四種植物蛋白源及其不同添加水平對異育銀鯽腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

王永玲 王文娟 宋 霖 蔡春芳 葉元土 孔 麗

魚粉是一種理想的動物蛋白源，是水產(chǎn)動物最重要的飼料原料。然而全球魚粉資源正日漸衰退，大量使用魚粉對環(huán)境的負(fù)面影響也較大（Cowey等，1991），因此應(yīng)該限制魚粉用量，尋找水產(chǎn)飼料中魚粉的適宜替代品。

植物蛋白源資源豐富，用植物蛋白源替代魚粉的研究報道也很多。許多研究表明，豆粕替代魚粉后會引起魚類腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，使魚易患類似非感染性腸炎。而關(guān)于鯉魚（Uran等,2008）、鯽魚（張偉等，2010）的研究表明，這種腸道形態(tài)的變化在攝食3周后會消失。腸道是直接接觸飼料并且敏感的器官，因此，其形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能變化可用于評判飼料優(yōu)劣。本研究以異育銀鯽腸道為靶器官，研究豆粕、花生粕、菜籽粕、棉籽粕四種植物蛋白源及其不同比例替代魚粉飼養(yǎng)不同時間后腸道形態(tài)的變化，以評價四種植物性飼料蛋白源對異育銀鯽的適用性，為實(shí)用配方設(shè)計提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

參照異育銀鯽實(shí)用飼料配方，以白魚粉為主要蛋白源，魚油和豆油為主要脂肪源配制基礎(chǔ)飼料（FM）作為對照組。選用豆粕（SBM）、花生粕（PM）、菜籽粕（RM）、棉籽粕（CM）四種植物蛋白源分別替代25%和50%的魚粉，配制成8種試驗(yàn)飼料。飼料配方及營養(yǎng)成分見表1。

1.2 試驗(yàn)魚及分組

表1 試驗(yàn)日糧配方及營養(yǎng)成分

異育銀鯽購自江蘇溧陽，為當(dāng)年池塘養(yǎng)殖魚種。經(jīng)一周馴養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境后，選取大小均勻、體格健壯，約25 g的魚種，隨機(jī)分配到27個70 cm×80 cm×100 cm的玻璃鋼水族箱中，每箱20尾。各試驗(yàn)組按完全隨機(jī)化配置法分布以避免位置的差異造成的試驗(yàn)誤差。

1.3 飼養(yǎng)管理

每種飼料投喂3箱鯽魚，每天投喂量視魚的攝食情況而定，適量投喂，投喂時間分別為8：30、12：30、17：00。詳細(xì)記錄每天的攝食量。所有水族箱在同一半開放式循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，自然光周期，以充分曝氣的自來水為水源，每天換水量為總水量的1/3。養(yǎng)殖水經(jīng)過濾、沉淀后流回蓄水池，經(jīng)過增氧、控溫后由水泵抽回各水族箱。養(yǎng)殖期間水質(zhì)條件為：水溫(25±2)℃，DO＞6.0 mg/l，pH 值 7.5±0.2，NH3-N 濃度為(0.25±0.05)mg/l，NO2-N 濃度為(0.04±0.01)mg/l，硫化物＜0.05 mg/l，各項(xiàng)指標(biāo)均符合養(yǎng)殖水體要求。飼養(yǎng)期自2010年8月25日至2010年10月24日，共進(jìn)行8周。

1.4 采樣與分析方法

分別于2周、3周、5周、8周末從各水族箱隨機(jī)取試驗(yàn)魚3尾，使用MS-222將魚麻醉。取出內(nèi)臟，分離出腸道，剔除表面脂肪組織，分別取前腸和后腸組織在生理鹽水中洗滌，除去其上所帶有的血液、糞便等雜質(zhì)，放入波恩氏液中固定。制樣時將其取出，分別經(jīng)濃度為70%、80%、90%、95%和100%的乙醇梯度脫水，并置于二甲苯中透明，最后包埋于低熔點(diǎn)石蠟中。使用KD-2508型切片機(jī)橫向連續(xù)切片，厚度為6 μm，而后展片于清潔的載玻片上，采用H.E染色，中性樹膠封片。光鏡觀察皺襞（F）高度、黏膜（S）下層和肌層（M）厚度，以及柱狀上皮細(xì)胞內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，所有統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0軟件，數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后用Duncan's法多重比較，顯著水平為0.05。

2 試驗(yàn)結(jié)果(見圖1及表2～表5)

圖1 黏膜下層富含淋巴細(xì)胞的區(qū)域?yàn)榱馨图?xì)胞層

表2 試驗(yàn)飼料投喂2周后異育銀鯽前腸、后腸組織形態(tài)（μm）

表3 試驗(yàn)飼料投喂3周后異育銀鯽前腸、后腸組織形態(tài)（μm）

表4 試驗(yàn)飼料投喂5周后異育銀鯽前腸、后腸組織形態(tài)（μm）

表5 試驗(yàn)飼料投喂8周后異育銀鯽前腸、后腸組織形態(tài)（μm）

光鏡分析可見，異育銀鯽腸道皺襞由前向后逐漸縮短，肌層由前向后逐漸變薄；黏膜下層富含淋巴細(xì)胞的區(qū)域?yàn)榱馨图?xì)胞層（見圖1）。2周和3周時，肌層厚度各組間前、后腸均無顯著差異（表 3）；5周時，SBM50組、RM 組前、后腸肌層厚度均顯著低于FM組(P＜0.05)；8周時，SBM50組、RM組、CM50組前、后腸肌層厚度均顯著低于FM、SBM25和PM25 組(P＜0.05)。

2周和3周時，皺襞高度各組間前、后腸均無顯著差異(P＞0.05)；5周時，CM50組前腸顯著低于FM組(P＜0.05)，后腸各組差異均不顯著(P＞0.05)；8 周時，各組間前腸、后腸差異均不顯著。

黏膜下層厚度各組間無顯著差異。

5周時，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤度SBM50前腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞大大高于FM組，RM組和CM50組后腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞也有增多，8周時，RM25、RM50和CM50組后腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞量高于FM組。

3 討論

魚類腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，黏膜皺襞的高低和疏密、上皮細(xì)胞的高低、紋狀緣的發(fā)達(dá)程度以及杯狀細(xì)胞數(shù)量的多少等與消化吸收能力密切相關(guān)（婁允東，2000）。Burrells等（1999）研究表明，豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子可導(dǎo)致大西洋鮭和虹鱒腸黏膜發(fā)生病理變化和非特異性免疫能力下降。Pongmaneerat等（1992）研究表明，飼料中豆類產(chǎn)品添加量超過50%即可導(dǎo)致虹鱒腸黏膜損傷加大、液泡種類和數(shù)量上升、亞黏膜炎癥反應(yīng)的增加。Refstie S等(2001)、Ksudhik等(2004)分別在虹鱒、歐洲真鱸的飼料中添加一定量的大豆蛋白，發(fā)現(xiàn)后腸絨毛上皮結(jié)構(gòu)發(fā)生形態(tài)變化，黏膜褶縮短、黏膜固有層加深加寬。但有關(guān)菜粕、棉粕、花生粕對腸道影響的研究較少。本試驗(yàn)中，異育銀鯽日糧中添加植物蛋白源后，隨著飼養(yǎng)周期的延長，各種植物蛋白源均在一定程度上對異育銀鯽的腸道結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，特別是高含量組。其中，尤以棉籽粕和菜籽粕造成的影響較大，豆粕和花生粕次之。結(jié)果提示我們，各種植物蛋白源在鯽魚飼料中適宜添加量的研究除了要考評生長效果外，還應(yīng)考察其生理影響。有些植物蛋白源即使對生長沒產(chǎn)生顯著影響，也可能使魚類處于亞健康狀態(tài)，最終影響?zhàn)B殖效果。本試驗(yàn)結(jié)果表明，豆粕和花生粕是鯽魚較好的植物蛋白源，棉籽粕和菜籽粕次之。異育銀鯽日糧中，菜籽粕在配方中的比例不宜超過25%。豆粕、棉粕和花生粕作為單一植物蛋白源添加時，在配方中的比例不宜占到50%。

Uran等（2008）報道，當(dāng)飼料中20%的蛋白質(zhì)由動物蛋白變?yōu)槎蛊蓵r，鯉魚攝食1周后即表現(xiàn)出腸炎癥狀，而在3周時癥狀比較嚴(yán)重，表現(xiàn)出了皺襞縮短、上皮細(xì)胞核上空泡消失、杯狀細(xì)胞數(shù)量增加、固有層變寬、黏膜下層嗜堿性粒細(xì)胞增加、下皮細(xì)胞吞噬能力下降等癥狀。但在第4～5周時就觀察到自行恢復(fù)現(xiàn)象。張偉等（2010）也觀察到鯽魚攝食含30%豆粕的飼料后3周出現(xiàn)明顯的腸道形態(tài)變化，但8周時癥狀消失。本試驗(yàn)中未在3周時觀察到鯽魚腸道形態(tài)學(xué)變化，但在5周后觀察到不同處理間有顯著差異。植物蛋白源對腸道形態(tài)影響的作用規(guī)律和機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1]樓允東.組織胚胎學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2000:101-104.

[2]Burrells C,Williams P D,Southgate P J,et al.Immunological,physiological and pathological responses of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)to increasing dietary concentrations of soybean proteins[J].Vet.Immunol.Immunopathol.,1999,72:277-288.

[3]Cowey,Cho.Nutrtional strategies and aquaculture waste[M].Waste Univ.Gelph.,1991:21-36.

[4]Kaushik S J,Coves D,Dutto G,et al.Almost total replacement of fish meal by plant protein sources in the diet of a marine teleost,the European seabass,Dicentrarchus labrax[J].Aquaculture,2004,230:391-404.

[5]Pongmaneerat J,Watanabe T.Utilization of soybean meal as protein source in diets for rainbow trout[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1992,58:1983-1990.

[6]Refstie S,Storebakken T,Baeverfjord G,et al.Longterm protein and lipid growth of Atlantic salmon(Salmo salar)fed diets with partial replacement of fish meal by soy protein products at medium or high lipid level[J].Aquaculture,2001,193:91-106.

[7]Urán P A,Gon?alves A A,Taverne-Thiele J J,et al.Soybean meal induces intestinal inflammation in common carp (Cyprinus carpio L.)[J].Fish and Shellfish Immunology,2008,25:751-760.

[8]Zhang W,Wang W J,Cai C F,et al.Effect of soybean on growth and intestinal morphology of Allogynogenetic crucian carp(Carassius auratus gibelio♀ ×Cyprinus carpio♂)[J].Journal of Fishery Sciences of China,2010,17:1-7.