小反芻獸疫病毒N基因的原核表達(dá)

阮 洋,秦峻嶺,高玉偉,孫 瑋,張 濤,4,楊玉姣,楊松濤,王承宇,王鐵成,黃 耕,夏咸柱,3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長春130118;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長春130062;3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春130062)

小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)是危害山羊和綿羊的一種高度接觸性病毒,其高致病率和死亡率對養(yǎng)羊業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。臨床上早期表現(xiàn)出高熱、眼炎、膿性鼻液、腐爛性口炎,后期表現(xiàn)為胃腸炎和肺炎。小反芻獸疫由于其高傳染性和快速傳播的能力被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的動物疫病。小反芻獸疫的診斷主要靠免疫捕捉ELISA及病毒分離鑒定。近10年來,這些檢測技術(shù)逐漸被基于染色體組的檢測手段所替代。例如,在2005年由Forsyth M A等[1]建立的RT-PCR方法,在保守的P基因和F基因設(shè)計數(shù)對引物用于鑒別牛瘟病毒(RPV)和PPRV。PPRV N蛋白特異性單克隆抗體已經(jīng)被用來診斷病毒抗原,N基因的cDNA已經(jīng)作為探針用來診斷PPRV[2]。

N蛋白由N基因編碼,基因總長度為1 689 nt。N基因開放閱讀框長度為1 578 nt,N蛋白分子質(zhì)量約為57.18 ku。包含一個開放閱讀框(ORF),編碼525個氨基酸殘基。N蛋白緊緊地包裹著RNA,并形成螺旋結(jié)構(gòu),起到保護(hù)核酸的作用。N蛋白的抗原性穩(wěn)定,在病毒感染的動物血清中針對N蛋白的抗體占主導(dǎo)地位,但是此類抗體不具有中和病毒的作用。N蛋白結(jié)構(gòu)中分為4個區(qū)域,即Ⅰ區(qū)(氨基末端區(qū))、Ⅱ區(qū)(123-144氨基酸)、Ⅲ區(qū)(蛋白的中部區(qū)域)、Ⅳ區(qū)(421-525的羧基末端區(qū))。與其他麻疹病毒屬成員相比,Ⅰ區(qū)和Ⅲ區(qū)保守性較高。用抗N蛋白的單克隆抗體可以區(qū)別RPV和PPRV毒株,從而進(jìn)行鑒別診斷。PPRV N蛋白是組成病毒核衣殼的主要蛋白之一,Ismail T M等[3]克隆表達(dá)了N蛋白用于血清學(xué)診斷。Libeau G等[4-5]獲得了抗N蛋白的單克隆抗體,并建立了競爭ELISA和免疫捕獲ELISA方法用于PPR的血清學(xué)診斷,各國研究者先后建立了針對N基因的RT-PCR方法用于PPRV的病原檢測。

我國在2007年暴發(fā)小反芻獸疫疫情[6],造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前針對小反芻獸疫沒有有效的治療手段,主要靠疫苗進(jìn)行防控。因此建立快速有效的檢測方法就顯得尤為重要。本試驗(yàn)對小反芻獸疫的N蛋白進(jìn)行原核表達(dá),旨在獲得高純度的蛋白抗原,為下一步小反芻獸疫基因工程疫苗的開發(fā)、單克隆抗體的制備及快速診斷方法的建立提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達(dá)載體pET-28a(+)、羊抗PPRV Nigeria75/1株多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存;MEN培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品;PMD-18Ts載體,各種限制性內(nèi)切酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000、DL 2 000、exTag、dNTP全部為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;預(yù)染蛋白Marker寬范圍(6～175),為NEB生物公司產(chǎn)品;鼠抗his標(biāo)簽單抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)合成PPRV-N序列,自行設(shè)計引物并由寶生物工程(大連)有限公司合成。為了便于構(gòu)建表達(dá)載體,在上下游的5′端分別加入HindⅢ、NdeⅠ酶切位點(diǎn),并在下游3′端加入終止密碼子TAA(表1)。

表1 引物設(shè)計Table 1 primer design

1.2.2 目的片段的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建 以公司合成質(zhì)粒為模板,N1、N2為引物,PCR擴(kuò)增以獲得目的基因。反應(yīng)體系25 μ L:上游引物N1 0.5 μ L、下游引物N2 0.5 μ L、模板DNA 1 μ L、10×PCR buffer 2 μ L、dNTP 2 μ L、Tag酶0.25 μ L、ddH2O 19 μ L;反應(yīng)條件:95℃4 min;94℃30 s,58℃40 s,72℃2 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min。在10 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳后,分離回收擴(kuò)增產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物與pMD18-Ts在4℃連接過夜,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于含有氨芐青霉素(100 mg/mL)的LB瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)過夜,挑取白色單菌落増菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。對提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定,將鑒定為陽性的重組菌的質(zhì)粒送大連華大生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將測序正確的克隆命名為pMD-18Ts-N。將pMD-18Ts-N與pET-28a(+)用HindⅢ、NdeⅠ進(jìn)行雙酶切,回收目的片段,按照目的片段5 μ L、載體片段3 μ L、連接buffer 2 μ L、T4連接酶0.5 μ L的體系4℃連接過夜,取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞,在含有卡那霉素(50 mg/mL)的LB瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)過夜,挑取單菌落在LB(含50 mg/mL卡那霉素)中振蕩培養(yǎng),堿裂解法提取質(zhì)粒后,進(jìn)行PCR與雙酶切鑒定,兩者均為陽性時將所構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET28a-N。

1.2.3 重組蛋白表達(dá)菌株的確定 將篩選出的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌Transetta(DE3)中,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于含有卡那霉素(100 mg/mL)的LB瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)過夜,挑取白色單菌落増菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。對提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定,將鑒定為陽性的重組菌的質(zhì)粒送大連華大生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將測序正確的菌株命名為Transetta-pET28a-N。

1.2.4 重組蛋白表達(dá) 篩選出的陽性菌株Transetta-pET28a-N,涂布于含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng),次日挑取菌落于含有卡那霉素抗性液體LB培養(yǎng)基中37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期(A600=0.5～1.0)時加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG,誘導(dǎo)6 h后,離心收集菌液,用SDS-PAGE電泳分析斑白表達(dá)情況。

1.2.5 重組蛋白表達(dá)誘導(dǎo)條件的確定 將鑒定表達(dá)的菌株按照1%的比例接種于含有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期(A600=0.5～1.0)時,在誘導(dǎo)溫度和時間不變的情況下改變誘導(dǎo)劑的濃度,分別為0.1、0.5、1、2 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),再在濃度不變的情況下改變誘導(dǎo)的時間分別為4、5、6 h,最后在誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時間不變的情況下改變誘導(dǎo)的溫度,分別為28、30、37℃,收集細(xì)菌,進(jìn)行SDS-PAGE分析對比后確定最終誘導(dǎo)條件為28℃、IPTG濃度為1 mmol/L、200 r/min、6 h。

1.2.6 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 首先鑒定融合蛋白上的HIS標(biāo)簽蛋白,收集最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳,將表達(dá)產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上作為抗原,用含50 g/L的脫脂奶粉的培養(yǎng)液37℃封閉1 h,用TBST洗滌3次,每次10 min,1∶1 000稀釋鼠抗His標(biāo)簽單抗為一抗,37℃作用1 h,用TBST洗滌3次,每次10 min,再用1∶2 000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,37℃作用1 h,用TBST洗滌3次,每次10 min,最后用DAB顯色液顯色。再用羊抗PPRV Nigeria75/1株多克隆抗體為一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG為二抗進(jìn)行Western blot,對表達(dá)的蛋白進(jìn)行免疫活性分析。

1.2.7 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析 在擴(kuò)大表達(dá)菌液量之后,取500mL表達(dá)菌液進(jìn)行離心(10 000 r/min,2 min)回收沉淀,用重懸液按照1∶25倍的比例重懸。進(jìn)行超聲,超聲后的上清與沉淀分別回收,各取40 μ L進(jìn)行SDS-PAGE與Western blot,對比超聲前、超聲后上清、超聲后沉淀中融合蛋白的量。

2 結(jié)果

2.1 N基因的擴(kuò)增

用設(shè)計的引物對合成的質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增引物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴(kuò)增出一條1 500 bp左右的條帶(圖1),與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 N基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

圖1 PPRV N基因的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of PPRV N gene

回收PCR產(chǎn)物,與pMD-18t載體連接,對陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后小型抽提質(zhì)粒并用HindⅢ、NdeⅠ雙酶切鑒定(圖2A)及送華大基因公司測序,確定擴(kuò)增的N基因的正確性。對酶切鑒定及測序正確的質(zhì)粒與pET-28a載體定向重組,并對重組后的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(圖2B)及送華大基因公司測序,以確定N基因序列的完整。

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 Fig.2 Identification of the recombinant plasmid by digestion with enzymes

2.3 N蛋白的表達(dá)與鑒定

2.3.1 蛋白表達(dá)誘導(dǎo)條件的確定 經(jīng)過對誘導(dǎo)溫度,時間及誘導(dǎo)劑IPTG的用量的篩選,確定最終反應(yīng)條件為28℃、IPTG濃度為1 mmol/L、200 r/min、6 h(圖3)。

2.3.2 HIS標(biāo)簽單抗進(jìn)行Western bolt檢測 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至NC膜上進(jìn)行Western blot檢測,結(jié)果顯示,出現(xiàn)3條特異性條帶,而對照組未出現(xiàn)條帶(圖4)證明重組融合蛋白上含有標(biāo)簽蛋白,利于以后的蛋白純化。

2.3.3 融合蛋白活性的鑒定 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)移至NC膜上進(jìn)行Western blot檢測,結(jié)果顯示特異性條帶與HIS標(biāo)簽Western blot檢測結(jié)果相同,表明表達(dá)的蛋白能被PPRV陽性血清所識別,具有與陽性血清反應(yīng)的活性(圖5)。

2.3.4 表達(dá)產(chǎn)物的超聲裂解與分析 在擴(kuò)大表達(dá)菌液量之后,取500 mL表達(dá)菌液進(jìn)行離心(10 000 r/min、2 min)回收沉淀,用重懸液按照1∶25倍的比例重懸。進(jìn)行超聲,超聲后的上清與沉淀分別回收,各取40 μ L進(jìn)行SDS-PAGE與Western blot,對比超聲前、超聲后沉淀上清、超聲后中融合蛋白的表達(dá)量及活性。結(jié)果表明目的蛋白為可溶性蛋白(圖6)。

圖3 SDS-PAGE分析pET28a-N的表達(dá)Fig.3 Ex pression of pET28a-N analyzed by SDS-PAGE

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析Fig.4 Analysis of the expressed fusion protein by Western blot

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析Fig.5 Analysis of the ex pressed fusion protein by Western blot

圖6 表達(dá)產(chǎn)物超聲裂解后的分析 Fig.6 Analysis of the expressed product with sonication

3 討論

目前,國際上針對小反芻獸疫的診斷技術(shù)主要有競爭ELISA[7]、夾心ELISA[8]、RT-PCR[9]等。我國現(xiàn)在對小反芻獸疫的研究還仍處于起步階段,所以特異性高、使用簡便、成本低的檢測手段的研發(fā)就顯得尤為重要。N蛋白的抗原穩(wěn)定性高,而基因的保守與特異性是建立ELISA方法的關(guān)鍵。本試驗(yàn)對GenBank發(fā)表的PPRV Nigeria 75/1株N基因序列進(jìn)行優(yōu)化、克隆及原核表達(dá),旨在為后期建立間接ELISA的快速檢測手段提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡便、表達(dá)量高的顯著優(yōu)點(diǎn),但表達(dá)產(chǎn)物大多以無生物學(xué)活性、不溶性的包涵體形式存在。大多研究表明,多數(shù)外源蛋白在大腸埃希菌內(nèi)不能正確折疊獲得天然空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能,以無活性的形式存在。需先將包涵體溶解后進(jìn)行重組蛋白復(fù)性,這些過程操作復(fù)雜,極大增加了獲得高活性純品的難度和提純成本。

本試驗(yàn)選用的是高效表達(dá)載體pET-28a(+),pET-28a(+)中的HIS標(biāo)簽蛋白在純化過程中起到很重要的作用,為今后的蛋白純化提供保障。在誘導(dǎo)表達(dá)的過程中,通過對誘導(dǎo)劑的濃度、誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)時間的調(diào)節(jié),最終確定誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件為28℃、IPTG的濃度為1 mmol/L、200 r/min、誘導(dǎo)6 h獲得了可溶性表達(dá)的PPRV N抗原蛋白,再進(jìn)行Western blot檢測目的蛋白能與羊抗PPRV Nigeria75/1株多克隆抗體結(jié)合,并出現(xiàn)特異性條帶,說明表達(dá)的重組蛋白具有免疫活性,為建立實(shí)驗(yàn)室快速診斷技術(shù)奠定了基礎(chǔ),也為新型基因工程疫苗[10]的研制提供了依據(jù)。

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