• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黃皮果汁中酯酶產(chǎn)生細(xì)菌的選育與酶學(xué)特性研究

    2015-10-24 05:43:16王文文張東峰湯敬謙
    食品研究與開發(fā) 2015年11期
    關(guān)鍵詞:黃皮甘油酯酯酶

    王文文,張東峰,湯敬謙

    (1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系,廣東廣州510300;2.廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心,廣東廣州510300;3.暨南大學(xué)圖書館,廣東廣州510632)

    黃皮果汁中酯酶產(chǎn)生細(xì)菌的選育與酶學(xué)特性研究

    王文文1,2,張東峰1,2,湯敬謙3

    (1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系,廣東廣州510300;2.廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心,廣東廣州510300;3.暨南大學(xué)圖書館,廣東廣州510632)

    為獲得優(yōu)良酯酶產(chǎn)生菌,從自然發(fā)酵的黃皮果汁中進(jìn)行篩選。通過對(duì)樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)和平板初篩,從黃皮果汁中篩選出酯酶產(chǎn)生菌106株,然后再采用三乙酸甘油酯為唯一碳源進(jìn)行馴化,搖瓶發(fā)酵等進(jìn)一步進(jìn)行篩選,通過測(cè)定酶活,最后獲得1株優(yōu)良酯酶產(chǎn)生菌C10。經(jīng)形態(tài)特征、生理生化以及16S rDNA序列分析,斷定該菌為蠟狀芽孢桿菌屬(Bacillus cereus.)。對(duì)菌株C10所產(chǎn)酯酶的部分酶學(xué)特性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:該菌株所產(chǎn)的酯酶為堿性酯酶,最適作用pH為9.0,最適作用溫度為60℃,且該酯酶具有較好的耐熱性和堿穩(wěn)定性。

    蠟狀芽孢桿菌;酯酶;酶學(xué)特性

    酯酶(Esterase,EC3.1.1.1)是指能夠催化羧酸酯的酶的總稱,水解時(shí)催化酯鍵產(chǎn)生甘油和脂肪酸;合成時(shí),把酸的羧基與醇的羥基脫水縮合,產(chǎn)物為酯類及其他香味物質(zhì),它廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)[1]。國內(nèi)外的研究多集中在動(dòng)植物酯酶上,而對(duì)微生物酯酶報(bào)道較少。而微生物酯酶與動(dòng)物脂肪酶相比,具有更廣的作用pH、作用溫度范圍,高穩(wěn)定性和活性,底物特異性和立體選擇性[2]。微生物資源豐富,微生物酯酶已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、污水處理和生物修復(fù)等領(lǐng)域,微生物酯酶已成為研究熱點(diǎn)[3-8]。本文以三乙酸甘油酯為底物,從自然發(fā)酵的黃皮果汁中篩選產(chǎn)酯酶優(yōu)良的菌株,并從最適溫度、最適pH、熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性等方面研究酯酶的酶學(xué)特性。

    1材料與方法

    1.1材料與儀器

    自然發(fā)酵的黃皮果汁。溴甲酚紫及三乙酸甘油酯等購自啟隆生物科技有限公司,所有試劑均為分析純?;A(chǔ)培養(yǎng)基:牛肉膏20.0 g/L,葡萄糖10.0 g/L,(NH4)2SO45.0 g/L,K2HPO45.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.0 g/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L,NaCl 0.5 g/L,調(diào)pH至7.0,121℃滅菌20 min后加入三乙酸甘油酯10.0 mL/L(三乙酸甘油酯需乳化6 min,乳化劑為吐溫);選擇性平板培養(yǎng)基:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加三乙酸甘油酯乳化液25.0 mL/L,瓊脂20.0 g/L,溴甲酚紫0.04 g/L,pH 7.2,121℃,滅菌20 min;搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基:在選擇性平板培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上去掉瓊脂和溴甲酚紫,并且以三乙酸甘油酯為唯一碳源;產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基同基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

    QYC-200全溫度恒溫培養(yǎng)搖床:上海?,攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;A200基因擴(kuò)增儀:杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;RDY-SP1Z核酸電泳儀:北京榮陽經(jīng)典科技有限公司;GI-1凝膠成像系統(tǒng):通寶達(dá)成科技(北京)有限公司;KDC-210HR高速冷凍離心機(jī):安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C雷磁酸度計(jì):上海雷磁儀器廠;S22PC分光光度計(jì):上海凌光技術(shù)有限公司。

    1.2酯酶產(chǎn)生菌的分離純化

    取自然發(fā)酵的黃皮果汁樣品3 mL加入到含有100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的錐形瓶中進(jìn)行富集培養(yǎng),30℃恒溫200 r/min培養(yǎng)36 h后,吸取10 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于含有90 mL新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基的錐形瓶中,仍在上述條件下富集培養(yǎng)。將富集培養(yǎng)的培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋,分別取一定量涂布在選擇性平板培養(yǎng)基礎(chǔ)上,30℃培養(yǎng)24 h,直至出現(xiàn)透明圈,用竹簽挑取透明圈比較明顯的單菌落劃線分離純化。依據(jù)透明圈直徑與菌落直徑比值的大小分離出優(yōu)良酯酶產(chǎn)生菌。

    1.3產(chǎn)酶發(fā)酵復(fù)篩

    挑取酯酶產(chǎn)生菌單菌落接種于裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的錐形瓶中,進(jìn)行種子活化,待菌體長至對(duì)數(shù)生長期,離心收集菌體并接入產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中,32℃,200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h,然后測(cè)定酯酶活力,根據(jù)酯酶活力篩選優(yōu)良菌株。

    1.4測(cè)定酯酶活力[9]

    將培養(yǎng)好的發(fā)酵液于4℃,4000r/min離心15min,收集上清液,即得粗酶液。吐溫與三乙酸甘油酯體積比2.5∶1混合,充分乳化,取5 mL乳化液,加pH7.0的磷酸緩沖液4 mL,室溫保溫6 min,然后加1 mL粗酶液,開始計(jì)時(shí),繼續(xù)保溫10 min~30 min后,加20 mL 95%的無水乙醇終止反應(yīng)。用滅活酶液作對(duì)照。作用后的酶液與對(duì)照組分別用0.05 mol/L的NaOH進(jìn)行滴定,酚酞作指示劑,根據(jù)兩者的堿液消耗差值計(jì)算酶活。酶活力單位定義為:在本實(shí)驗(yàn)條件下,每分鐘釋放出1 μmol游離醋酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

    1.5菌株鑒定

    參照《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化鑒定[10],并進(jìn)行16S rDNA基因序列分析。利用CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨法)對(duì)菌株總DNA(脫氧核糖核苷酸)進(jìn)行提取,細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行序列擴(kuò)增。上游引物序列為:5’-AGAGATTGATCCTGGCTCTG-3’;下游引物序列為:5’-GGTTTCCTTGTTACGACAT-3’。擴(kuò)增反應(yīng)體系如下(50 μL):dNTP(10 mmol/L)1 μL,Mg2+(25 mmol/L)4 μL,forward primer(上游引物)(50 μM)0.5 μL,reverse primer(下游引物)(50 μmol/L)0.5 μL,模板DNA 1 μL,TaKaRa primer STAR HS高保真酶0.5 μL(5 unit/μL),10×buffer 5 μL,加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。

    擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性20 s,55℃退火10s,72℃延伸1.5min,34個(gè)循環(huán);72℃延伸5min,保溫5 min。使用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收16S rDNA的基因片段,將純化后的PCR產(chǎn)物送至華大基因有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI的Genbank中進(jìn)行相似性分析,并用Mega5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.6酯酶酶學(xué)特性研究

    酯酶的酶活力受外界條件的影響較大,本研究擬從酯酶反應(yīng)的最適pH、最適溫度、酯酶的pH穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性等方面對(duì)酯酶的酶學(xué)特性進(jìn)行初步探討。

    2結(jié)果與分析

    2.1產(chǎn)酶發(fā)酵篩選結(jié)果

    圖1 10株菌的產(chǎn)酯酶活力Fig.1Esterase activity of 10 strains

    從選擇性平板培養(yǎng)基上挑選到106株產(chǎn)透明圈的菌株,經(jīng)搖瓶發(fā)酵篩選,最終確定10株相對(duì)產(chǎn)酯酶較好的菌株,如圖1所示。10株菌的產(chǎn)酶活力分布在7.88 U/mL~24.90 U/mL之間,其中C2,C4,C10三株菌產(chǎn)酯酶活力超過20 U/mL,C10產(chǎn)酯酶活力最高,達(dá)到24.90 U/mL,因此,選取該菌株進(jìn)行深入研究。

    2.2C10菌株的鑒定

    菌株C10的菌落形態(tài)和普通顯微鏡照片(10×100倍)分別見圖2-a和圖2-b。經(jīng)革蘭氏染色,發(fā)現(xiàn)其為革蘭氏陽性菌,菌體呈短桿狀,單個(gè)或成對(duì)排列如圖2-b所示。C10菌株的生理生化指標(biāo)見表1。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)的描述,初步判定該菌株為Bacillus sp。

    圖2 菌株C10菌落和革蘭氏染色照片F(xiàn)ig.2Colony and gram stain photos of strain C10

    表1 生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1Results of physiology and biochemistry

    菌株C10的16S rDNA利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序,將得到的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast,發(fā)現(xiàn)C10菌株與芽孢桿菌屬(Bacillus)最相似。選取基因序列相似度較高的菌株,用Mega5.0建樹如圖3所示。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知,該菌株與Bacillus cereus最相似,進(jìn)一步斷定該菌株屬于Bacillus cereus的一支。

    圖3 菌株C10的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3Phylogenetic anlysis of strain C10

    2.3酯酶酶學(xué)特性研究

    2.3.1酯酶作用最適溫度

    粗酶液與底物混合,在pH7.0條件下,測(cè)定不同溫度(20℃~70℃)下酯酶活力,結(jié)果如圖4所示。

    圖4 溫度對(duì)酯酶活力的影響Fig.4Effect of temperature on the activity of esterase

    由圖4可知,在20℃~60℃的范圍內(nèi),隨著溫度的升高酯酶的活力逐漸提高,在60℃達(dá)到最高;超過60℃,酶活下降,因此選取60℃為酯酶作用的最適溫度。

    2.3.2酯酶作用最適pH

    將酶液分別于不同pH(4.0~10.0)的緩沖液中,60℃溫浴,測(cè)定酯酶活力。結(jié)果如圖5所示。

    圖5 pH對(duì)酯酶活力的影響Fig.5Effect of pH on the activity of esterase

    酯酶在pH 4.0時(shí)活力為零,隨著pH增加酶活提高,在pH9.0時(shí)達(dá)到最大。pH超過9.0,酶活逐漸降低。因此,確定該酶為堿性酯酶,其最適作用pH為9.0。

    2.3.3酯酶的熱穩(wěn)定性

    將粗酶液分別在不同的溫度下(40℃~80℃)處理1 h,然后冷卻至室溫,測(cè)定該酶相對(duì)于4℃下放置酶液的殘余活力,即以4℃放置的酶液的酶活為100%。結(jié)果如圖6所示。

    該酶在40℃下相對(duì)酶活為85.26%,在80℃時(shí)仍具有39.85%的酶活,表明該酶具有較好的熱穩(wěn)定性。

    2.3.4酯酶的pH穩(wěn)定性

    將粗酶液在不同pH緩沖溶液中處理24 h,測(cè)定該酶相對(duì)于pH9.0下放置的殘余活力。結(jié)果見圖7。

    圖6 酯酶的熱穩(wěn)定性Fig.6The thermal stability of esterase

    圖7 酯酶的pH穩(wěn)定性Fig.7The pH stability of esterase

    由圖7可知,該酶在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性較弱,相對(duì)酶活較低,而在堿性環(huán)境下隨著pH增加,穩(wěn)定性增加,在pH8.0時(shí)相對(duì)酶活保存74.61%,在pH10.0相對(duì)酶活保存86.87%,而在pH4.0時(shí)相對(duì)酶活保存只有10.62%,說明該酶具有較好的耐堿性。

    3結(jié)論與討論

    從自然發(fā)酵的黃皮果汁樣品中篩選到一株優(yōu)良酯酶產(chǎn)生菌株C10,酶活達(dá)到24.90 U/mL。通過形態(tài)學(xué)特征,生理生化及16S rDNA基因序列分析,確定該菌為Bacillus cereus。研究了菌株C10所產(chǎn)酯酶的部分酶學(xué)特性,結(jié)果表明,菌株所產(chǎn)酯酶為堿性酯酶,其最適作用溫度為60℃,最適作用pH為9.0,并具有較好的耐熱性和堿穩(wěn)定性。為使菌株C10能穩(wěn)定產(chǎn)酯酶以及產(chǎn)酯酶能力提高,其發(fā)酵特性還有待于進(jìn)一步研究。

    [1]張敏文,劉悅,李荷.微生物酯酶的研究進(jìn)展[J].廣東第二師范學(xué)院學(xué)報(bào),2012,32(3):66-71

    [2]Bornscheue U T.Microbial carboxyl esterases:classification,properties and application in biocatalysis[J].FEMS Microbiol Rev,2002,26(1):73-81

    [3]Atomi H,Imanaka T.Thermostable carboxylesterases from hyperthermophiles[J].Tetrahedron:Asymmetry,2004,69(15):2729-2735

    [4]Panda T,Gowrishankar B S.Production and applications of esterases[J].Appl Micro Biotech,2005,67(2):160-169

    [5]李玲玉,劉艷,顏冬云,等.擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解與代謝研究進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2010,33(4):65-71

    [6]王寶娟,蘇蕊蕊,朱國萍.鏈霉菌酯酶研究進(jìn)展[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,33(4):165-170

    [7]周鵬,俞中.應(yīng)用果膠甲基酯酶改善番茄醬的粘度[J].食品工業(yè)科技,2004,24(5):29-30

    [8]焦云鵬,王志民,蔣長興.固定化果膠酯酶的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(8):137-139

    [9]鄢洪德,汪釗,李光偉.產(chǎn)酯酶微生物菌種的篩選研究[J].工業(yè)微生物,2007,37(6):44-48

    [10]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001:43-65

    Isolation of Esterase-Producing Strain from Juice of Clausena lansium Skeels and Characterization Study on the Esterase

    WANG Wen-wen1,2,ZHANG Dong-feng1,2,TANG Jing-qian3
    (1.Department of Food and Bioengineering,Guangdong Industry Technical College,Guangzhou 510300,Guangdong,China;2.Center of Guangdong Higher Education for Engineering and Technological Development of Specialty Condiments,Guangzhou 510300,Guangdong,China;3.Jinan University Library,Guangzhou 510632,Guangdong,China)

    To screen out excellent esterase-producing bacteria,we screen it from natural fermentation juice of Clausena lansium(Lour)Skeels.106 strains were isolated by enrichment culture and plate isolation and 1 excellent esterase-producing train C10 was gotted by using glyceryl triacetate as the sole carbon source,shake flask fermentation and enzyme activity determination.Based on the physiological and biochemical test and 16 S rDNA gene sequence analysis,it concludes that the bacteria belong to Bacillus cereus.Then the enzymatic properties were studied and the results showed that it was an alkaline esterase,the optimal temperature and pH of the esterase were 60℃and 9.0 respectively.And The esterase with heat resistance and alkali stability.

    Bacillus cereus;esterase;enzymatic properties

    10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.031

    2014-04-17

    廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心建設(shè)項(xiàng)目(GCZXB1103);廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院自然科學(xué)基金項(xiàng)目(KJ201210)

    王文文(1982—),女(漢),講師,碩士研究生,從事生物工程方面的研究。

    猜你喜歡
    黃皮甘油酯酯酶
    廣東:郁南縣大力發(fā)展黃皮
    黃皮果就是桂圓嗎
    地黃梓醇和乙酰膽堿酯酶作用的分子動(dòng)力學(xué)模擬
    我愛家鄉(xiāng)的黃皮果
    蜈蚣草化學(xué)成分及抑制乙酰膽堿酯酶生物活性研究
    新的藥根堿三唑的合成與抗菌以及乙酰膽酯酶抑制活性評(píng)價(jià)
    黃皮莖化學(xué)成分的研究
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    乙烯-丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸縮水甘油酯三元共聚物增韌PBT的研究
    中國塑料(2016年2期)2016-06-15 20:30:00
    液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定食用植物油中縮水甘油酯的含量
    二咖啡??鼘幩崤c人血漿阿司匹林酯酶的分子對(duì)接
    中成藥(2014年9期)2014-02-28 22:28:55
    欧美一区二区国产精品久久精品| 久久久久国内视频| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久性视频一级片| 18禁美女被吸乳视频| 国产av不卡久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美成人免费av一区二区三区| 好男人在线观看高清免费视频| 天美传媒精品一区二区| 最新中文字幕久久久久| 一进一出抽搐动态| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲av不卡在线观看| 97超视频在线观看视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 九九热线精品视视频播放| 国产成+人综合+亚洲专区| 日韩亚洲欧美综合| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美黄色淫秽网站| 欧美日韩一级在线毛片| 麻豆成人午夜福利视频| 哪里可以看免费的av片| 国产主播在线观看一区二区| 国产成+人综合+亚洲专区| 免费在线观看日本一区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 免费av毛片视频| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 变态另类成人亚洲欧美熟女| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 18禁美女被吸乳视频| 97超视频在线观看视频| 免费看a级黄色片| 不卡一级毛片| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲精品456在线播放app | 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美bdsm另类| 久久中文看片网| 88av欧美| 麻豆国产97在线/欧美| 制服丝袜大香蕉在线| 岛国在线免费视频观看| 成人无遮挡网站| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲国产精品成人综合色| www.999成人在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 日韩欧美精品v在线| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产主播在线观看一区二区| 男女床上黄色一级片免费看| 午夜a级毛片| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品国产亚洲在线| 精品一区二区三区人妻视频| 日韩人妻高清精品专区| 成人国产一区最新在线观看| 国产av在哪里看| 一区福利在线观看| 亚洲18禁久久av| 哪里可以看免费的av片| 日韩欧美免费精品| 69av精品久久久久久| 中国美女看黄片| 亚洲精华国产精华精| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 一级作爱视频免费观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲精品456在线播放app | 最近最新中文字幕大全电影3| 91在线精品国自产拍蜜月 | 嫁个100分男人电影在线观看| 免费av毛片视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 中文资源天堂在线| 两人在一起打扑克的视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品久久久久久久末码| 两个人视频免费观看高清| 日韩av在线大香蕉| 亚洲精品影视一区二区三区av| 欧美黑人巨大hd| 桃红色精品国产亚洲av| 午夜精品在线福利| 欧美日韩福利视频一区二区| 老司机午夜十八禁免费视频| aaaaa片日本免费| 两人在一起打扑克的视频| www.www免费av| 一级毛片高清免费大全| 在线观看午夜福利视频| 亚洲,欧美精品.| 日本与韩国留学比较| 亚洲电影在线观看av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产在线精品亚洲第一网站| 99久久综合精品五月天人人| bbb黄色大片| 熟女人妻精品中文字幕| 青草久久国产| 成人午夜高清在线视频| 午夜福利在线观看吧| 99国产综合亚洲精品| 精品久久久久久成人av| 禁无遮挡网站| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲五月天丁香| 成年人黄色毛片网站| 一边摸一边抽搐一进一小说| 男女床上黄色一级片免费看| 宅男免费午夜| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久6这里有精品| 午夜福利在线观看吧| 一进一出抽搐动态| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产熟女xx| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲欧美日韩无卡精品| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 19禁男女啪啪无遮挡网站| 舔av片在线| 午夜福利在线观看吧| 亚洲欧美日韩高清专用| x7x7x7水蜜桃| 成熟少妇高潮喷水视频| 少妇的逼水好多| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲专区中文字幕在线| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产一区二区在线观看日韩 | 两个人的视频大全免费| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久精品国产综合久久久| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| a在线观看视频网站| 亚洲av熟女| 国产欧美日韩一区二区三| 午夜免费成人在线视频| 成人国产一区最新在线观看| 精品电影一区二区在线| 精品电影一区二区在线| 丁香欧美五月| 国产精品一区二区三区四区久久| 舔av片在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 51国产日韩欧美| 国产av一区在线观看免费| 成人精品一区二区免费| 亚洲欧美日韩东京热| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产高清视频在线观看网站| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美日韩乱码在线| 欧美激情在线99| 欧美在线一区亚洲| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产熟女xx| 成人永久免费在线观看视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 9191精品国产免费久久| 色综合婷婷激情| 韩国av一区二区三区四区| 香蕉久久夜色| 日韩国内少妇激情av| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲最大成人中文| 伊人久久精品亚洲午夜| 在线观看66精品国产| 亚洲电影在线观看av| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久久久亚洲av毛片大全| 成人国产一区最新在线观看| 美女黄网站色视频| 天美传媒精品一区二区| bbb黄色大片| av黄色大香蕉| 日韩国内少妇激情av| 日韩欧美 国产精品| 美女免费视频网站| 久久久久久国产a免费观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 好男人在线观看高清免费视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美日本视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 999久久久精品免费观看国产| 国内揄拍国产精品人妻在线| 日本a在线网址| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 色综合欧美亚洲国产小说| 日韩欧美国产一区二区入口| 大型黄色视频在线免费观看| 男人舔奶头视频| 亚洲,欧美精品.| 国产伦人伦偷精品视频| 成人性生交大片免费视频hd| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 精品国内亚洲2022精品成人| 又黄又爽又免费观看的视频| 91字幕亚洲| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 无人区码免费观看不卡| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产日本99.免费观看| 亚洲不卡免费看| 国产美女午夜福利| 欧美黄色淫秽网站| 在线观看日韩欧美| 一区二区三区免费毛片| 桃红色精品国产亚洲av| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美性猛交黑人性爽| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 国产v大片淫在线免费观看| 国产亚洲欧美98| 精品日产1卡2卡| 国产成人av激情在线播放| 搡老熟女国产l中国老女人| 在线天堂最新版资源| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 丰满乱子伦码专区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 男人舔女人下体高潮全视频| a级毛片a级免费在线| 日韩亚洲欧美综合| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 最好的美女福利视频网| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲av二区三区四区| 欧美+日韩+精品| 99久久九九国产精品国产免费| 久久精品91蜜桃| 国产av在哪里看| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产亚洲精品一区二区www| 国产乱人伦免费视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲国产精品sss在线观看| 97超视频在线观看视频| 乱人视频在线观看| 成年女人永久免费观看视频| 99国产综合亚洲精品| 久久亚洲真实| 一本一本综合久久| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产99白浆流出| av天堂在线播放| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲av第一区精品v没综合| 女人被狂操c到高潮| 一区二区三区国产精品乱码| 免费一级毛片在线播放高清视频| 精品国产亚洲在线| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲av美国av| 日韩欧美精品免费久久 | 亚洲av熟女| 午夜免费激情av| 在线观看免费午夜福利视频| 成人18禁在线播放| 在线天堂最新版资源| 国产免费av片在线观看野外av| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品亚洲av一区麻豆| 精品久久久久久成人av| av专区在线播放| 免费在线观看影片大全网站| 国产高清视频在线观看网站| tocl精华| 真实男女啪啪啪动态图| 免费av不卡在线播放| 3wmmmm亚洲av在线观看| 极品教师在线免费播放| 日韩有码中文字幕| 免费在线观看日本一区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲内射少妇av| 欧美色视频一区免费| 久久国产精品人妻蜜桃| 免费av不卡在线播放| 国产91精品成人一区二区三区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲欧美激情综合另类| svipshipincom国产片| 老司机在亚洲福利影院| 精华霜和精华液先用哪个| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲国产欧美网| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲专区中文字幕在线| 哪里可以看免费的av片| 成年女人毛片免费观看观看9| av天堂中文字幕网| 少妇的逼好多水| 最近在线观看免费完整版| 色综合婷婷激情| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产成人影院久久av| 欧美成人免费av一区二区三区| 18+在线观看网站| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久6这里有精品| 一级毛片女人18水好多| 亚洲精品日韩av片在线观看 | h日本视频在线播放| 老司机在亚洲福利影院| 一二三四社区在线视频社区8| 老司机福利观看| 国产99白浆流出| 制服丝袜大香蕉在线| 99热这里只有是精品50| 精品人妻1区二区| www.www免费av| 波多野结衣巨乳人妻| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美日韩一级在线毛片| 国产熟女xx| 国产99白浆流出| 听说在线观看完整版免费高清| 两人在一起打扑克的视频| 一区二区三区激情视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 免费在线观看成人毛片| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品一区二区三区四区久久| 可以在线观看的亚洲视频| 免费av观看视频| 无遮挡黄片免费观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 看黄色毛片网站| av欧美777| 国产亚洲av嫩草精品影院| netflix在线观看网站| 亚洲,欧美精品.| 国产成人av教育| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 女人被狂操c到高潮| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产 一区 欧美 日韩| 熟女电影av网| 国产精品精品国产色婷婷| 日本 欧美在线| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 午夜免费激情av| 99久久99久久久精品蜜桃| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产综合懂色| 最好的美女福利视频网| 亚洲精品久久国产高清桃花| 可以在线观看毛片的网站| 国产不卡一卡二| 美女cb高潮喷水在线观看| 9191精品国产免费久久| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 高清毛片免费观看视频网站| 免费在线观看日本一区| 男女午夜视频在线观看| 久久久久国内视频| 18+在线观看网站| 香蕉av资源在线| 国产97色在线日韩免费| 国产老妇女一区| 久久精品影院6| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 美女黄网站色视频| aaaaa片日本免费| 在线天堂最新版资源| 18禁在线播放成人免费| 一本精品99久久精品77| 精品人妻1区二区| 国产亚洲精品久久久com| 一个人看视频在线观看www免费 | 午夜老司机福利剧场| 成人欧美大片| 国产精品av视频在线免费观看| 99在线视频只有这里精品首页| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产高清视频在线观看网站| 午夜免费激情av| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 日本黄大片高清| 亚洲av一区综合| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 我的老师免费观看完整版| 91在线精品国自产拍蜜月 | 黄色女人牲交| 亚洲人与动物交配视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日本 av在线| 久99久视频精品免费| 免费无遮挡裸体视频| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲第一电影网av| 两个人的视频大全免费| av视频在线观看入口| 日日摸夜夜添夜夜添小说| av国产免费在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 一区二区三区免费毛片| 亚洲成av人片在线播放无| 美女黄网站色视频| 欧美日韩一级在线毛片| 国产毛片a区久久久久| 国产av不卡久久| 一级黄片播放器| 麻豆成人av在线观看| 久久香蕉国产精品| 99热这里只有精品一区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 香蕉丝袜av| 少妇的丰满在线观看| 小说图片视频综合网站| 欧美性猛交黑人性爽| 国产v大片淫在线免费观看| 9191精品国产免费久久| 欧美午夜高清在线| 欧美成人性av电影在线观看| 成年免费大片在线观看| 欧美日韩精品网址| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲五月天丁香| 99久久综合精品五月天人人| 欧美不卡视频在线免费观看| 久久中文看片网| 国内精品久久久久久久电影| 日韩国内少妇激情av| 黄色女人牲交| 99精品久久久久人妻精品| 成人永久免费在线观看视频| 热99在线观看视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久精品国产清高在天天线| 99热6这里只有精品| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲av成人av| 少妇的丰满在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 90打野战视频偷拍视频| 午夜福利成人在线免费观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美性猛交黑人性爽| 国产成人啪精品午夜网站| 日本黄大片高清| 天美传媒精品一区二区| 国产色爽女视频免费观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 男插女下体视频免费在线播放| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 99国产综合亚洲精品| 国产熟女xx| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 脱女人内裤的视频| 婷婷六月久久综合丁香| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产免费一级a男人的天堂| a在线观看视频网站| 成人国产综合亚洲| 99国产综合亚洲精品| 亚洲在线自拍视频| 国产一区在线观看成人免费| 真人一进一出gif抽搐免费| 少妇高潮的动态图| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产精品 欧美亚洲| 丁香欧美五月| 免费在线观看成人毛片| 悠悠久久av| 毛片女人毛片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产精品日韩av在线免费观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美在线黄色| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 在线a可以看的网站| а√天堂www在线а√下载| 免费人成在线观看视频色| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产单亲对白刺激| 一进一出抽搐gif免费好疼| 一本久久中文字幕| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 日本免费a在线| 看片在线看免费视频| 精品国产美女av久久久久小说| 很黄的视频免费| 老汉色∧v一级毛片| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 丰满乱子伦码专区| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产野战对白在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲精品在线美女| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久精品国产综合久久久| 色吧在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲成人中文字幕在线播放| 老司机福利观看| 一级a爱片免费观看的视频| 国产美女午夜福利| 不卡一级毛片| 男插女下体视频免费在线播放| 国产乱人伦免费视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| av专区在线播放| 五月玫瑰六月丁香| 一本精品99久久精品77| 精品国产三级普通话版| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产野战对白在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产成人aa在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 禁无遮挡网站| 在线观看66精品国产| 亚洲av熟女| 国语自产精品视频在线第100页| 岛国在线免费视频观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| av在线天堂中文字幕| 国产探花极品一区二区| 免费看美女性在线毛片视频| 日韩欧美在线乱码| 午夜福利免费观看在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 99在线人妻在线中文字幕| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 精品午夜福利视频在线观看一区| 最好的美女福利视频网| 99热6这里只有精品| 91字幕亚洲| 女警被强在线播放| 欧美一区二区精品小视频在线| 毛片女人毛片| 18+在线观看网站| 久久这里只有精品中国| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产av在哪里看| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品一区二区免费欧美| 国产高清激情床上av| 免费在线观看亚洲国产| 一级黄色大片毛片| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 中文字幕av在线有码专区| 免费高清视频大片| 国内精品久久久久精免费| 五月玫瑰六月丁香| 淫妇啪啪啪对白视频| 88av欧美| 午夜精品一区二区三区免费看| 美女黄网站色视频| 两个人看的免费小视频| 久久久成人免费电影| 国产综合懂色| 哪里可以看免费的av片| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品三级大全| 国产伦在线观看视频一区| 免费人成视频x8x8入口观看| 老司机在亚洲福利影院| 日韩欧美精品免费久久 | 亚洲久久久久久中文字幕| 免费观看人在逋| 精品国内亚洲2022精品成人| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产激情欧美一区二区| 99国产综合亚洲精品| 色老头精品视频在线观看| 国产精品 国内视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 美女cb高潮喷水在线观看|