布拉酵母菌高生物量菌株的誘變及選育

楚 杰 王子輝 劉可春 何秋霞

布拉酵母菌高生物量菌株的誘變及選育

楚 杰 王子輝 劉可春 何秋霞

布拉酵母菌是一種能防治急性、慢性及抗生素相關(guān)性腸炎的益生酵母菌。但是，作為微生態(tài)生物制劑，要想保證其生物療效作用，活菌數(shù)必須達(dá)到一定水平。本試驗(yàn)通過自然復(fù)壯和紫外誘變的方法，篩選高生長量的布拉酵母菌株。結(jié)果表明：與原始的布拉酵母菌菌種作對比，所得菌種的生物量及平板菌落數(shù)，分別提高16.6%和36.7%。

布拉酵母菌；復(fù)壯；誘變

布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii)是在印尼水果荔枝中分離得到的一種益生酵母菌,它具有耐熱性，能在37℃溫度下生長，屬于釀酒酵母的亞種[1]。曾被廣泛應(yīng)用于人類治療腹瀉的藥物中[2-3]，它對各種腸道炎癥有很好的治療作用，對小兒腹瀉及旅行者腹瀉療效尤為顯著。其生物制劑應(yīng)用于畜牧業(yè)中，可以有效降低病原菌及其毒素濃度，十分有利于動物健康快速的生長。另外，酵母細(xì)胞內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸以及多種維生素，尤其是B族維生素以及各種消化酶類[4]，是各種動物生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)，將其作為飼料添加劑使用，對動物的生長十分有益，故其在畜牧業(yè)中必將有廣闊的應(yīng)用前景。但是，作為微生態(tài)生物制劑，要想保證其生物療效作用，腸道內(nèi)活菌數(shù)必須達(dá)到一定水平[5]，因此，本試驗(yàn)通過自然復(fù)壯和紫外誘變等方法，以測定生物量含量為指標(biāo)，對布拉酵母菌株進(jìn)行了篩選及優(yōu)化，從而進(jìn)一步提高布拉酵母菌的生物量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料

布拉酵母菌（本實(shí)驗(yàn)室保藏）、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、檸檬酸三銨、磷酸二氫鉀、瓊脂粉、玉米漿等。

1.1.2 種子培養(yǎng)

以7%的葡萄糖為碳源，0.7%的磷酸氫二銨為氮源，1.0%的玉米漿為生長因子，0.2%的磷酸二氫鉀為無機(jī)鹽配制種子培養(yǎng)基，500ml三角瓶裝量100ml，無菌條件下挑取三環(huán)布拉酵母菌斜面菌種接入種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)16 h。

1.1.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基同1.1.2，將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接種于發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中,30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h。

1.1.4 生物量的測定

將1.1.3中發(fā)酵液5000 r/min離心10 min，收集菌體，用生理鹽水洗滌兩遍，稱重。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 自然復(fù)壯及篩選（復(fù)壯后優(yōu)質(zhì)菌種選取）

1.2.1.1 自然復(fù)壯

取一只原始菌株z，在無菌條件下加入10ml無菌水做成菌懸液，然后做10-5、10-6稀釋度，吸取0.1ml于裝有定量固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用刮刀涂布均勻，在30℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2d。從中挑取28個菌落形態(tài)比較大的菌落接斜面，培養(yǎng)2 d后備用并編號(z1-z28)。

1.2.1.2 復(fù)壯后菌種的初篩及復(fù)篩

分別將菌種z1-z28接種種子培養(yǎng)基，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)16h，按10%的接種量接種于發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中,每個菌種重復(fù)3瓶，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18h。按1.1.4方法測定生物量。

從上述試驗(yàn)中選取7株生物量相對較多的菌種做復(fù)篩。根據(jù)所得結(jié)果，從上述7支菌種中選取1株最好的菌種做紫外誘變試驗(yàn)。

1.2.2 紫外誘變及誘變后優(yōu)質(zhì)菌種的選取

1.2.2.1 紫外誘變

取自然篩選中已選定的試管斜面種子z20，在無菌條件下加入10m l無菌水做成菌懸液，然后做10-5稀釋度，吸取0.1ml于裝有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用刮刀涂布均勻，將涂布好的平板分成7組，每組6個，在超凈工作臺的紫外燈下分別照射10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s，剩余的 6 個平板作對照。照射完畢，用黑色的不透光紙包好，放入30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d，取出觀察菌落生長情況并計(jì)數(shù)。

從中選取49個菌落形態(tài)較大的菌落接斜面，培養(yǎng)2d后備用，編號：z20－1 到 z20－49。

1.2.2.2 誘變后菌種初篩及復(fù)篩

分別將菌種z20－1到z20－49接種種子培養(yǎng)基，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)16 h，按10%的接種量接種于發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中,30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h。按1.1.4方法測定生物量。

從上述49株菌種中選取5株生物量提高相對較多的菌種做復(fù)篩。復(fù)篩時(shí)每株菌做3個重復(fù)。

1.2.3 誘變菌株與原始菌種的對比試驗(yàn)

將誘變菌株與原始菌種同時(shí)上搖床，按1.1.4測定生物量。并進(jìn)行比較。

1.2.4 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將誘變菌株每隔一個月傳代一次，再同時(shí)與原始菌株同時(shí)上搖床，連續(xù)傳代6次，觀察其遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 布拉酵母菌菌種自然復(fù)壯

2.1.1 自然復(fù)壯后菌種的初篩(見表1)

表1 自然復(fù)壯菌種初篩結(jié)果

從表 1 可以看出，28 株菌種中,z2、z7、z9、z12、z15、z16、z207株菌種的生物量及菌落數(shù)與其它菌種相比相對較高，故選取這7只菌做復(fù)篩。

2.1.2 自然篩選后菌種的復(fù)篩(見表2)

表2 自然復(fù)壯菌種復(fù)篩結(jié)果

由表2可知，z20不僅生物量高，而且菌落數(shù)含量相對較高，故選取z20作為紫外誘變的菌種。

2.2 紫外誘變及誘變后菌種的篩選

2.2.1 紫外誘變(見表3)

從表3可以看出，隨著誘變時(shí)間的增加，致死率也隨之上升。當(dāng)誘變時(shí)間為60 s時(shí)，致死率達(dá)到72%。因此，我們從表3中的平板選取較大的菌落接斜面，共 49 株，編號為 z20－1 到 z20－49。

表3 紫外誘變結(jié)果

2.2.2 紫外誘變后菌種的初篩(見表4)

表4 紫外誘變后菌種初篩結(jié)果

從表 4 中可以看出，z20-2、z20-22、z20-26、z20-31、z20-41菌與其余菌種相比，生物量和菌落數(shù)含量相對較高，故選取這5株菌種做復(fù)篩。

2.2.3 紫外誘變后菌種的復(fù)篩(見表5)

表5 紫外誘變后菌種復(fù)篩結(jié)果

從表5中可以很明顯地看出，菌種z20-41生物量及每毫升菌落數(shù)明顯高于其它菌種，故選取z20-41作為試驗(yàn)的目的菌種。

2.3 與原始菌種的對比試驗(yàn)(見表6)

表6 優(yōu)化菌種與原始菌種對比試驗(yàn)

從表6中可以看出，誘變菌株z20-41不論是生物量還是菌落數(shù)含量均明顯高于出發(fā)株。

2.4 誘變菌種的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)(見表7)

表7 誘變株的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

從表7中可以看出，經(jīng)半年連續(xù)傳代6次，誘變菌株的生物量比原始菌株高，平均提高16.6%。菌落平板計(jì)數(shù)提高36.7%，因此，該菌株具有遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過自然復(fù)壯和紫外誘變的方法，對布拉酵母菌高生物量菌株進(jìn)行篩選，結(jié)果表明：所得菌種的生物量及菌落數(shù)含量與原始的布拉酵母菌菌種作對比，數(shù)值明顯提高，經(jīng)6個月傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)，該菌種具有遺傳穩(wěn)定性，且生物量與菌落數(shù)含量平均比原始菌株提高16.6%和36.7%。

布拉酵母菌是一種真菌，其生物學(xué)特性與細(xì)菌完全不同。常規(guī)微生態(tài)制劑易受抗生素、胃酸、膽汁的影響，應(yīng)用受到限制，而布拉酵母不會被胃酸、膽酸、抗生素等所破壞，因此應(yīng)用較廣泛。

[1]Dorota C,Patrick R.Experimental effects of S.boulardii on diarheal pathogens[J].Microbes Infect.,2002,4(8)：733-739.

[2]胡祥英.布拉酵母菌治療小兒輪狀病毒腸炎53例臨床研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2002，14(6)：352-354.

[3]Kirchhelle A,Fruhwein N,Toburen D.Treatment of persistent diarrhea with S.boulardii in returning travelers.Results of a prospective study[J].Fortschr Med.,1996,114(11)：136-140.

[4]朱宏娟,田科雄,李玲，等.酵母在飼料工業(yè)中的新應(yīng)用[J].飼料工業(yè)，2005，26(12)：4-7.

[5]劉吉成,王惠艷,劉伯陽.雙歧桿菌模擬胃腸環(huán)境中抗性的研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2003,15(3)：147-149.

（編輯：劉 占，laram ie_liu@yahoo.com）

Mutagenesis and screening of saccharomyces boulardii containing high biomass strains

Chu Jie,Wang Zihui,Liu Kechun,He Qiuxia

Saccharomyces boulardii is a nonpathogenic yeast,which could exert therapeutic properties in acute and chronic enteritis,antibiotic-associated diarrhoea.Abundant data have suggested that amount of viable organism agent of saccharomyces boulardii plays an important role in the initiation and development of the intestinal disease.The aim of the study is to acquire the resistive strains of Saccharomyces boulardii by rejuvenation and UV mutagenesis,which contain high trehalose and biomass.The presentwork indicates that compared with the biomass and the content of trehalose before optimization，biomass is improved approximately at 16.6%,and the content of trehalose is improved approximately at 36.7%.

saccharomyces boulardii；rejuvenation；mutagenesis

S858.291

A

1001-991X（2011）16-0052-04

楚杰，山東省科學(xué)院生物研究所，研究員，250014，濟(jì)南市經(jīng)十路科院路。

王子輝、劉可春、何秋霞，單位及通訊地址同第一作者。

2011-06-13

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目[ZR2010CM054]