地衣芽孢桿菌產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵條件的優(yōu)化

陸 娟，肖 敏*，盧麗麗

(1.山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家糖工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100；2.阜陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236041)

地衣芽孢桿菌產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵條件的優(yōu)化

陸 娟1,2，肖 敏1,*，盧麗麗1

(1.山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家糖工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100；2.阜陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236041)

通過(guò)單因素試驗(yàn)(培養(yǎng)基用水、碳源、氮源、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基初始pH值)和正交試驗(yàn)對(duì)地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)8-37-0-1發(fā)酵產(chǎn)生Levan果聚糖的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。結(jié)果表明：以蔗糖100g/L、牛肉膏1.0g/L、酵母粉0.6g/L、K2HPO4 3.0g/L、KH2PO4 3.0g/L、NaCl 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、FeSO4·7H2O 0.001g/L，自來(lái)水配制，培養(yǎng)基初始pH5.0，30℃培養(yǎng)8-37-0-1菌株24h，Levan果聚糖產(chǎn)量達(dá)到最高值41.7g/L，約是未優(yōu)化時(shí)的5.0倍。

Bacillus licheniformis8-37-0-1；Levan；發(fā)酵條件；優(yōu)化

Levan果聚糖是一類(lèi)分子中含有大量β-(2,6)糖苷鍵和少量β-(2,1)果糖苷鍵的多糖，與分子中主要含有β-(2,1)果糖苷鍵的菊粉類(lèi)果聚糖顯著不同[1]。Levan果聚糖的分子質(zhì)量通常在幾萬(wàn)到一兩百萬(wàn)之間，在食品工業(yè)方面，它可作為功能性食品的重要組成部分[2]、低聚果糖生產(chǎn)的原材料以及乳化劑和成膜劑等[3]。在醫(yī)藥方面，Levan果聚糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)控、抗感染等作用，還可以作為血漿的替代品[3-5]。除此以外，由于具有與透明質(zhì)酸一樣的保濕效果及對(duì)人體纖維原細(xì)胞和角化細(xì)胞相似的增殖作用，Levan果聚糖還可作為化妝品添加劑使用[6]。Levan果聚糖廣泛的應(yīng)用潛力使其生產(chǎn)得到了人們的關(guān)注。

L e v a n果聚糖可來(lái)源于植物或微生物，小麥(Triticum aestivum)[7]、黑麥草(ryegrass)和鴨茅(cocksfoot)[8]等植物可以產(chǎn)生低分子質(zhì)量的Levan果聚糖，高分子質(zhì)量的Levan果聚糖主要由微生物發(fā)酵產(chǎn)生。Levan果聚糖的產(chǎn)生菌多為細(xì)菌，早在1902年，Smith從桃金娘科的植物屬(Eucalyptus stuartina)的含糖分泌物中就發(fā)現(xiàn)了可以產(chǎn)Levan果聚糖的微生物，隨后發(fā)現(xiàn)木醋桿菌(Acetobacter xylinum)[9]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[10]、產(chǎn)果聚糖微桿菌(Microbacterium laevaniformans)[11]、多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)[12]、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)[3,13-14]、舊金山乳桿菌(Lactobacillus sanfranciscensis)[15-16]和腸膜狀明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)[4,17-18]等細(xì)菌都可以產(chǎn)生Levan果聚糖，其產(chǎn)量約在14.4～36g/L之間。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)利用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)發(fā)酵產(chǎn)生Levan多糖的報(bào)道。本研究對(duì)地衣芽孢桿菌8-37-0-1產(chǎn)生Levan果聚糖的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期能大幅度提高該菌株Levan果聚糖的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種

地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)8-37-0-1為本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得，前期工作中已鑒定該菌產(chǎn)生的多糖為L(zhǎng)evan 果聚糖[19]。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏1.0、(NH4)2SO40.5、K2HPO42.5、KH2PO42.5、NaCl 1.0、蔗糖30、MgSO4·7H2O 0.2、FeSO4·7H2O 0.001，水 1000mL，pH7.0。115℃滅菌 30min。

菌種經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基180r/min、30℃搖床培養(yǎng)16h活化后，按體積分?jǐn)?shù)4%的接種量擴(kuò)大培養(yǎng)60h。1.3 儀器與設(shè)備

LC-10A高效液相色譜(配置RID-10A示差檢測(cè)器)日本島津公司；Aminex HPX-42C糖分析柱 (300mm×7.8mm) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 多糖的測(cè)定

取發(fā)酵液于12000r/min、4℃離心10min，取上清液，加入3倍體積的冷異丙醇，4℃靜置過(guò)夜，離心棄上清液，沉淀加入少量蒸餾水溶解后定容于100mL容量瓶中，苯酚-硫酸法測(cè)Levan果聚糖[20]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.4.2 蔗糖及單糖測(cè)定

采用高壓液相色譜法(HPLC)法測(cè)定蔗糖及單糖的含量。發(fā)酵上清液稀釋成5g/100mL溶液，用0.2μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μL。流動(dòng)相為超純水，流速為0.4mL/min，柱溫70℃。分析軟件為Class-VP 6.0。

1.4.3 菌體生物量測(cè)定

取發(fā)酵液適量，采用分光光度法測(cè)定OD600nm值。

1.4.4 單因素試驗(yàn)

依次改變發(fā)酵培養(yǎng)基水質(zhì)、碳源、氮源以及培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值，接種8-37-0-1菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)，測(cè)定生物量和Levan果聚糖產(chǎn)量。

1.4.5 正交試驗(yàn)

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and their levels in orthogonal array design

選取蔗糖、酵母粉和磷酸鹽3個(gè)因素，采用4因素3水平的正交表(L9(34))設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化條件的因素水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 自來(lái)水和蒸餾水對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

分別用蒸餾水和自來(lái)水配制發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)多糖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：用自來(lái)水配制的發(fā)酵培養(yǎng)基Levan果聚糖產(chǎn)量為9.02g/L，稍高于蒸餾水配制的發(fā)酵培養(yǎng)基的產(chǎn)量8.40g/L，所以在后面的實(shí)驗(yàn)中都用自來(lái)水配制發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2 培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

圖1 培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件對(duì)Levan果聚糖產(chǎn)量和生物量的影響Fig.1 Single factor investigation of the effects of medium and fermentation conditions on levan production and Bacillus licheniformis 8-37-0-1 biomass

2.2.1 碳源對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

分別以30g/L的蔗糖、淀粉、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖為唯一碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，接種進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)。從圖1A可以看出，以淀粉為碳源的培養(yǎng)基中多糖最多，蔗糖培養(yǎng)基多糖量次之，為8.86g/L。但考慮到淀粉及其不完全分解產(chǎn)物會(huì)影響發(fā)酵液中Levan果聚糖產(chǎn)量的測(cè)定，并且將會(huì)影響Levan果聚糖的后提取，故選用蔗糖為碳源進(jìn)一步開(kāi)展研究。

2.2.2 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

分別接種含有不同質(zhì)量濃度蔗糖(10、30、50、70、90g/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)，圖1B結(jié)果顯示，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度在10～90g/L范圍內(nèi)時(shí)Levan果聚糖產(chǎn)量隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增大而增大，在蔗糖質(zhì)量濃度90g/L時(shí)Levan果聚糖產(chǎn)量達(dá)到23.45g/L。

2.2.3 氮源對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中，蔗糖為90g/L，牛肉膏含量不變，硫酸銨用同樣質(zhì)量濃度(0.5g/L)的酵母粉、蛋白胨、尿素、氯化銨、硝酸銨替換配制發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)，圖1C結(jié)果表明，同樣比例的有機(jī)氮替換硫酸銨比無(wú)機(jī)氮替換更有利于菌體生長(zhǎng)，其中酵母粉替換的培養(yǎng)基，Levan果聚糖產(chǎn)量達(dá)到最高，為30.78g/L。

2.2.4 酵母粉質(zhì)量濃度對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

進(jìn)一步接種用不同質(zhì)量濃度酵母粉(0.5、2.0、3.5、5.0、6.5、8.0g/L)替換0.5g/L硫酸銨、90g/L蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)。圖1D結(jié)果顯示：隨著酵母粉質(zhì)量濃度的增加，菌體生物量不斷增加，但多糖產(chǎn)量卻在減少，故選用酵母粉質(zhì)量濃度為0.5g/L，此時(shí)Levan果聚糖產(chǎn)量為30.54g/L。

2.2.5 培養(yǎng)溫度對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

以上的實(shí)驗(yàn)均是在30℃條件下進(jìn)行的。為了進(jìn)一步研究培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)多糖量的影響，接種發(fā)酵培養(yǎng)基(90g/L蔗糖、0.5g/L酵母粉替換0.5g/L硫酸銨)后，分別在20、25、30、37℃條件下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)。圖1E結(jié)果表明，20℃菌體生物量較低，25～37℃菌體生物量變化不大，30℃多糖產(chǎn)量最高(30.92g/L)。

2.2.6 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

分別接種初始pH值分別為4、5、6、7、8、9的發(fā)酵培養(yǎng)基(90g/L蔗糖、0.5g/L酵母粉替換0.5g/L硫酸銨)進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖1F。隨著pH值的升高，菌體生物量不斷升高，但并不利于多糖的產(chǎn)生，pH5.0時(shí)Levan果聚糖產(chǎn)量達(dá)到最高，為31.29g/L。

2.3 正交試驗(yàn)

蔗糖和酵母粉對(duì)Levan果聚糖產(chǎn)量的影響較大(圖1)，而磷酸鹽在菌體的生長(zhǎng)和多糖的生物合成中起著非常重要的作用[21]，故選取蔗糖、酵母粉和磷酸鹽3個(gè)因素進(jìn)行設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，培養(yǎng)基的其他組分同發(fā)酵培養(yǎng)基，pH5.0、30℃培養(yǎng)60h。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design layout and experimental results

從表2可知，對(duì)Levan果聚糖產(chǎn)量培養(yǎng)基組分的影響因子依次排序?yàn)锳＞C＞B，即蔗糖＞總磷酸鹽＞酵母粉。正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ v3.1分析得出的方差分析結(jié)果顯示：蔗糖和總磷酸鹽的質(zhì)量濃度對(duì)Levan果聚糖產(chǎn)量的影響起最主要作用，酵母粉質(zhì)量濃度在此試驗(yàn)范圍內(nèi)的影響最小(表3)。綜合考慮各因素對(duì)多糖產(chǎn)量的影響，得出最優(yōu)的組合為A3C3B3，即蔗糖100g/L、總磷酸鹽6.0g/L(磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀各為3.0g/L)、酵母粉0.6g/L。選用最優(yōu)組合，培養(yǎng)基的其他組分同發(fā)酵培養(yǎng)基，pH5.0、30℃培養(yǎng)60h，多糖產(chǎn)量為42.41g/L，顯著高于正交試驗(yàn)的其他組合。

表3 正交試驗(yàn)的方差分析Table 3 Variance analysis for the results from orthogonal array design

2.4 8-37-0-1菌株發(fā)酵產(chǎn)糖時(shí)間曲線(xiàn)

圖2 8-37-0-1菌株Levan果聚糖的發(fā)酵時(shí)間曲線(xiàn)Fig.2 Time course of growth and levan fermentation from Bacillus licheniformis 8-37-0-1

在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下測(cè)定地衣芽孢桿菌8-37-0-1發(fā)酵產(chǎn)生Levan果聚糖的發(fā)酵時(shí)間曲線(xiàn)，即蔗糖100g/L、磷酸氫二鉀3.0g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、酵母粉0.6g/L替換硫酸銨，其他成分同發(fā)酵培養(yǎng)基，pH5.0，30℃培養(yǎng)。分別在不同的時(shí)間取樣，測(cè)定發(fā)酵液中Levan果聚糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的含量，以及菌體生物量、pH值的變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。在0～24h內(nèi)蔗糖消耗速度最快，培養(yǎng)至52h時(shí)蔗糖幾乎全部消耗；而Levan果聚糖含量在24h時(shí)達(dá)到最高，為41.7g/L，隨后呈緩慢下降趨勢(shì)；在48h時(shí)葡萄糖和果糖量都達(dá)到最高值，并且葡萄糖顯著高于果糖，48h后約是果糖的4倍多，隨后都進(jìn)入穩(wěn)定期；菌體在16h時(shí)就進(jìn)入了穩(wěn)定期，28h進(jìn)入衰亡期；在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中pH值變化不大，波動(dòng)于4.5～4.7之間。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)一株產(chǎn)Levan果聚糖的芽孢桿菌B. licheniformis8-37-0-1的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：用自來(lái)水配制的培養(yǎng)基比用蒸餾水配制的培養(yǎng)基產(chǎn)糖多，這與斯達(dá)油脂酵母U9018產(chǎn)胞外多糖[22]的發(fā)酵條件一致，可能是自來(lái)水中含有一定的各種離子促進(jìn)Levan果聚糖的合成。在以非多糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)生Levan果聚糖的實(shí)驗(yàn)中蔗糖是最優(yōu)的碳源，這與運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、木醋桿菌等發(fā)酵產(chǎn)生Levan果聚糖的情況一致[3,9]。酵母粉質(zhì)量濃度的優(yōu)化結(jié)果表明，酵母粉質(zhì)量濃度的增加有利于菌體生長(zhǎng)，但不利于Levan果聚糖的產(chǎn)生。蔗糖質(zhì)量濃度的優(yōu)化和酵母粉質(zhì)量濃度的優(yōu)化結(jié)果都證明了高碳氮比例有利于胞外多糖的產(chǎn)生[21]，本研究得到的碳氮比例是125:2。微生物不同其Levan產(chǎn)量也不盡相同。多黏芽孢桿菌NRRL-18475接種150g/L蔗糖培養(yǎng)基，30℃、170r/min搖床培養(yǎng)10d，Levan產(chǎn)量為36g/L[12]。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌ATCC 31821接種250g/L蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)24h，Levan產(chǎn)量為21.685g/L[3]。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌B4286變體ZML1和ZML2接種150g/L蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h，Levan產(chǎn)量分別為21.6、20.0g/L[13]。芽孢桿菌以12g/100mL蔗糖為碳源，其Levan果聚糖產(chǎn)量為28.2g/L[23]。而本研究中，地衣芽孢桿菌8-37-0-1接種100g/L蔗糖、3.0g/L磷酸氫二鉀、3.0g/L磷酸二氫鉀、0.6g/L酵母粉的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h時(shí)，Levan果聚糖產(chǎn)量高達(dá)41.7g/L，大約是優(yōu)化前的5.0倍，顯著高于其他菌株的Levan產(chǎn)量。本研究通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化顯著提高了地衣芽孢桿菌8-37-0-1的Levan果聚糖產(chǎn)量，為該菌株的工業(yè)開(kāi)發(fā)提供參考。

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Optimization of Fermentation Conditions for Production of Levan byBacillus licheniformis8-37-0-1

LU Juan1,2，XIAO Min1,*，LU Li-li1
(1. State Key Laboratory of Microbial Technology and National Glycoengineering Research Center, Shandong University,Jinan 250100, China；2. School of Life Sciences, Fuyang Teachers College, Fuyang 236041, China)

The medium and fermentation conditions for levan production byBacillus licheniformis8-37-0-1 were optimized by single factor and orthogonal array experiments. After culture at 30 ℃ for 24 h in a medium prepared with tap water consisting of sucrose 100 g/L, yeast extract 0.6 g/L, beef extract 1.0 g/L, KH2PO4 3.0 g/L, K2HPO4 3.0 g/L, NaCl 1.0 g/L, MgSO4·7H2O 0.2 g/L and FeSO4·7H2O 0.001 g/L, a maximum levan production of 41.7 g/L was achieved, which was 5.0 times higher than before optimization.

Bacillus licheniformis8-37-0-1；levan；fermentation condition；optimization

TQ920.1

A

1002-6630(2011)07-0183-05

2010-07-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31070064)；山東大學(xué)自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2009DX002)

陸娟(1979—)，女，碩士，主要從事微生物多糖研究。E-mail：lujuan918@sohu.com

*通信作者：肖敏(1962—)，女，教授，博士，主要從事微生物技術(shù)研究。E-mail：minxiao@sdu.edu.cn