條斑紫菜提取物對(duì)大鼠高血壓的改善作用

任姍姍，李鵬高,*，唐玉平，張淑華，肖忠新，吳惠惠，魏守剛

(1.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與家庭醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院，北京 101300)

條斑紫菜提取物對(duì)大鼠高血壓的改善作用

任姍姍1，李鵬高1,*，唐玉平2，張淑華1，肖忠新1，吳惠惠1，魏守剛1

(1.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與家庭醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院，北京 101300)

為研究條斑紫菜(Porphyra yezoensis)的抗高血壓作用，用不同方式制備其提取物后灌胃給予自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)和血壓正常的Wistar大鼠，監(jiān)測(cè)頸總動(dòng)脈血壓變化情況。結(jié)果顯示：條斑紫菜水提物和醇提物均無(wú)顯著降壓作用，而其胃蛋白酶酶解物、中性蛋白酶酶解物均具有一定程度的降壓作用，且對(duì)心率及血壓正常的Wistar大鼠血壓無(wú)不良影響。與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑卡托普利相比，降壓作用的大小順序?yàn)榭ㄍ衅绽局行缘鞍酌该附馕铮疚傅鞍酌该附馕?。表明條斑紫菜蛋白經(jīng)中性蛋白酶和胃蛋白酶酶解后產(chǎn)生的活性肽具有高血壓改善作用。

條斑紫菜；提取物；頸總動(dòng)脈；高血壓

根據(jù)中國(guó)居民第四次營(yíng)養(yǎng)調(diào)查結(jié)果，我國(guó)高血壓患者已超過(guò)1.6億人，但其人群知曉率和控制率均較低，已成為一種嚴(yán)重影響我國(guó)居民身體素質(zhì)和生活質(zhì)量的慢性病，造成沉重的社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。研究表明，飲食因素在高血壓的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，通過(guò)合理膳食可有效預(yù)防和控制高血壓[2]。此外，天然食物中含有的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑等抗高血壓物質(zhì)也可起到平穩(wěn)降血壓的作用[3-4]。因此，研究開(kāi)發(fā)此類(lèi)食品具有廣闊的應(yīng)用前景，也符合社會(huì)發(fā)展趨勢(shì)。

條斑紫菜(Porphyra yezoensis)屬紅藻門(mén)、原紅藻綱、紅毛菜科、紫菜屬(Porphyra)，蛋白質(zhì)含量高達(dá)39.4%～50.4%(干基)[5]。研究表明，其酶解多肽(peptides from Porphyra yezoensis，PPY)具有ACE抑制劑活性，可顯著降低自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的尾動(dòng)脈壓[3]；此外，膳食補(bǔ)充條斑紫菜也能顯著降低高血壓患者的血壓并改善血管舒張功能[6]。

因此，本實(shí)驗(yàn)以自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)頸動(dòng)脈插管血壓監(jiān)測(cè)術(shù)觀察各種條斑紫菜提取物的降壓作用，為開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮、干燥的條斑紫菜由寧波市鄞州繁達(dá)保健食品廠提供。

雄性SHR及雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(300±50)g，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(SCXK(京)2006-0009)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)可。

卡托普利 福建古田藥業(yè)有限公司；烏拉坦 齊魯制藥有限公司；AS.1398中性蛋白酶 江蘇無(wú)錫酶制劑公司；戊巴比妥鈉和胃蛋白酶(pepsin) 美國(guó)Sigma公司。

BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)及TM_WAVE 1.0分析軟件 成都泰盟科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；索式提取器 上海第三儀器廠；DC10電熱恒溫水槽、BP3105電子天平 德國(guó)Thermo Haake公司；E250酸度計(jì) 美國(guó)Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 條斑紫菜各種提取物的制備

水提物的制備：以去離子水為溶劑，料水比為1:20(m/V)，100℃煮1h，提取3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮、冷凍干燥備用。

醇提物的制備：以無(wú)水乙醇為溶劑，料液比為1:25 (m/V)，用索式提取器室溫下回流提取醇溶性成分7h，濃縮、凍干備用。

條斑紫菜蛋白質(zhì)提?。簠⒄瘴墨I(xiàn)[3,7]方法，將新鮮采集的條斑紫菜真空冷凍干燥、粉碎、取20g加入1L磷酸緩沖液(pH6.8)中，室溫溶脹1h后在冰浴中超聲10min，5000r/min離心20min，取上清液在0℃緩慢加入(NH4)2SO4使成60%飽和度，攪拌、靜置8h后10000r/min離心10min得到粗蛋白，稱(chēng)質(zhì)量后復(fù)溶在20mL磷酸緩沖液中透析除鹽，得粗蛋白溶液。

胃蛋白酶解物制備方法為：將20mL粗蛋白溶液調(diào)至pH2，加胃蛋白酶在37℃條件下水解20h，100℃煮10min終止反應(yīng)，調(diào)至pH7.0，凍干，稱(chēng)質(zhì)量備用。

中性蛋白酶解物制備：取20mL粗蛋白溶液，調(diào)至pH7.5，加入中性蛋白酶40℃條件下反應(yīng)20h，100℃、10min終止反應(yīng)，凍干、稱(chēng)質(zhì)量備用。

提取物得率/%=(m1/m2)×100

式中：m1為提取物質(zhì)量/g；m2為提取所用條斑紫菜質(zhì)量/g。

1.2.2 頸動(dòng)脈血壓監(jiān)測(cè)

大鼠禁食12h后，腹腔注射戊巴比妥鈉(20mg/kg)和烏拉坦(500mg/kg)麻醉[8]，固定于手術(shù)板上，頸部正中開(kāi)口，插入氣管插管以保持呼吸通暢。行一側(cè)頸總動(dòng)脈插管并與壓力換能器相連，經(jīng)放大器測(cè)量頸動(dòng)脈血壓。連接標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)記錄心電圖，以BL420F型生物信號(hào)采集與處理系統(tǒng)每5min取一次值，記錄血壓和心率的變化。待指標(biāo)穩(wěn)定后經(jīng)食管插管給予各種提取物，動(dòng)物分組及灌胃劑量如下：1)對(duì)照組：5mL去離子水；2)卡托普利組：50mg/kg；3)水提物組：2500mg/kg；4)醇提物組：2500mg/kg；5)中性蛋白酶酶解物組：500mg/kg；6)胃蛋白酶酶解物組：500mg/kg；每組10只，各組基線收縮壓(SBP)無(wú)顯著性差異。灌胃后連續(xù)監(jiān)測(cè)120min，以血壓的變化值(Δ)反映提取物的降壓作用。對(duì)于有降壓作用的提取物，進(jìn)一步以血壓正常的Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象觀察其對(duì)正常血壓的影響。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組均數(shù)間差異比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間差異比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 條斑紫菜各種提取物的得率

各種提取物的得率如表1所示。

表1 條斑紫菜各種提取物的得率(n=3)Table 1 The yields of various extracts from purple laver (n=3)

2.2 麻醉對(duì)SHR大鼠血壓的影響

SHR大鼠是研究原發(fā)性高血壓的良好動(dòng)物模型，也是用得最多的高血壓模型動(dòng)物[9]。表2顯示，本實(shí)驗(yàn)所用SHR基線血壓(SBP/DBP)水平在200/140mmHg左右，與人類(lèi)高血壓水平相近。麻醉后SHR血壓出現(xiàn)明顯下降，但仍保持高水平，與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致；約30min后降至170/130mmHg左右，并可保持穩(wěn)定約120min，因此本實(shí)驗(yàn)從麻醉后30min開(kāi)始灌胃給予各種提取物，并連續(xù)監(jiān)測(cè)120min血壓的變化情況。

表2 SHR大鼠基線血壓和心率(n=10)Table 2 Basal blood pressure and heart rate of SHR (n=10)

2.3 條斑紫菜提取物對(duì)SHR大鼠頸動(dòng)脈SBP的影響

血壓形成取決于心臟收縮、大血管彈性、血液本身、血液的黏稠度及外周阻力等因素。心臟收縮形成SBP，大動(dòng)脈回縮形成DBP。根據(jù)世界衛(wèi)生組織規(guī)定，成人SBP≥140mmHg或(和)DBP≥90mmHg時(shí)即可確診為高血壓。在臨床中，SBP增高最常見(jiàn)，往往與年齡增長(zhǎng)相關(guān)，也更難控制，SBP高說(shuō)明大動(dòng)脈彈性低，動(dòng)脈已經(jīng)硬化，往往比SBP和DBP都高的患者還要嚴(yán)重[10]。

圖1 條斑紫菜各種提取物對(duì)SHR大鼠頸動(dòng)脈收縮壓(SBP)的影響Fig.1 Effects of various extracts from purple laver on carotid artery SBP in SHR

圖1顯示了給予條斑紫菜各種提取物后各組SHR大鼠頸動(dòng)脈SBP變化值(ΔSBP)。其中，去離子水、水提物和醇提物組的ΔSBP圍繞著0上下波動(dòng)，既均未表現(xiàn)出明顯的降壓作用；在灌胃30min后，只有卡托普利、中性蛋白酶酶解物和胃蛋白酶酶解物組的ΔSBP一致性地呈現(xiàn)為負(fù)值，表明SBP下降，且降壓作用逐漸明顯。降壓作用的大小順序?yàn)榭ㄍ衅绽局行缘鞍酌该附馕铮疚傅鞍酌该附馕铩?05min時(shí)卡托普利組SBP基本降低到正常水平，中性蛋白酶酶解物和胃蛋白酶酶解物組的降壓幅度分別為(30.07±8.53)mmHg和(14.45±5.11)mmHg，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(P＜0.05)。

卡托普利是臨床應(yīng)用時(shí)間最長(zhǎng)的一種ACE抑制劑，適用于各種類(lèi)型的高血壓，但其長(zhǎng)期應(yīng)用副作用較多，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、胃腸道、血液系統(tǒng)、腎臟、皮膚等均有一定的損害。因此，開(kāi)發(fā)具有ACE抑制活性的天然食物具有重要意義。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)能從許多食物中分離出ACE抑制肽[11]，條斑紫菜就是其中一種[3]，其降壓作用雖沒(méi)有卡托普利強(qiáng)，但作為一種營(yíng)養(yǎng)豐富的食品，具有許多卡托普利不可比擬的優(yōu)勢(shì)。

2.4 條斑紫菜各種提取物對(duì)SHR大鼠頸動(dòng)脈舒張壓(DBP)的影響

臨床上還有一些患者SBP不高但是DBP比較高，在年輕人甚至兒童中更常見(jiàn)[12]。DBP升高往往與緊張、交感神經(jīng)活性增高、外周血管阻力增高有關(guān)[13]。

圖2 條斑紫菜各種提取物對(duì)SHR大鼠頸動(dòng)脈舒張壓(DBP)的影響Fig.2 Effects of various extracts from purple laver on carotid artery DBP in SHR

圖2顯示，條斑紫菜各種提取物對(duì)SHR大鼠DBP的影響與SBP類(lèi)似，去離子水、水提物和醇提物組ΔDBP圍繞著0波動(dòng)，未顯示明顯的降低DBP作用；只有中性蛋白酶酶解物和胃蛋白酶酶解物顯示出一致的降壓作用，降壓作用的大小順序?yàn)榭ㄍ衅绽局行缘鞍酌该附馕铮疚傅鞍酌该附馕?。但其?duì)DBP的作用沒(méi)有對(duì)SBP的作用強(qiáng)，顯示為DBP的下降幅度較小，表明這兩種酶解物降低SBP的作用更明顯。

2.5 條斑紫菜各種提取物對(duì)SHR大鼠心率的影響

在實(shí)驗(yàn)觀察期間，各種提取物對(duì)SHR大鼠的心率均無(wú)顯著影響。

2.6 條斑紫菜蛋白酶酶解物對(duì)正常血壓的影響

為進(jìn)一步觀察條斑紫菜中性蛋白酶酶解物和胃蛋白酶酶解物對(duì)正常血壓的影響，以血壓正常的Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，同樣采用頸動(dòng)脈血壓監(jiān)測(cè)術(shù)觀察了灌胃給予相同劑量的中性蛋白酶酶解物和胃蛋白酶酶解物后Wistar大鼠頸動(dòng)脈壓的變化情況。Wistar大鼠基線血壓值為(112.47±9.65)mmHg /(79.54± 6.38)mmHg，麻醉后血壓略有波動(dòng)，但很快恢復(fù)到正常水平。給予中性蛋白酶酶解物和胃蛋白酶酶解物后，血壓仍然圍繞著基線水平波動(dòng)(圖3)，無(wú)明顯下降(P＞0.05)，表明這兩種酶解物對(duì)血壓正常的動(dòng)物無(wú)不良影響，不會(huì)使正常血壓降低，因此是比較安全的。

圖3 條斑紫菜蛋白酶酶解物對(duì)Wistar大鼠頸動(dòng)脈血壓的影響Fig.3 Effects of neutral protease and pepsin hydrlysates from purple laver on carotid artery BP in Wistar rats

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水煮提取和乙醇回流提取的條斑紫菜提取物無(wú)顯著降低SHR大鼠頸動(dòng)脈壓的作用，而將條斑紫菜蛋白質(zhì)經(jīng)中性蛋白酶和胃蛋白酶酶解后得到的酶解物均能降低SHR大鼠頸動(dòng)脈的SBP和DBP，具有明顯的降高血壓功效，尤其對(duì)SBP的降壓效果更明顯，降壓作用的大小順序?yàn)橹行缘鞍酌该附馕铮疚傅鞍酌该附馕?。而且，兩種酶解物對(duì)心率及血壓正常的Wistar大鼠的血壓無(wú)不良影響，因此食用比較安全，具有研究開(kāi)發(fā)價(jià)值。

[1] 佚名. 中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng), 2004(11): 8-11.

[2] O'SHAUGHNESSY K M. Role of diet in hypertension management[J]. Curr Hypertens Rep, 2006, 8(4): 292-297.

[3] SUETSUNA K. Purification and identification of angiotensin Ⅰ-converting enzyme inhibitors from the red alga Porphyra yezoensis[J]. J Mar Biotechnol, 1998, 6(3): 163-167.

[4] de LEO F, PANARESE S, GALLERANI R, et al. Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides: production and implementation of functional food[J]. Curr Pharm Des, 2009, 15(31): 3622-3643.

[5] 徐家達(dá), 戴衛(wèi)平. 紫菜的營(yíng)養(yǎng)與保健[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2009: 52.

[6] 唐玉平, 李鵬高, 邢曉然, 等. 膳食補(bǔ)充條斑紫菜對(duì)高血壓患者血管內(nèi)皮功能的影響[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2008(4): 475-478.

[7] 何榮海, 馬海樂(lè), 周存山, 等. 超聲波在酶法生產(chǎn)紫菜降血壓肽過(guò)程中的應(yīng)用[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2007(1): 4-7.

[8] SIMPSON L L. The effect of prostaglandin E2 on the arterial blood pressure of normotensive and spontaneously hypertensive rats[J]. Br J Pharmacol, 1974, 51(4): 559-564.

[9] PINTO Y M, PAUL M, GANTEN D. Lessons from rat models of hypertension: from Goldblatt to genetic engineering[J]. Cardiovasc Res, 1998, 39(1): 77-88.

[10] PALANIAPPAN L, SIMONS L A, SIMONS J, et al. Comparison of usefulness of systolic, diastolic, and mean blood pressure and pulse pressure as predictors of cardiovascular death in patients >/=60 years of age (The Dubbo Study)[J]. Am J Cardiol, 2002, 90(12): 1398-1401.

[11] 辛志宏, 馬海樂(lè), 吳守一. 食品蛋白質(zhì)中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的研究[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2003, 24(4): 17-21.

[12] BURKE G L, FREEDMAN D S, WEBBER L S, et al. Persistence of high diastolic blood pressure in thin children. the bogalusa heart study [J]. Hypertension, 1986, 8(1): 24-29.

[13] WEST S G, BROWNLEY K A, LIGHT K C. Postexercise vasodilatation reduces diastolic blood pressure responses to stress[J]. Ann Behav Med, 1998, 20(2): 77-83.

Anti-hypertensive Effect of Extract from Purple Laver (Porphyra yezoensis) in Rat

REN Shan-shan1，LI Peng-gao1,*， TANG Yu-ping2，ZHANG Shu-hua1，XIAO Zhong-xin1，WU Hui-hui1，WEI Shou-gang1
(1. School of Public Health and Family Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China；2. Yanjing Medical College, Capital Medical University, Beijing 101300, China)

In order to investigate the anti-hypertensive effects of various extracts from purple laver (Porphyra yezoensis), spontaneously hypertensive rats (SHR) administered with extracts from purple laver by intragastric infusion and the change in blood pressure (BP) of the rats was monitored by carotid artery catherization. The results showed that water and ethanol extracts from purple laver had no effect on BP in SHR, but neutral protease and pepsin hydrlysates of purple laver had a significant BP-lowering effect. No adverse effect on heart rate and BP in normotensive Wistar-Kyoto rats was observed. The decreasing sequence of BP-lowering effect of the neutral protease and pepsin hydrlysates and captopril was found as follows: captopril ＞ neutral protease hydrolysate ＞ pepsin hydrolysate. Based on this study, it could be concluded that peptides derived from neutral protease or pepsin hydrolysis of purple laver protein have an anti-hypertensive effect in SHR.

Porphyra yezoensis；extract；common carotid artery；hypertension

R151.1；TS255.1

A

1002-6630(2011)07-0296-04

2010-08-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30800912)

任姍姍(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。E-mail：renshanshan06@163.com

*通信作者：李鵬高(1974—)，男，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。E-mail：penggao@ccmu.edu.cn