梅迪-維斯納病毒研究進(jìn)展*

張念章,儲(chǔ)岳峰,趙 萍,高鵬程,賀 英,逯忠新

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部草食動(dòng)物疫病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州730046)

梅迪-維斯納病毒(Maedi-Visna virus,MVV)引起的梅迪-維斯納病毒病(Maedi-Visna virus disease,MVD),也稱綿羊進(jìn)行性肺炎(Ovine progressive pneumonia,OPP)的病原體。本病在冰島流行時(shí),將表現(xiàn)為進(jìn)行性間質(zhì)性肺炎的癥狀描述為梅迪(Maedi,冰島語,意為呼吸困難),將表現(xiàn)為麻痹性腦膜腦炎的癥狀描述為維斯納(Visna,冰島語,意為耗損)。近年的一些研究資料已經(jīng)證實(shí),梅迪和維斯納是由同一種病毒感染引起的兩種不同臨床癥狀的疫病。乳腺是該病毒最為敏感的靶器官,即使在低敏感品種的羊中,乳腺也存在不同程度的病理學(xué)變化[1]。在自然情況下,發(fā)生MVV與朊病毒共感染時(shí),可在肺和乳腺大量分離出該病原[2]。

一直以來,MVV被當(dāng)作慢病毒屬的模式生物來研究[3]。已被廣泛應(yīng)用于研究慢病毒屬的細(xì)胞嗜性、持續(xù)性感染、發(fā)病機(jī)理[4]、傳播途徑[5]和免疫逃避[6]等方面。因此,本文對MVV病原分子生物學(xué)、致病機(jī)理、免疫逃避機(jī)理及引起宿主的免疫反應(yīng)等進(jìn)行綜述,為研發(fā)新疫苗、藥物以及防控該病提供理論依據(jù)。

1 病原

MVV又稱綿羊進(jìn)行性肺炎病毒(Ovine progressive pneumonia virus),直徑大約90 nm～100 nm,呈球狀體,屬于C型粒子。病毒核心致密,直徑為30 nm～40 nm。有囊膜,表面有長約10 nm的纖突,具有雙層膜結(jié)構(gòu)。核酸雜交研究表明,MVV與其他哺乳動(dòng)物的慢病毒的核酸同源性很低。病毒粒子中的RNA不具有感染性。

1.1 病毒基因組

MVV的核酸基因組是由單股RNA組成,約占病毒干重的2%。1514冰島株基因組全長有9 202個(gè)核苷酸,包含gag、pol和env 3個(gè)基因[7]。基因組單體RNA的結(jié)構(gòu)自5′端甲基化帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppGmp)向3′端方向依次為5′端區(qū)末端重復(fù)序列(R)-5′端獨(dú)特區(qū)(5′unique region,U5)-引物結(jié)合區(qū)(PBS)-前導(dǎo)序列(leader)-核心蛋白(Gag)編碼區(qū)-病毒蛋白酶編碼區(qū)(pol)-囊膜蛋白編碼區(qū)(Env)-聚嘌呤段(PP)-3′端獨(dú)特區(qū)(U3)-3′端區(qū)末端重復(fù)序列(R)-多聚A(polyA)。其中5′端和3′端的R區(qū)核苷酸序列完全相同,該序列在反轉(zhuǎn)錄過程中,與新合成的DNA從基因組的一端調(diào)至另一端有關(guān);U5區(qū)長度約為70 nt,與反轉(zhuǎn)錄過程的起始、前病毒DNA的整合、病毒RNA的合成有關(guān);leader區(qū)長度約為150 nt;3′端非編碼區(qū)與結(jié)構(gòu)區(qū)重疊。編碼區(qū)中pol由3 315個(gè)核苷酸構(gòu)成,和env的開放閱讀框并不重疊,而由OrfQ(230個(gè)密碼子)分開。

1.2 主要抗原蛋白

1.2.1 病毒的核心蛋白 Gag即病毒粒子的非糖結(jié)構(gòu)蛋白,主要的抗原成分是p30,抗原性穩(wěn)定。這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列在同屬內(nèi)的病毒間比較保守,具有相似的抗原性,為群抗原(group antigen,Gag)。Gag蛋白相應(yīng)的基因?yàn)間ag,gag基因的初始產(chǎn)物是含442個(gè)氨基酸的Gag前體蛋白,然后在病毒蛋白酶的作用下,裂解成基質(zhì)蛋白(MA)、衣殼蛋白(CA)和核衣殼蛋白(NC)等。MA緊緊位于病毒囊膜之下,形成一個(gè)連續(xù)的蛋白質(zhì)“殼層”,MA向內(nèi)與其他Gag蛋白連接,向外與脂質(zhì)雙層的病毒囊膜相連,與結(jié)合脂質(zhì)的特征相適應(yīng)。在CA中還有一段長約20個(gè)氨基酸殘基的高度保守區(qū)域,稱為主要同源區(qū)域(MHC),針對MHC的抗體可與大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄病毒反應(yīng)。NC與病毒基因組RNA緊密結(jié)合,二者共同構(gòu)成病毒的核心。將Gag核酸疫苗與佐劑IL-2聯(lián)合免疫Balb/c小鼠。結(jié)果表明,免疫反應(yīng)以特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答為主,同時(shí)可產(chǎn)生體液免疫[8]。

1.2.2 酶蛋白 主要包括蛋白酶(PR)、反轉(zhuǎn)錄酶(RT)、整合酶(IN)等3種。推測Gag-pol前體大約175 ku,2 177 bp至2 827 bp與反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生有關(guān),4 163 bp至4 681 bp與核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生有關(guān)。病毒粒子的反轉(zhuǎn)錄酶是一個(gè)單鏈60 ku～70 ku蛋白,至少有四種不同活性。①它能以病毒RNA為模板合成DNA互補(bǔ)鏈;②它具有核酸酶活性(稱為核酸酶H),去除DNA/RNA雜交分子中的RNA鏈;③它又能以DNA為模板合成另一條DNA鏈而成雙鏈;④有整合酶活性。這種病毒的雙鏈DNA稱為前病毒。前病毒DNA整合細(xì)胞基因組后,在宿主細(xì)胞依賴DNA的RNA多聚酶Ⅱ的催化下,可轉(zhuǎn)錄成病毒正鏈RNA,即由整合在細(xì)胞染色體中的前病毒產(chǎn)生新的病毒粒子。Wu C等[9]預(yù)測了pol蛋白的CD8+的抗原表位,發(fā)現(xiàn)在多肽鏈的537位～725位氨基酸可形成25 aa的表位結(jié)構(gòu)。Fu H L報(bào)道[10],瓊脂糖凝膠柱層析純化的MVV(K796株)經(jīng)SDSPAGE分析,是由25種蛋白質(zhì)組成的,最大的蛋白成分為gp175和gp115,最小的蛋白成分為p12。

1.2.3 囊膜蛋白 MVV的Env為糖蛋白,相應(yīng)的基因?yàn)閑nv,含983個(gè)密碼子。具有抗原決定簇的是gp135,能誘發(fā)中和反應(yīng)。蛋白質(zhì)部分由二條肽鏈組成,較小的那條鏈貫穿病毒的囊膜,成為穿膜蛋白(TM),較大的那條鏈通過與二硫鍵和氫鍵與TM相連,暴露于囊膜之外,稱為表面蛋白(SU)。二者均來自env基因編碼前體的蛋白,經(jīng)水解后產(chǎn)生。SU上有許多糖基化位點(diǎn),這些位點(diǎn)在自然狀態(tài)下結(jié)合有多糖;SU有受體結(jié)合的功能,但在一級(jí)結(jié)構(gòu)上,組成受體結(jié)合的位點(diǎn)核苷酸并沒有完全緊鄰排列在一起。SU還是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白質(zhì)。SU非常容易發(fā)生變異,是MVV抗原高度變異性的主要原因。TM也結(jié)合有多糖,但糖基化程度不及SU。TM有3個(gè)功能區(qū),即膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)。膜外區(qū)與表面蛋白結(jié)合,其氨基端的氨基酸具有疏水性,參與感染過程中病毒與宿主細(xì)胞膜的融合。

2 致病機(jī)理

當(dāng)病毒被吸入呼吸系統(tǒng)之后,即通過其囊膜糖蛋白吸附細(xì)胞表面受體而感染綿羊細(xì)胞,有時(shí)還可以侵入支氣管、縱膈淋巴結(jié)、血液、脾和腎。被病毒侵襲的肺細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞或淋巴細(xì)胞,由于病毒刺激而增生。隨后,肺泡間隔由于出現(xiàn)許多新的組織細(xì)胞和一些新的纖維細(xì)胞以及膠原纖維而變厚。同時(shí)肺泡壁的鱗狀上皮細(xì)胞變成立方形細(xì)胞。此外,細(xì)支氣管和血液周圍的淋巴樣組織增生形成活動(dòng)性的生發(fā)中心。由于肺泡的功能減低甚至消失,氣體交換受到影響,逐漸發(fā)展成致死型的缺氧癥。有報(bào)道稱,MVV的Tat蛋白可誘導(dǎo)山羊滑膜囊細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞凋亡[11]。目前,已構(gòu)建了可表達(dá)綠色熒光蛋白的MVV,為弄清其在體內(nèi)感染的移行路線提供了有力工具[12]。

3 免疫逃避機(jī)理

盡管MVV感染后,綿羊很快就能產(chǎn)生特異性抗體,而且血清中還會(huì)存在高滴度的中和抗體和補(bǔ)體,但在長達(dá)數(shù)周至數(shù)月的潛伏期和癥狀出現(xiàn)的前期,各種組織包括腦、肝、心[13]、肺、精液[13]、鼻分泌物、糞便和外生殖器[14]中都存在低滴度的病毒。將病羊的血液接種于易感羊,照樣可以引起人工感染。中和抗體似乎沒有阻止病毒在血液中的傳播,主要是由于該病毒感染單核-巨噬細(xì)胞后,大多數(shù)情況下不會(huì)對細(xì)胞造成任何傷害,而成為隱性感染[15]。

MVV RNA基因組可通過DNA前病毒的形式在血液單核細(xì)胞中復(fù)制,隨血液循環(huán)至靶器官[16]。在血液中,MVV不被單核細(xì)胞遞呈至細(xì)胞表面,也就不會(huì)被CD4細(xì)胞識(shí)別[17]。這種限制性表達(dá)使病毒能隱蔽循環(huán),不能被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別,不會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。當(dāng)感染的單核細(xì)胞成熟為巨噬細(xì)胞后,前病毒基因的表達(dá)大為增加,以致用原位雜交即可檢出病毒RNA,但產(chǎn)生完整病毒仍很少。病毒到達(dá)肺、乳房、關(guān)節(jié)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織后,在巨噬細(xì)胞表面的表達(dá)抗原,導(dǎo)致局部單核細(xì)胞炎性灶的產(chǎn)生。這種“特洛伊木馬”式的機(jī)制,可以確保病毒在血液細(xì)胞的持續(xù)存在,細(xì)胞保護(hù)了病毒并可以釋放病毒[18]。有研究用gag或gag與env重組基因工程疫苗免疫接種綿羊后,可減少前病毒在血液和組織中的存在。而單獨(dú)使用env基因工程疫苗免疫接種綿羊,卻無此作用[19]。說明gag在反轉(zhuǎn)錄過程中起到重要作用。此外,MVV可在體內(nèi)發(fā)生抗原變異是持續(xù)性感染的另一種機(jī)制也已得到證實(shí)[20]。

4 機(jī)體免疫應(yīng)答

關(guān)于本病進(jìn)程緩慢的原因,目前尚無確切的解釋。據(jù)Thormar等報(bào)道,若在培養(yǎng)液中加入健康羔羊血清,則能完全抑制MVV在單層細(xì)胞中的增殖,加入腦脊液也能產(chǎn)生類似的抑制效應(yīng)。試驗(yàn)證明,這種抑制因子存在于所有被試羔羊的血清中,它不是免疫球蛋白,不能被透析或過濾,對100℃加熱10 min有抵抗力,很可能是一種脂蛋白。在特異性抗體產(chǎn)生之前,這種因子可能在抑制病毒方面具有重要作用。這可部分地解釋為什么OPP沒有急性期。

關(guān)于MVV受體的研究,有采用病毒外表蛋白印跡法,檢測能結(jié)合純化病毒的細(xì)胞表面分子的分子質(zhì)量。山羊滑膜炎(GSM)細(xì)胞和綿羊脈絡(luò)叢(SCP)細(xì)胞表面約15、30、50 ku的分子與MVV結(jié)合?？?0 ku蛋白抗體可阻斷35S-蛋氨酸標(biāo)記MVV與SCP細(xì)胞結(jié)合?？?5 ku、30 ku蛋白抗體不能阻斷病毒對細(xì)胞的結(jié)合。因此,通過抗50 ku蛋白抗體的阻斷活性,可表明50 ku蛋白是MVV識(shí)別和結(jié)合靶細(xì)胞表面的分子。Mikula I等[21]研究發(fā)現(xiàn),Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)7與T LR8在MVV感染過程中起重要作用。

在綿羊感染MVV后,特異性細(xì)胞免疫可在感染后2周～3周內(nèi)檢出。補(bǔ)體結(jié)合抗體于7周至3個(gè)月內(nèi)出現(xiàn),中和抗體出現(xiàn)較晚,一般在3個(gè)月左右才能檢出。p28抗體的出現(xiàn)時(shí)間及高峰期均早于p94抗體,且p28抗體的反應(yīng)強(qiáng)度亦高于p94抗體。在血清陽性反應(yīng)的綿羊體內(nèi),CD80和CD86的表達(dá)量與外周循環(huán)系統(tǒng)中Gag抗原的含量有關(guān)。而在顯示臨床癥狀的綿羊體內(nèi)則無此關(guān)聯(lián)[22]。

5 展望

目前,已報(bào)道的OPP的診斷方法包括膠體金免疫電鏡、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)[23]、ELISA、PCR[24]、半套式PCR、定量PCR[25]等,但是還沒有針對梅迪-維斯納病毒的生物制品。找到可以使病毒致弱的細(xì)胞株或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物,是研發(fā)疫苗的關(guān)鍵。另一方面,MVV在真核細(xì)胞中具有的反轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn),可以用來開發(fā)慢病毒載體,不但有利于研發(fā)疫苗,而且可以像噬菌體載體那樣用在科學(xué)研究當(dāng)中。相信隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,MVV必將成為又一例可以預(yù)防的慢病毒。人類必將戰(zhàn)勝HIV、MVV等慢病毒屬致病病原,從而保護(hù)人類與動(dòng)物的健康。

[1] 易海清,阿合買提°買買提,鄧普輝,等.新疆卡拉庫爾羊梅迪/維斯那病毒感染的病理學(xué)觀察[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(2):75-78.

[2] Salazar E,Monleon E,Bolea R.Detection of PrPScin lung and mammary gland is favored by the presence of Visna/maedi virus lesions in naturally coinfected sheep[J].Vet Res,2010,41:58.

[3] Carey N,Dalziel R G.The biology of maedi-visna virus-an overview[J].Vet J,1993,149:437-454.

[4] Torsteinsdottir S,Andresdottir V,Arnarson H,et al.Immune response to Maedi-Visna virus[J].Frontiers Biosci,2007,2:1532-1543.

[5] Blacklaws B A,Berriatua E,To rsteinsdottir S,et al.T ransmission of small ruminant lentiviruses[J].Vet Microbiol,2004,101:199-208.

[6] Reina R,Berriatua E,Lujan L,et al.Prevention strategies against small ruminant lentiviruses:An update[J].Vet J,2009,182:31-37.

[7] Pépin M,Vitu C,Russo P,et al.Maedi-visna virus infection in sheep:a review[J].Vet Res,1998,29(3-4):341-67.

[8] 丁忠慶,沈榮顯,相文華,等.IL-2和綿羊梅迪-維斯納病病毒核心蛋白Gag核酸疫苗聯(lián)合免疫小鼠的免疫應(yīng)答[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,29(3):204-207.

[9] Wu C,Barbezange C,McConnell I,et al.Mapping and characterization of visna/maedi virus cytotoxic T-lymphocyte epitopes[J].J Gen Virol,2008,89(10):2586-2596.

[10] Fu H L.Polyacry lamide gel electrophoresis of Visna virus polypeptides isolated by agarose gel chromatography[J].J Virol,1978,25(1):207-214.

[11] Angela R,Stphanie V,Tim G,et al.Small ruminant lentivirus T at protein induces apoptosis in caprine cells in vitro by the intrinsic pathway[J].Virology,2009,383:93-102.

[12] Gudmundsdttir H S,Olafsd ttir K,Franzd ttir S R,et al.Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein[J].J Virol Methods,2010,168(12):98-102.

[13] Peterson K,Brinkhof J,Houwers D J,et al.Presence of prolentiviral DNA in male sexual organs and ejaculates of small ruminants[J].Theriogenology,2008,69(4):433-442.

[14] Cortez-Romero1 C,Fieni F,Russo P,et al.Presence of Maedi Visna virus(MV V)-proviral DNA in the genital tissues of naturally infected ewes[J].Reprod Dom Anim,Doi:10.1111/j:1439-0531.2010.01608x.2011,46(1):1-6.

[15] Thormar H.Maedi-visna virus and its relationship to human immunodeficiency virus[J].AIDS Rev,2005,7(4):233-45.[16] Andre′s D,Klein D,Watt N J,et al.Diagnostic tests for small ruminant lentiviruses[J].Vet Microb,2005,107:49-62.

[17] Ernst P,Reto Z,Giuseppe B.How to succeed as a virus:strategies for dealing with the immune sy stem[J].Vet Immu-nol,1999,72:111-117.

[18] Sipos W,Schmoll F,Wimmers K.Selection for disease and epidemic resistance in domestic ruminants and swine by indicator traits,marker and causal genes--a review.Part 2:Special immunogenetics of sheep and goats with particular regard for endoparasitoses,scrapie,foot rot and maedi-visna virus infection[J].Dtsch Tierarztl Wochenschr,2003,110(1):3-10.

[19] Niesallac H,Andrsa X,de Barbezangeb C,et al.Sy stemic DNA immunization against ovine lentivirus using particle-mediated epidermal delivery and modified vaccinia Ankara encoding the gag and/or env genes[J].Vaccine,2009,27:260-269.

[20] 李紅芳,陳培富.影響持續(xù)感染的因素研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(5):86-90.

[21] Mikula I,Bhide M,Pasto rekova S,et al.Characterization of ovine TLR7 and T LR8 protein coding regions,detection of mutations and Maedi Visna virus infection[EB/OL].2010,doi:10.1016/j.vetimm,2010-06-15.

[22] Reina R,Glaria I,Benavides J,et al.Association of CD80 and CD86 expression levels with disease status of Visna/Maedi virus infected sheep[J].Viral Immunol,2007,20(4):609-622.

[23] Brellou G D,Angelopoulou K,Poutahidis T,et al.Detection of Maedi-visna virus in the liver and heart of naturally infected sheep[J].J Comp Path,2007,136:27-35.

[24] 胡建軍,符子華,易 忠.綿羊進(jìn)行性肺炎病原檢測方法研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,28(8):68-72.

[25] Herrmann-Hoesing L M,White S N,Lewis G S,et al.Development and validation of an ovine progressive pneumonia virus quantitative PCR[J].Clin Vaccine Immunol,2007,4(10):1274-1278.