方法結(jié)果比較

表3 不同提取方法結(jié)果比較Table 3 Comparison among different extraction methods on total sugar content and yield of extracts

本方法參考自溶-熱水-酶解法提取廢啤酒酵母細(xì)胞葡聚糖，工藝過程中沒有采用酸、堿、氧化等較為強(qiáng)烈的處理方法，從而可有效避免葡聚糖的降解以及其結(jié)構(gòu)的改變。由表3可知，與其他方法相比，本方法得率相對(duì)較高，總糖的含量也高于酶堿法和自溶酶堿法。

3 結(jié) 論

本研究在已有報(bào)道的基礎(chǔ)上提出了非降解法提取廢啤酒酵母細(xì)胞中β-D-葡聚糖的方法。結(jié)果表明廢啤酒酵母經(jīng)過洗滌、誘導(dǎo)自溶、熱水浸提、破壁、脫脂、蛋白酶處理后總糖含量可以達(dá)到84.9%，最終得率為13.7%。該方法摒棄了傳統(tǒng)的酸、堿及氧化劑的使用，不僅獲得了較高的產(chǎn)品得率和總糖含量，而且有助于保持產(chǎn)品的原有結(jié)構(gòu)、生理活性以及環(huán)境保護(hù)。為更好地綜合利用大量廢啤酒酵母提出了一個(gè)新的方法和參考。但是該方法與其他方法相比處理過程較為復(fù)雜，欲在實(shí)際中應(yīng)用還需要將提取過程進(jìn)一步整合和優(yōu)化，比如縮短誘導(dǎo)自溶時(shí)間，采用新的方法和設(shè)備將細(xì)胞熱水浸提甘露糖與破壁同時(shí)處理，以減少處理程序和成本，進(jìn)一步提高產(chǎn)品純度和得率。

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A Novel Method for Non-degradative Extraction of β-D-Glucans from Spent Yeast Cells

ZHU Yi-bo1，ZHAI Li-jun1，ZHU Ming2，QI Bin1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering , Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China；2. Dafuhao Brewery (Changshu) Co. Ltd., Changshu 215500, China)

We here present a novel method to extract non-degraded β-D-glucans from spent yeast cells, mainly based on induced yeast autolysis, hot water extraction, cell wall disruption, defatting and protease hydrolysis. One-factor-at-a-time coupled with orthogonal array design method was applied to the process conditions of induced yeast autolysis and cell wall disruption. The extract obtained under optimized conditions had a total sugar content of 84.9% with an extraction yield of 13.7%. Its purity and yield were both higher than previously reported. Induced yeast autolysis and hot water extraction had a significant effect on β-D-glucan purity and yield. Moreover, protease treatment could further remove protein impurities and increase β-D-glucan purity. The absence of strong acid, strong alkali and oxidant throughout the process helped to protect the physiological activity of products and the environment.

spent yeast cell；β-D-glucans；non-degradative extraction

TS261.9

：A

1002-6630(2011)20-0121-05

2011-07-05

江蘇省高校自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(08KJD180006)

朱益波(1980—)，男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)榛蚬こ膛c發(fā)酵工程。E-mail：centuryrain@126.com

*通信作者：齊斌(1965—)，男，教授，博士后，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：qibin65@126.com