腫瘤組織進(jìn)行法醫(yī)DNA分析的研究進(jìn)展

徐冬冬 黃花張明陽

(川北醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系四川南充637000;①四川省南充精神衛(wèi)生中心;②南通大學(xué)法醫(yī)系)

腫瘤組織進(jìn)行法醫(yī)DNA分析的研究進(jìn)展

徐冬冬 黃花①張明陽②

(川北醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系四川南充637000;①四川省南充精神衛(wèi)生中心;②南通大學(xué)法醫(yī)系)

腫瘤法醫(yī)學(xué)DNA分析遺傳不穩(wěn)定性短串聯(lián)重復(fù)序列

腫瘤研究與法醫(yī)DNA分型之間的關(guān)系可能并不明確，因?yàn)楹Y選法醫(yī)分析用短患聯(lián)重復(fù)序列(STR)一條重要的標(biāo)準(zhǔn)就是不能與已知疾病遺傳標(biāo)記之間有關(guān)聯(lián)。然而，在一些特殊情況下腫瘤組織也可能用于法醫(yī)DNA分型，例如對(duì)失蹤人員或者災(zāi)難遇害者的個(gè)人識(shí)別，生前采集的活體組織可能是留下的唯一可用于DNA分析的樣本。更為常見的情況是貼錯(cuò)標(biāo)簽或者弄混樣本，通過DNA分型技術(shù)可將活檢樣本與患者之間匹配。類似的情況還有對(duì)被控父親已經(jīng)死亡的親權(quán)鑒定，如果被控父親已經(jīng)下葬或者火化，可以調(diào)取現(xiàn)存組織樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。目前已知多種腫瘤存在遺傳不穩(wěn)定性，表現(xiàn)為癌細(xì)胞上的雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)或者微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)。這種不穩(wěn)定性也出現(xiàn)于腫瘤組織的DNA重復(fù)序列，可能會(huì)影響到結(jié)構(gòu)與之類似的法醫(yī)DNA分型用STR遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，從而影響DNA分型結(jié)果。

1 腫瘤遺傳學(xué)

典型的腫瘤發(fā)生要依靠多個(gè)突變，這些突變存在個(gè)體差異且為單細(xì)胞的多個(gè)突變。腫瘤從發(fā)生到發(fā)展整個(gè)演變過程既與遺傳突變和環(huán)境因素有關(guān)，也與基因變異和調(diào)控基因產(chǎn)物缺失有關(guān)。這個(gè)過程與癌基因的激活、抑癌基因的失活和調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因改變有關(guān)?；蚩梢远喾N方式發(fā)生突變，包括缺失突變、點(diǎn)突變和染色體重排等方式均可導(dǎo)致癌基因的激活。抑癌基因可在表觀遺傳學(xué)改變等一些已知方式下失活，如啟動(dòng)子的甲基化。調(diào)控細(xì)胞生長和分化的原癌基因過度激活，突變后轉(zhuǎn)化為癌基因。例如編碼跨膜受體的c－erbB2(又叫Her2/ neu)原癌基因在多種人類腫瘤中出現(xiàn)過度表達(dá)，如乳腺癌、卵巢癌和胃癌等［1］。通過免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，c－erbB2原癌基因在卵巢癌有＜25%過度表達(dá)，乳腺癌20%～30%，子宮內(nèi)膜癌＜10%［2］。這種跨膜蛋白的過度表達(dá)與疾病的預(yù)示有潛在聯(lián)系。其它癌基因，例如與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白有關(guān)的ras基因，由于點(diǎn)突變導(dǎo)致大量表達(dá)可見于多種腫瘤［3］。

抑癌基因是指細(xì)胞內(nèi)具有限制原癌基因變異、抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、維持細(xì)胞正常生長作用的基因。當(dāng)抑癌基因不表達(dá)或失活時(shí)，癌變細(xì)胞便能逃避機(jī)體免疫機(jī)制的控制，導(dǎo)致細(xì)胞的惡化及轉(zhuǎn)移。定位于染色體18q21的結(jié)直腸癌缺失基因(deleted in colorectal carcinoma，DCC)是一個(gè)重要的抑癌基因，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后關(guān)系密切，在結(jié)直腸癌通常會(huì)表現(xiàn)出的LOH［4］。bcl－2基因的過度表達(dá)與細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控有關(guān)聯(lián)，阻止了細(xì)胞凋亡［5］。由于腫瘤細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性，基因組中的大量基因出現(xiàn)缺失或者功能性缺陷。在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了抑癌基因的缺失和(或)失活，而LOH或MSI都可導(dǎo)致這種情況發(fā)生。

2 雜合性缺失

雜合性缺失即一個(gè)位點(diǎn)上兩個(gè)多態(tài)性的等位基因中的一個(gè)出現(xiàn)突變或缺失。LOH在腫瘤細(xì)胞中是一種非常常見的DNA變異，這種現(xiàn)象可經(jīng)多種途徑發(fā)生，包括基因缺失、基因轉(zhuǎn)換、有絲分裂重組和染色體丟失。腫瘤發(fā)生時(shí)，缺失區(qū)域可表現(xiàn)為抑癌基因功能缺失，由于另一條染色體上的抑癌基因功能仍可能正常，因此人體仍可以健康活著。但根據(jù)Knudson的二次打擊學(xué)說［6］，另一條染色體上的抑癌基因也會(huì)突變，從而失去對(duì)人體的保護(hù)。當(dāng)LOH在基因組包含大量多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域中遍布存在時(shí)，即意味著發(fā)生了染色體區(qū)域缺失。目前用于檢測(cè)特定位點(diǎn)LOH的方法是對(duì)腫瘤細(xì)胞全基因組的掃描。最近興起的人類基因組測(cè)序和生物信息學(xué)工具的使用，可以幫助快速準(zhǔn)確的找到腫瘤相關(guān)基因。

3 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性

微衛(wèi)星是基因組中大量、隨機(jī)存在的簡單串聯(lián)重復(fù)序列［7］。人類最常見的微衛(wèi)星是CA二核苷酸重復(fù)，可在基因組中出現(xiàn)上萬次。由于在小衛(wèi)星中出現(xiàn)了等位基因重復(fù)次數(shù)的變異，因此大部分微衛(wèi)星具有高度多態(tài)性。然而，每個(gè)個(gè)體特定的微衛(wèi)星長度是固定的。MSI是指?jìng)€(gè)體微衛(wèi)星中出現(xiàn)了基因條帶增多和大小的改變。MSI與DNA修復(fù)過程缺陷有關(guān)，通常是腫瘤發(fā)生的早期事件。與MSI有關(guān)的典型腫瘤是遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌。通過對(duì)結(jié)腸直腸癌的研究，人們發(fā)現(xiàn)了形成MSI的兩種不同機(jī)制。第一種，錯(cuò)配修復(fù)基因產(chǎn)生遺傳變異，導(dǎo)致了微衛(wèi)星重復(fù)序列的復(fù)制錯(cuò)誤未得到修復(fù)，產(chǎn)生了可能會(huì)使抑癌基因失活的移碼突變;第二種，表觀遺傳學(xué)的改變?nèi)鏒NA甲基化可能會(huì)使重要的錯(cuò)配修復(fù)酶基因沉默。兩種當(dāng)中的任何機(jī)制，均可引起抑癌基因因缺失或者插入而失活，從而導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖最終產(chǎn)生腫瘤。MSI還可見于其他一些惡性腫瘤，包括乳腺癌、膀胱癌和肺癌。Applied Biosystems公司應(yīng)用法醫(yī)分析用STR SGM Plus試劑盒對(duì)人體多種類型腫瘤進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)了LOH和MSI。

4 法醫(yī)STR遺傳標(biāo)記

由于遺傳不穩(wěn)定性在腫瘤研究中的突出作用，一些研究人員開始在多種腫瘤組織中研究與法醫(yī)分析用STR遺傳標(biāo)記的突變率。與此同時(shí)，基于四核苷酸重復(fù)序列的微衛(wèi)星序列的法醫(yī)分型用STR遺傳標(biāo)記也在國內(nèi)外DNA分型中快速發(fā)展?；诖朔N原因，Hoff－Olsen等［8］將取自同一患者的血液樣本和結(jié)腸直腸腺癌樣本分別進(jìn)行法醫(yī)分析用四核苷酸遺傳標(biāo)記分型。通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織的DNA分型均出現(xiàn)了MSI，其中hum-FES/FPS在群體調(diào)查研究改變頻率最大，為17%。在肺癌、胰腺癌中也觀察到類似的情況。這說明遺傳不穩(wěn)定性確實(shí)影響到了法醫(yī)DNA分型用的四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星。

由于表現(xiàn)出MSI和LOH的DNA分型結(jié)果很容易與自然操作誤差混淆，因此在對(duì)腫瘤組織的DNA分型結(jié)果解釋時(shí)應(yīng)格外謹(jǐn)慎。由于新的等位基因的出現(xiàn)，MSI可表現(xiàn)出與原始供體不同長度的等位基因。如果MSI導(dǎo)致了重復(fù)基序相對(duì)于原始等位基因出現(xiàn)較短距離移動(dòng)，這種情況很可能被DNA分析專家解釋為影子帶。影子帶是法醫(yī)DNA分型中最常見的現(xiàn)象，是由于PCR過程中出現(xiàn)了Taq聚合酶的滑動(dòng)，從而導(dǎo)致檢測(cè)到的產(chǎn)物與實(shí)際等位基因長度不同。影子帶是使用Taq聚合酶擴(kuò)增STR不可避免的現(xiàn)象［9］，當(dāng)所擴(kuò)增的在實(shí)際等位基因峰高＞4000 RFU(相對(duì)熒光的單位)的電泳圖譜尤為明顯。每個(gè)STR基因座甚至等位基因之間都有不同的影子帶特征，但是很少見到影子帶峰高超過相關(guān)等位基因峰高的15%。任何于影子帶位置發(fā)現(xiàn)的峰高＞15%相關(guān)等位基因峰高的通常認(rèn)為是混合DNA樣本［9］。腫瘤組織DNA分型電泳圖譜另一個(gè)特征是雜合子等位基因擴(kuò)增不平衡。DNA擴(kuò)增理想情況是雜合子的每個(gè)等位基因峰面積應(yīng)該是相當(dāng)?shù)?，等位基因之間的擴(kuò)增效率差異導(dǎo)致了等位基因的不平衡擴(kuò)增。而甲醛固定石蠟包埋腫瘤組織，由于DNA含量很小同時(shí)出現(xiàn)了降解，不平衡擴(kuò)增現(xiàn)象尤為明顯。微量DNA的擴(kuò)增很容易出現(xiàn)DNA分型失敗或部分分型，這種情況很可能被錯(cuò)誤的解釋為LOH。

當(dāng)以口腔癌患者特別是在臺(tái)灣嚼檳榔者的口腔拭子作為對(duì)照樣本時(shí)，腫瘤患者醫(yī)學(xué)樣本用于法醫(yī)DNA分型時(shí)出現(xiàn)的另一個(gè)問題［10，11］。刑事警察也曾多次將嚼過的檳榔殘留物視為重要證據(jù)用于DNA分析。為了弄清口腔癌患者口腔拭子STRDNA分型的可能存在的問題，Pai CY等［12］將分別取自100名口腔癌患者，100名健康的嚼檳榔者和100名健康的不嚼檳榔者的口腔拭子和外周血樣本分別進(jìn)行AmpFlSTR Profiler(Applied Biosystems)9個(gè)STR位點(diǎn)試劑盒擴(kuò)增。結(jié)果表明作為參照的外周血樣本DNA分型與口腔拭子DNA分型在口腔癌患者中有33%的偏移。而兩個(gè)健康對(duì)照組的外周血樣本DNA分型與口腔拭子DNA分型均未表現(xiàn)出偏移，這表明是口腔癌而非嚼檳榔與檢測(cè)到的遺傳改變有關(guān)。在口腔癌患者中也檢測(cè)到了LOH和微衛(wèi)星不穩(wěn)定，其中5名患者同時(shí)出現(xiàn)了這兩種類型的遺傳不穩(wěn)定性。這些發(fā)現(xiàn)同樣被很多其它的文獻(xiàn)所證實(shí)［12］，因此當(dāng)口腔癌患者出現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定性時(shí)不應(yīng)提取口腔試子用于法醫(yī)學(xué)鑒定。

盡管法醫(yī)分析用STR與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的基因之間并沒有明確的關(guān)聯(lián)，然而它們卻受到了腫瘤發(fā)生引起的遺傳學(xué)改變的影響。在多種類型腫瘤基因組中DNA重復(fù)區(qū)域均檢測(cè)到了LOH和或MSI，這些區(qū)域也包括法醫(yī)分析用STR的所有商業(yè)試劑盒。雖然已經(jīng)明確指出了在腫瘤組織中法醫(yī)分析用STR受到了LOH和MSI的影響，但是腫瘤組織用于法醫(yī)鑒定的情況還是很少見的。對(duì)于腫瘤患者，一旦有多種DNA來源，不應(yīng)選擇活檢組織。同樣，對(duì)已經(jīng)確診為口腔癌的個(gè)體采集DNA參照樣本時(shí)，也不應(yīng)選用口腔拭子。如果不存在備選樣本，研究者應(yīng)該充分考慮到遺傳不穩(wěn)定性對(duì)被分析位點(diǎn)的潛在影響，同時(shí)謹(jǐn)慎發(fā)表自己的發(fā)現(xiàn)。

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(2010－10－11收稿)(肖永紅 編輯)

DF 795.1

A

1008－6633(2011)01－040－03