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    地衣芽孢桿菌產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵條件的優(yōu)化

    2011-10-27 07:36:44盧麗麗
    食品科學(xué) 2011年7期
    關(guān)鍵詞:酵母粉蔗糖芽孢

    陸 娟,肖 敏*,盧麗麗

    (1.山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家糖工程技術(shù)研究中心,山東 濟(jì)南 250100;2.阜陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,安徽 阜陽(yáng) 236041)

    地衣芽孢桿菌產(chǎn)Levan果聚糖發(fā)酵條件的優(yōu)化

    陸 娟1,2,肖 敏1,*,盧麗麗1

    (1.山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家糖工程技術(shù)研究中心,山東 濟(jì)南 250100;2.阜陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,安徽 阜陽(yáng) 236041)

    通過(guò)單因素試驗(yàn)(培養(yǎng)基用水、碳源、氮源、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基初始pH值)和正交試驗(yàn)對(duì)地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)8-37-0-1發(fā)酵產(chǎn)生Levan果聚糖的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。結(jié)果表明:以蔗糖100g/L、牛肉膏1.0g/L、酵母粉0.6g/L、K2HPO4 3.0g/L、KH2PO4 3.0g/L、NaCl 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、FeSO4·7H2O 0.001g/L,自來(lái)水配制,培養(yǎng)基初始pH5.0,30℃培養(yǎng)8-37-0-1菌株24h,Levan果聚糖產(chǎn)量達(dá)到最高值41.7g/L,約是未優(yōu)化時(shí)的5.0倍。

    Bacillus licheniformis8-37-0-1;Levan;發(fā)酵條件;優(yōu)化

    Levan果聚糖是一類(lèi)分子中含有大量β-(2,6)糖苷鍵和少量β-(2,1)果糖苷鍵的多糖,與分子中主要含有β-(2,1)果糖苷鍵的菊粉類(lèi)果聚糖顯著不同[1]。Levan果聚糖的分子質(zhì)量通常在幾萬(wàn)到一兩百萬(wàn)之間,在食品工業(yè)方面,它可作為功能性食品的重要組成部分[2]、低聚果糖生產(chǎn)的原材料以及乳化劑和成膜劑等[3]。在醫(yī)藥方面,Levan果聚糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)控、抗感染等作用,還可以作為血漿的替代品[3-5]。除此以外,由于具有與透明質(zhì)酸一樣的保濕效果及對(duì)人體纖維原細(xì)胞和角化細(xì)胞相似的增殖作用,Levan果聚糖還可作為化妝品添加劑使用[6]。Levan果聚糖廣泛的應(yīng)用潛力使其生產(chǎn)得到了人們的關(guān)注。

    L e v a n果聚糖可來(lái)源于植物或微生物,小麥(Triticum aestivum)[7]、黑麥草(ryegrass)和鴨茅(cocksfoot)[8]等植物可以產(chǎn)生低分子質(zhì)量的Levan果聚糖,高分子質(zhì)量的Levan果聚糖主要由微生物發(fā)酵產(chǎn)生。Levan果聚糖的產(chǎn)生菌多為細(xì)菌,早在1902年,Smith從桃金娘科的植物屬(Eucalyptus stuartina)的含糖分泌物中就發(fā)現(xiàn)了可以產(chǎn)Levan果聚糖的微生物,隨后發(fā)現(xiàn)木醋桿菌(Acetobacter xylinum)[9]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[10]、產(chǎn)果聚糖微桿菌(Microbacterium laevaniformans)[11]、多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)[12]、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)[3,13-14]、舊金山乳桿菌(Lactobacillus sanfranciscensis)[15-16]和腸膜狀明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)[4,17-18]等細(xì)菌都可以產(chǎn)生Levan果聚糖,其產(chǎn)量約在14.4~36g/L之間。目前,國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)利用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)發(fā)酵產(chǎn)生Levan多糖的報(bào)道。本研究對(duì)地衣芽孢桿菌8-37-0-1產(chǎn)生Levan果聚糖的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,以期能大幅度提高該菌株Levan果聚糖的產(chǎn)量。

    1 材料與方法

    1.1 菌種

    地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)8-37-0-1為本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得,前期工作中已鑒定該菌產(chǎn)生的多糖為L(zhǎng)evan 果聚糖[19]。

    1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

    發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏1.0、(NH4)2SO40.5、K2HPO42.5、KH2PO42.5、NaCl 1.0、蔗糖30、MgSO4·7H2O 0.2、FeSO4·7H2O 0.001,水 1000mL,pH7.0。115℃滅菌 30min。

    菌種經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基180r/min、30℃搖床培養(yǎng)16h活化后,按體積分?jǐn)?shù)4%的接種量擴(kuò)大培養(yǎng)60h。1.3 儀器與設(shè)備

    LC-10A高效液相色譜(配置RID-10A示差檢測(cè)器)日本島津公司;Aminex HPX-42C糖分析柱 (300mm×7.8mm) 美國(guó)Bio-Rad公司。

    1.4 方法

    1.4.1 多糖的測(cè)定

    取發(fā)酵液于12000r/min、4℃離心10min,取上清液,加入3倍體積的冷異丙醇,4℃靜置過(guò)夜,離心棄上清液,沉淀加入少量蒸餾水溶解后定容于100mL容量瓶中,苯酚-硫酸法測(cè)Levan果聚糖[20],以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

    1.4.2 蔗糖及單糖測(cè)定

    采用高壓液相色譜法(HPLC)法測(cè)定蔗糖及單糖的含量。發(fā)酵上清液稀釋成5g/100mL溶液,用0.2μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣,進(jìn)樣量為10μL。流動(dòng)相為超純水,流速為0.4mL/min,柱溫70℃。分析軟件為Class-VP 6.0。

    1.4.3 菌體生物量測(cè)定

    取發(fā)酵液適量,采用分光光度法測(cè)定OD600nm值。

    1.4.4 單因素試驗(yàn)

    依次改變發(fā)酵培養(yǎng)基水質(zhì)、碳源、氮源以及培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值,接種8-37-0-1菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng),測(cè)定生物量和Levan果聚糖產(chǎn)量。

    1.4.5 正交試驗(yàn)

    表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and their levels in orthogonal array design

    選取蔗糖、酵母粉和磷酸鹽3個(gè)因素,采用4因素3水平的正交表(L9(34))設(shè)計(jì)試驗(yàn),優(yōu)化條件的因素水平見(jiàn)表1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 自來(lái)水和蒸餾水對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

    分別用蒸餾水和自來(lái)水配制發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)多糖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:用自來(lái)水配制的發(fā)酵培養(yǎng)基Levan果聚糖產(chǎn)量為9.02g/L,稍高于蒸餾水配制的發(fā)酵培養(yǎng)基的產(chǎn)量8.40g/L,所以在后面的實(shí)驗(yàn)中都用自來(lái)水配制發(fā)酵培養(yǎng)基。

    2.2 培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

    圖1 培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件對(duì)Levan果聚糖產(chǎn)量和生物量的影響Fig.1 Single factor investigation of the effects of medium and fermentation conditions on levan production and Bacillus licheniformis 8-37-0-1 biomass

    2.2.1 碳源對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

    分別以30g/L的蔗糖、淀粉、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖為唯一碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基,接種進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)。從圖1A可以看出,以淀粉為碳源的培養(yǎng)基中多糖最多,蔗糖培養(yǎng)基多糖量次之,為8.86g/L。但考慮到淀粉及其不完全分解產(chǎn)物會(huì)影響發(fā)酵液中Levan果聚糖產(chǎn)量的測(cè)定,并且將會(huì)影響Levan果聚糖的后提取,故選用蔗糖為碳源進(jìn)一步開(kāi)展研究。

    2.2.2 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

    分別接種含有不同質(zhì)量濃度蔗糖(10、30、50、70、90g/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng),圖1B結(jié)果顯示,當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度在10~90g/L范圍內(nèi)時(shí)Levan果聚糖產(chǎn)量隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增大而增大,在蔗糖質(zhì)量濃度90g/L時(shí)Levan果聚糖產(chǎn)量達(dá)到23.45g/L。

    2.2.3 氮源對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

    發(fā)酵培養(yǎng)基中,蔗糖為90g/L,牛肉膏含量不變,硫酸銨用同樣質(zhì)量濃度(0.5g/L)的酵母粉、蛋白胨、尿素、氯化銨、硝酸銨替換配制發(fā)酵培養(yǎng)基,進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng),圖1C結(jié)果表明,同樣比例的有機(jī)氮替換硫酸銨比無(wú)機(jī)氮替換更有利于菌體生長(zhǎng),其中酵母粉替換的培養(yǎng)基,Levan果聚糖產(chǎn)量達(dá)到最高,為30.78g/L。

    2.2.4 酵母粉質(zhì)量濃度對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

    進(jìn)一步接種用不同質(zhì)量濃度酵母粉(0.5、2.0、3.5、5.0、6.5、8.0g/L)替換0.5g/L硫酸銨、90g/L蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)。圖1D結(jié)果顯示:隨著酵母粉質(zhì)量濃度的增加,菌體生物量不斷增加,但多糖產(chǎn)量卻在減少,故選用酵母粉質(zhì)量濃度為0.5g/L,此時(shí)Levan果聚糖產(chǎn)量為30.54g/L。

    2.2.5 培養(yǎng)溫度對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

    以上的實(shí)驗(yàn)均是在30℃條件下進(jìn)行的。為了進(jìn)一步研究培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)多糖量的影響,接種發(fā)酵培養(yǎng)基(90g/L蔗糖、0.5g/L酵母粉替換0.5g/L硫酸銨)后,分別在20、25、30、37℃條件下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)。圖1E結(jié)果表明,20℃菌體生物量較低,25~37℃菌體生物量變化不大,30℃多糖產(chǎn)量最高(30.92g/L)。

    2.2.6 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)8-37-0-1菌株Levan果聚糖產(chǎn)量的影響

    分別接種初始pH值分別為4、5、6、7、8、9的發(fā)酵培養(yǎng)基(90g/L蔗糖、0.5g/L酵母粉替換0.5g/L硫酸銨)進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng),結(jié)果見(jiàn)圖1F。隨著pH值的升高,菌體生物量不斷升高,但并不利于多糖的產(chǎn)生,pH5.0時(shí)Levan果聚糖產(chǎn)量達(dá)到最高,為31.29g/L。

    2.3 正交試驗(yàn)

    蔗糖和酵母粉對(duì)Levan果聚糖產(chǎn)量的影響較大(圖1),而磷酸鹽在菌體的生長(zhǎng)和多糖的生物合成中起著非常重要的作用[21],故選取蔗糖、酵母粉和磷酸鹽3個(gè)因素進(jìn)行設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),培養(yǎng)基的其他組分同發(fā)酵培養(yǎng)基,pH5.0、30℃培養(yǎng)60h。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design layout and experimental results

    從表2可知,對(duì)Levan果聚糖產(chǎn)量培養(yǎng)基組分的影響因子依次排序?yàn)锳>C>B,即蔗糖>總磷酸鹽>酵母粉。正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ v3.1分析得出的方差分析結(jié)果顯示:蔗糖和總磷酸鹽的質(zhì)量濃度對(duì)Levan果聚糖產(chǎn)量的影響起最主要作用,酵母粉質(zhì)量濃度在此試驗(yàn)范圍內(nèi)的影響最小(表3)。綜合考慮各因素對(duì)多糖產(chǎn)量的影響,得出最優(yōu)的組合為A3C3B3,即蔗糖100g/L、總磷酸鹽6.0g/L(磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀各為3.0g/L)、酵母粉0.6g/L。選用最優(yōu)組合,培養(yǎng)基的其他組分同發(fā)酵培養(yǎng)基,pH5.0、30℃培養(yǎng)60h,多糖產(chǎn)量為42.41g/L,顯著高于正交試驗(yàn)的其他組合。

    表3 正交試驗(yàn)的方差分析Table 3 Variance analysis for the results from orthogonal array design

    2.4 8-37-0-1菌株發(fā)酵產(chǎn)糖時(shí)間曲線(xiàn)

    圖2 8-37-0-1菌株Levan果聚糖的發(fā)酵時(shí)間曲線(xiàn)Fig.2 Time course of growth and levan fermentation from Bacillus licheniformis 8-37-0-1

    在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下測(cè)定地衣芽孢桿菌8-37-0-1發(fā)酵產(chǎn)生Levan果聚糖的發(fā)酵時(shí)間曲線(xiàn),即蔗糖100g/L、磷酸氫二鉀3.0g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、酵母粉0.6g/L替換硫酸銨,其他成分同發(fā)酵培養(yǎng)基,pH5.0,30℃培養(yǎng)。分別在不同的時(shí)間取樣,測(cè)定發(fā)酵液中Levan果聚糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的含量,以及菌體生物量、pH值的變化情況,結(jié)果見(jiàn)圖2。在0~24h內(nèi)蔗糖消耗速度最快,培養(yǎng)至52h時(shí)蔗糖幾乎全部消耗;而Levan果聚糖含量在24h時(shí)達(dá)到最高,為41.7g/L,隨后呈緩慢下降趨勢(shì);在48h時(shí)葡萄糖和果糖量都達(dá)到最高值,并且葡萄糖顯著高于果糖,48h后約是果糖的4倍多,隨后都進(jìn)入穩(wěn)定期;菌體在16h時(shí)就進(jìn)入了穩(wěn)定期,28h進(jìn)入衰亡期;在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中pH值變化不大,波動(dòng)于4.5~4.7之間。

    3 討 論

    本實(shí)驗(yàn)對(duì)一株產(chǎn)Levan果聚糖的芽孢桿菌B. licheniformis8-37-0-1的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明:用自來(lái)水配制的培養(yǎng)基比用蒸餾水配制的培養(yǎng)基產(chǎn)糖多,這與斯達(dá)油脂酵母U9018產(chǎn)胞外多糖[22]的發(fā)酵條件一致,可能是自來(lái)水中含有一定的各種離子促進(jìn)Levan果聚糖的合成。在以非多糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)生Levan果聚糖的實(shí)驗(yàn)中蔗糖是最優(yōu)的碳源,這與運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、木醋桿菌等發(fā)酵產(chǎn)生Levan果聚糖的情況一致[3,9]。酵母粉質(zhì)量濃度的優(yōu)化結(jié)果表明,酵母粉質(zhì)量濃度的增加有利于菌體生長(zhǎng),但不利于Levan果聚糖的產(chǎn)生。蔗糖質(zhì)量濃度的優(yōu)化和酵母粉質(zhì)量濃度的優(yōu)化結(jié)果都證明了高碳氮比例有利于胞外多糖的產(chǎn)生[21],本研究得到的碳氮比例是125:2。微生物不同其Levan產(chǎn)量也不盡相同。多黏芽孢桿菌NRRL-18475接種150g/L蔗糖培養(yǎng)基,30℃、170r/min搖床培養(yǎng)10d,Levan產(chǎn)量為36g/L[12]。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌ATCC 31821接種250g/L蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基,25℃培養(yǎng)24h,Levan產(chǎn)量為21.685g/L[3]。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌B4286變體ZML1和ZML2接種150g/L蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)24h,Levan產(chǎn)量分別為21.6、20.0g/L[13]。芽孢桿菌以12g/100mL蔗糖為碳源,其Levan果聚糖產(chǎn)量為28.2g/L[23]。而本研究中,地衣芽孢桿菌8-37-0-1接種100g/L蔗糖、3.0g/L磷酸氫二鉀、3.0g/L磷酸二氫鉀、0.6g/L酵母粉的發(fā)酵培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)24h時(shí),Levan果聚糖產(chǎn)量高達(dá)41.7g/L,大約是優(yōu)化前的5.0倍,顯著高于其他菌株的Levan產(chǎn)量。本研究通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化顯著提高了地衣芽孢桿菌8-37-0-1的Levan果聚糖產(chǎn)量,為該菌株的工業(yè)開(kāi)發(fā)提供參考。

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    Optimization of Fermentation Conditions for Production of Levan byBacillus licheniformis8-37-0-1

    LU Juan1,2,XIAO Min1,*,LU Li-li1
    (1. State Key Laboratory of Microbial Technology and National Glycoengineering Research Center, Shandong University,Jinan 250100, China;2. School of Life Sciences, Fuyang Teachers College, Fuyang 236041, China)

    The medium and fermentation conditions for levan production byBacillus licheniformis8-37-0-1 were optimized by single factor and orthogonal array experiments. After culture at 30 ℃ for 24 h in a medium prepared with tap water consisting of sucrose 100 g/L, yeast extract 0.6 g/L, beef extract 1.0 g/L, KH2PO4 3.0 g/L, K2HPO4 3.0 g/L, NaCl 1.0 g/L, MgSO4·7H2O 0.2 g/L and FeSO4·7H2O 0.001 g/L, a maximum levan production of 41.7 g/L was achieved, which was 5.0 times higher than before optimization.

    Bacillus licheniformis8-37-0-1;levan;fermentation condition;optimization

    TQ920.1

    A

    1002-6630(2011)07-0183-05

    2010-07-11

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31070064);山東大學(xué)自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2009DX002)

    陸娟(1979—),女,碩士,主要從事微生物多糖研究。E-mail:lujuan918@sohu.com

    *通信作者:肖敏(1962—),女,教授,博士,主要從事微生物技術(shù)研究。E-mail:minxiao@sdu.edu.cn

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