BCA法測(cè)定食品中的微量銅

劉 璇，馮志明

(湖南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410008)

BCA法測(cè)定食品中的微量銅

劉 璇，馮志明*

(湖南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410008)

研究BCA(2,2'-聯(lián)喹啉-4,4'-二甲酸二鈉鹽)與銅的顯色反應(yīng)，建立測(cè)量食品微量銅的光度分析方法。在鹽酸羥胺存在條件下，pH11.0緩沖介質(zhì)中，BCA試劑與銅在物質(zhì)的量的比為2∶1的條件下反應(yīng)生成的紫色絡(luò)合物，λmax=562nm，ε562nm=7.72×103L/(mol·cm)，銅含量在0～4.8μg/mL內(nèi)符合比爾定律；經(jīng)測(cè)定茶葉和海帶中的銅含量，結(jié)果與原子吸收法的測(cè)定結(jié)果相符。結(jié)果表明：該方法穩(wěn)定準(zhǔn)確，可用于食品中微量銅的測(cè)定。

銅；測(cè)定；BCA法；分光光度法

銅是人體必需的微量元素，對(duì)機(jī)體造血、新陳代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、某些酶的活性及內(nèi)分泌等功能有重要作用。飲用水及食品中均含有一定量的銅，但如果人體攝入的銅過(guò)量將對(duì)人體構(gòu)成危害。近年由于農(nóng)業(yè)上大量使用含銅殺蟲(chóng)劑和除霉劑，加上工業(yè)“三廢”的污染，使許多食品中銅含量超標(biāo)。因此，食品中銅的允許限量一般不超過(guò)5～20mg/kg[1]。測(cè)定食品中銅的含量是食品檢驗(yàn)中的一項(xiàng)重要工作。目前，食品中微量銅的測(cè)定常用原子吸收光譜法[1-5]和光度法[6-10]。前者雖靈敏度高、選擇性好，但儀器昂貴、分析費(fèi)用高，而后者操作簡(jiǎn)便、精密度良好、儀器價(jià)格低，易于普及。

茶葉和海帶中微量銅的測(cè)定多采用原子吸收法(atomic absorption spectrometry，AAS)[11-13]。文獻(xiàn)雖報(bào)道了許多新型有機(jī)顯色劑用于光度法測(cè)定銅，但用于食品中銅的分析時(shí)，大量鈣、鎂、鐵和鋅的干擾仍然較重[14-17]。為了進(jìn)一步提高光度法測(cè)定銅的選擇性，研究了新試劑BCA與銅的顯色反應(yīng)。BCA(2,2'-聯(lián)喹啉-4,4'-二甲酸二鈉鹽)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的一種常用試劑[18]。在堿性條件下，通過(guò)鹽酸羥胺將二價(jià)銅離子還原為亞銅離子，亞銅離子和BCA鈉鹽反應(yīng)生成紫色絡(luò)合物(圖1)。文獻(xiàn)報(bào)道了BCA法測(cè)定血清和生物樣品中的銅[19]、藥物中的地爾硫卓[20]和飲料中的鞣酸[21]，但BCA法測(cè)定茶葉和海帶中微量銅的報(bào)道較少。

圖1 BCA與亞銅離子形成的紫色配合物Fig.1 Chemical structure of BCA-Cu+ complex (violet in color)

本實(shí)驗(yàn)研究了以BCA為顯色劑在水中直接比色測(cè)定食品中微量銅的方法，通過(guò)測(cè)定其在562nm處的吸光度建立茶葉和海帶中微量銅的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉和海帶洗凈于80℃烘干后備用。

BCA 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

722S型分光光度計(jì) 上海菁華科學(xué)儀器有限公司；AA7000W原子吸收光譜儀 北京東西分析儀器有限公司；PHS-25型酸度計(jì) 上海雷磁科學(xué)儀器有限公司；電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-2000雙光束紫外分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器公司。

1.3 溶液的配制

BCA試劑(1g/100mL)：分別稱(chēng)取2.50g BCA、5.00g碳酸鈉(Na2CO3·H2O)、2.40g碳酸氫鈉(NaHCO3)、1.00g氫氧化鈉(NaOH)、0.40g酒石酸鉀鈉(Na2C4H4O6· 2H2O)，適量水溶解后，用2g/100mL NaOH溶液和固體NaHCO3調(diào)節(jié)pH11.0，定容至250mL。

Cu(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/mL)：稱(chēng)取0.5000g純銅，置于100mL燒杯中，加入10.0mL濃硝酸，置于電爐上加熱溶解，并蒸發(fā)至近干，冷卻后加水，加熱溶解；冷卻后定容至500mL即為1000μg/mL的Cu(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液。取2.50mL該儲(chǔ)備液稀釋至250mL，即為10μg/mL的Cu(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

鹽酸羥胺溶液(10mg/mL)：稱(chēng)取2.50g鹽酸羥胺，適量水溶解后定容至250mL。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取烘干并磨細(xì)的海帶或茶葉5.00～10.00g，放入250mL錐形瓶中，先加入5.0mL硝酸，加熱蒸發(fā)至近干，稍冷，再加入2.0mL硫酸，繼續(xù)加熱，少量多次加入硝酸以維持氧化條件，直至溶液無(wú)色透明，繼續(xù)加熱至產(chǎn)生硫酸霧，硝酸完全除去，冷卻，加適量水，溫?zé)崛芙饪扇茺}，若有沉淀應(yīng)過(guò)濾(為提高消解效果，常加入少量H2O2)。冷卻后滴加NaOH溶液，用酸度計(jì)控制pH值約為11.0，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中定容，搖勻即得樣品測(cè)試液。

1.5 測(cè)定方法

BCA比色法：于25mL容量瓶中加入一定量的銅標(biāo)準(zhǔn)液，然后加入3.00mL鹽酸羥胺溶液，振蕩；再加入5.00mL BCA 試劑，用水稀釋至刻度，充分搖勻后放置15min，待顯色完全后在分光光度計(jì)上，以相應(yīng)的試劑空白(用等量的二次蒸餾水代替銅標(biāo)準(zhǔn)液，其他試劑加入同上)作參比，用1cm比色皿于562nm處測(cè)量溶液的吸光度，以此進(jìn)行銅的定量分析。

原子吸收法：按照GB/T 5009.13—2003《食品中銅的測(cè)定方法》進(jìn)行。測(cè)定條件：火焰類(lèi)型：乙炔/空氣；測(cè)定波長(zhǎng)324.75nm(銅空心陰極燈)；燈電流2mA；狹縫0.2nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收光譜

按照實(shí)驗(yàn)方法在不同波長(zhǎng)處，繪制銅絡(luò)合物對(duì)蒸餾水的吸收光譜曲線(圖2)。結(jié)果表明BCA與Cu(Ⅰ)離子形成的紫色絡(luò)合物λmax=562nm。本實(shí)驗(yàn)選擇的測(cè)定波長(zhǎng)為562nm。

圖2 BCA與亞銅離子形成的紫色配合物的吸收光譜Fig.2 Visible absorption spectrum of BCA-Cu+complex

2.2 單因素試驗(yàn)

影響吸光度的因素較多(各試劑用量、pH值、溫度等)，本實(shí)驗(yàn)采用單因素輪換法確定最佳反應(yīng)條件。

2.2.1 pH值的影響

用固體NaOH或NaHCO3調(diào)節(jié)酸度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：溶液pH值為11.0～11.5時(shí)，吸光度A562nm較大且穩(wěn)定(圖3)。本實(shí)驗(yàn)選用pH11.0的Na2CO3-NaHCO3緩沖液進(jìn)行測(cè)定。

圖3 酸度對(duì)吸光度的影響Fig.3 Effect of acidity on absorbance at 562 nm of BCA-Cu+complex

2.2.2 溫度的影響

在不同的溫度(10～60℃)條件下按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：40℃以下吸光度變化很小，溫度對(duì)其影響不大。本實(shí)驗(yàn)選擇在室溫條件下進(jìn)行。

2.2.3 顯色時(shí)間的影響

反應(yīng)在室溫條件下生成配合物的速度比較快，測(cè)定結(jié)果表明：15min后顯色完全，A562nm達(dá)到最大且穩(wěn)定，顯色完全后體系至少可穩(wěn)定30min。

2.2.4 鹽酸羥胺的影響

僅改變鹽酸羥胺用量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：當(dāng)鹽酸羥胺的用量為3mL時(shí)，A562nm最大(圖4)。本實(shí)驗(yàn)選用3.00mL鹽酸羥胺。

圖4 鹽酸羥胺用量對(duì)吸光度的影響Fig.4 Effect of hydroxylamine hydrochloride amount on absorbance at 562 nm of BCA-Cu+complex

2.2.5 BCA試劑用量的影響

僅改變BCA試劑的用量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：當(dāng)BCA試劑在用量為5～6mL時(shí)，吸光度A562nm最大(圖5)。本實(shí)驗(yàn)選用5.00mL BCA試劑。

圖5 BCA試劑用量對(duì)吸光度的影響Fig.5 Effect of BCA reagent amount on absorbance at 562 nm of BCA-Cu+complex

2.3 工作曲線和檢測(cè)限

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，分別取0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、5.00、7.00、10.00、12.00mL Cu (Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定并繪制出工作曲線(圖6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cu(Ⅱ)的質(zhì)量濃度在0～4.8μg/mL范圍內(nèi)與A呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為A=0.1229C-0.0032，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。由工作曲線斜率求得ε562nm=7.72×103L/(mol·cm)。

2.4 共存離子的影響

按照實(shí)驗(yàn)方法，Cu(Ⅱ)為1μg/mL且相對(duì)誤差小于等于±5%時(shí)，共存離子的允許量(μg)為：Ca2+(100)、Mg2+(100)、Fe3+(5)、Zn2+(42)。Na+、F-、Cl-、不干擾。

2.5 樣品分析

吸取一定量的樣品測(cè)試液于25mL容量瓶中，加入2.00mL質(zhì)量濃度為10g/100mL NaF溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法操作，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 BCA法與原子吸收法測(cè)定樣品中銅的結(jié)果Table 1 Results of copper content in kelp and tea determined by BCA and AAS methods

由表1可見(jiàn)，兩種方法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差均在5%范圍內(nèi)。海帶樣品組中，BCA法測(cè)得的銅含量為6.5229 μg/g，而原子吸收法的結(jié)果為6.6400μg/mL，經(jīng)F檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量F=10.29＜F表[22]；經(jīng)t檢驗(yàn)，t=2.44＜t表[22]，兩組檢驗(yàn)結(jié)果表明BCA法和AAS法對(duì)海帶中銅的測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異。茶葉樣品組中，BCA法測(cè)得的銅含量為12.8346μg/g，而原子吸收法的結(jié)果為12.9994μg/mL，經(jīng)F檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量F=5.33＜F表[22]；經(jīng)t檢驗(yàn)，t=1.38＜t表[22]，兩組檢驗(yàn)結(jié)果表明BCA法和AAS法對(duì)茶葉中銅的測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異。

表2 樣品中銅的回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Spike recovery rates of copper in kelp and tea determined by BCA method

由表1、2數(shù)據(jù)看出，本法測(cè)定結(jié)果與AAS法結(jié)果相吻合，加標(biāo)回收率在99.8%～107.4%之間。因此，本實(shí)驗(yàn)建立的測(cè)定食品中微量銅的檢測(cè)方法結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

3 結(jié) 論

用BCA法測(cè)定食品中微量銅，不僅方法簡(jiǎn)便易行、選擇性好，其最大的優(yōu)點(diǎn)是：顯色反應(yīng)是在水溶液中完成，不需要通過(guò)萃取或加大量的有機(jī)溶劑來(lái)增加溶解度，而且反應(yīng)不需要加熱，在室溫條件下就可完成，反應(yīng)時(shí)間較快，這不僅簡(jiǎn)化了操作、減少了誤差，而且應(yīng)用于實(shí)際樣品的測(cè)定效果理想。

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Spectrometric Determination of Trace Copper in Foods by BCA (2,2'-Biquinoline-4,4＇-dicarboxylic acid disodium salt) Method

LIU Xuan，F(xiàn)ENG Zhi-ming*
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Normal University, Changsha 410008, China)

The colour reaction between BCA (2,2'-biquinoline-4,4＇-dicarboxylic acid disodium salt) and copper was developed for determining trace copper in foods. In the presence of pH 11.0 buffer solution and hydroxylamine hydrochloride, BCA could react with copper (II) to form a purple complex with a ratio of 2∶1. The molar absorbance constant was 7.72 × 103L/(mol·cm) at 562 nm. The absorbance obeyed Beer sin the range of 0-4.8μg/mL Cu (Ⅱ). The established method was used for the determination of trace copper in tea and kelp. The determination results are consistent with the results from atomic absorption spectrometry (AAS) method. In conclusion, this method has the advantages of good accuracy, stability and can therefore be applied to the determination of trace copper in foods.

copper；determination；BCA method；spectrophotometry

O657.32

A

1002-6630(2011)14-0277-04

2010-11-07

湖南省教育科研項(xiàng)目(09C641)

劉璇(1986—)，女，碩士研究生，主要從事應(yīng)用化學(xué)研究。E-mail：xuan11221122@163.com

*通信作者：馮志明(1962—)，男，副教授，碩士，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：fengzhiming@163.com