鴨肝炎病毒FC64株的全基因組序列測(cè)定與分析*

宋翠萍,韓先干,仇旭升,于圣青,陳鴻軍,胡青海,丁 鏟

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海200241)

鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是由鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)引起的一種具有急性、高度接觸性、致死性的雛鴨傳染病。本病以發(fā)病急、傳播迅速、病死率高為特征。臨診表現(xiàn)為角弓反張,病理變化為肝炎和出血。DHV曾被分為1個(gè)～3個(gè)血清型[1-2],其中,DHV-1屬小RNA病毒科成員,DHV-2和DHV-3屬于鴨星狀病毒(DAsV)[3-5]。2007年,在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)和韓國(guó),Tseng等和Kim等發(fā)現(xiàn)了在血清學(xué)和基因水平與之相差甚遠(yuǎn)的鴨肝炎病毒新血清型(DHV new serotype,DHV-N),定名為DHV-1B(臺(tái)灣株)和DHV-1C(韓國(guó)株)[6-9]。近年來(lái),我國(guó)學(xué)者也不斷從發(fā)病鴨中分離到與DHV-1和DHV-3無(wú)血清學(xué)相關(guān)性的DHV-N毒株,但通過(guò)對(duì)分離株的全基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),自1958年發(fā)生鴨肝炎至今,我國(guó)DHV-1仍占主導(dǎo)地位[1]。

DHV-1野生病毒可以通過(guò)雞胚的反復(fù)適應(yīng)性培養(yǎng)而突變?yōu)閷?duì)鴨無(wú)致病性的毒株,一些弱毒株C80、A66等便是使用這樣的方式成功減毒[4]。筆者于2009年在福建省某鴨場(chǎng)分離獲得了一株DHV強(qiáng)毒株(命名為FC株),經(jīng)SPF雞胚反復(fù)傳64代后,培育成為對(duì)鴨無(wú)致病力的弱毒株,命名為FC64。為了對(duì)該弱毒株的遺傳背景進(jìn)行分析,本研究擬通過(guò)測(cè)定其全基因組序列,旨在明確該毒株的遺傳背景,為研制鴨病毒性肝炎弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 DHV-1 FC毒株從福建省某發(fā)病鴨場(chǎng)12日齡櫻桃谷肉鴨肝組織中分離,經(jīng)9日齡SPF雞胚增殖,收獲死亡雞胚肝組織,加入滅菌生理鹽水配成1∶5的勻漿液,再反復(fù)傳60代后,培育獲得弱毒株,命名為FC64。上述2種毒株均分裝保存于—80℃。

1.1.2 試劑 反轉(zhuǎn)錄酶及反轉(zhuǎn)錄試劑和pGEM-T easy載體為Promega公司產(chǎn)品;RNA提取試劑、Accquire Taq HF酶為Invitrogen公司產(chǎn)品;凝膠回收試劑盒、DNA片段快速回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等為北京天根公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取 DHV RNA的提取按常規(guī)方法進(jìn)行[9]。即取上述病毒雞胚肝組織勻漿液,反復(fù)凍融3次后,12 000 r/min離心5 min,取100 μ L上清液,加入1 mL Trizol試劑,反復(fù)搖勻。室溫放置20 min,加入200 μ L氯仿,反復(fù)振蕩混勻。室溫放置10 min,在4℃以12 000 r/min離心15 min。取上層水相,加入等體積的異丙醇,4℃放置15 min,4℃12 000 r/min離心10 min。棄上清,沉淀用750 mL/L無(wú)RNA酶的乙醇洗滌,在4℃以12 000 r/min離心10 min,棄上清,室溫干燥15 min。用30 μ L無(wú)RNA酶的純水重懸,取部分RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,其余保存于—20℃。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 根據(jù)Ⅰ型DHV國(guó)內(nèi)弱毒株C80全基因組序列[4],利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)出5對(duì)特異的引物(表1),由上海英駿公司合成。以提取的病毒RNA為模板,應(yīng)用隨機(jī)引物在MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄獲得病毒基因組cDNA,隨后利用Accquire Taq HF酶PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后,取8 μ L PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳。

表1 全長(zhǎng)測(cè)序的引物Table 1 Primers for sequencing

1.2.3 克隆與測(cè)序 用DNA快速回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物,連接至pGEM-T easy載體,轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸埃希菌,在LB抗性培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后,用堿裂解法提取質(zhì)粒,重組質(zhì)粒用酶切和PCR擴(kuò)增法鑒定陽(yáng)性重組子,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(簡(jiǎn)稱上海生工)完成測(cè)序工作。

1.2.4 基因序列的拼接與分析 采用DNA Star的MegAlign程序?qū)⑿蛄袦y(cè)定結(jié)果進(jìn)行拼接,獲得DHV-ⅠFC64弱毒株的全長(zhǎng)基因組序列,將該序列與GenBank中登錄的DHV-Ⅰ序列進(jìn)行比對(duì)(表2),進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析。

表2 參與比對(duì)的序列T able 2 Blast of the complete sequences in DHV-1 strains

2 結(jié)果

2.1 全基因組RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

5個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均與預(yù)期片段大小相符,回收后成功克隆入pGEM-T easy載體中(圖1)。各連接產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

圖1 全基因組RT-PCR結(jié)果Fig.1 RT-PCR result of the complete genome

2.2 基因組序列測(cè)定結(jié)果

根據(jù)各片段間相互重疊的區(qū)域,利用DNA Star軟件包中MegAlign將FC64株各基因片段的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接,得到Ⅰ型DHV FC64株的全基因組核苷酸序列。結(jié)果顯示,FC64株全基因組為7 692 bp(未包括polyA尾),堿基組成為:腺嘌呤28.8%,鳥(niǎo)嘌呤22.64%,尿嘧啶28.05%和胞嘧啶20.51%,A+U含量豐富,占56.85%。5′端非編碼區(qū)(5′UT R)為626 bp,3′UT R約為314 bp,編碼含2 249個(gè)氨基酸的一個(gè)多聚蛋白,該蛋白的等電點(diǎn)(pI)為6.88,分子質(zhì)量約為252.5 ku。多聚蛋白經(jīng)過(guò)一系列蛋白裂解,產(chǎn)生3種結(jié)構(gòu)蛋白(VP0、VP3、VP1)和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(2A1、2A2、2B、2C、3A、3B、3C、3D)。

2.3 基因組序列分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果,筆者將FC64毒株的全基因序列上傳GenBank,獲取登錄號(hào)為:HQ232302。目前,GenBank登錄了近100株DHV基因組全序列。采用Cluster W方法將參考的序列(表2)與FC64測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)(圖2),根據(jù)全基因組序列分析表明,DHV可分為3大群,現(xiàn)在已被廣泛接受為DHV-1的3種血清型(1A、1B、1C)。而且,中國(guó)內(nèi)地、中國(guó)臺(tái)灣和韓國(guó)三地的分離株明顯存在地域性差異。其中,除了國(guó)際上廣泛分離和流行的1A血清型之外,90D、04G屬于中國(guó)臺(tái)灣分離株(血清1B型),AP-03337、AP-04009、AP-04114和AP-04203等屬于1Ca型(韓國(guó)分離株),SD01、SD02、B63、FS、G、CGY等屬于中國(guó)內(nèi)地分離株(1Cb型),這1B和1C血清型均為DHV-N,這3種血清型毒株的全基因序列同源性均在80%以下。FC64株與國(guó)內(nèi)分離或培育的JX強(qiáng)毒株、C80、MY和A66等3株弱毒株處于同一較小的分支,這表明這些毒株具有相近的遺傳關(guān)系。FC64株ORF的核苷酸序列與DHV-1A血清型其他各株的同源性在94.3%～99.6%之間。尤其是,FC64與國(guó)內(nèi)的A66、C80、MY弱毒株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高,為99.6%,與同一分支的JX強(qiáng)毒株的同源性為98.7%(圖3)。這些結(jié)果說(shuō)明,Ⅰ型DHV的氨基酸序列在種內(nèi)高度保守。FC64株與90D、04G、AP-03337株的核苷酸和氨基酸序列的同源性分別僅為71.1%～72.0%,表明DHV不同血清型間存在較高變異性。

圖2 通過(guò)Cluster W比對(duì)DHV分離株全基因組序列Fig.2 Blast of complete genomes of DHV isolates by Cluster W

圖3 核苷酸及氨基酸同源性分析Fig.3 Nucleotide acid and amino acid homology analysis with the complete genome of the strains

3 討論

根據(jù)全基因組序列分析表明,DHV可分為3大群,現(xiàn)在已被廣泛接受為DHV-1的3種血清型(1A、1B、1C)[4-6]。而在DHV-N中,中國(guó)內(nèi)地、中國(guó)臺(tái)灣和韓國(guó)三地的分離株明顯存在地域性差異。其中,90D、04G屬于中國(guó)臺(tái)灣分離株(血清1B型),AP-03337、AP-04009、AP-04114和AP-04203等屬于1Ca型(韓國(guó)分離株),SD01、SD02、B63、FS、G、CGY等屬于中國(guó)內(nèi)地分離株(1Cb型),這1B和1C血清型均為DHV-N,同源性在80%以下[7-9]。而國(guó)際上目前主要的分離株仍位于1A群,為經(jīng)典血清1型[11-12]。根據(jù)全基因序列的比對(duì),本研究對(duì)象FC64毒株(登陸號(hào)為:HQ232303)亦屬于經(jīng)典血清1型DHV。其核苷酸序列與DHV-1A血清型其他各株的同源性在94.3%～99.6%之間。根據(jù)目前已知的DHV-I分離株的全基因組進(jìn)化樹(shù)對(duì)比分析(圖2),筆者發(fā)現(xiàn),DHV-1A分離株明顯分為5個(gè)基因群體,建議將DHV-1分為5個(gè)基因型(1Aa～e),弱毒株主要集中在1Ab基因型中。最近,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所分離獲得多株強(qiáng)致病力的毒株(HDHV-1),這些毒株的全基因組序列大部分在1Ae分支上,而且最近國(guó)內(nèi)1Ae基因型的毒株分離率越來(lái)越高(表2、圖2)。這說(shuō)明隨著分離年代的推移,DHV毒株形成明顯的毒力增強(qiáng)趨勢(shì)。這暗示著DHV-1A的毒力正在逐漸演變。

Ding C Y等[4]對(duì)我國(guó)分離的一株DHV-1進(jìn)行雞胚傳代80代,對(duì)傳代致弱的毒株(C80)進(jìn)行了全基因序列的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)DHV-1基因組的特征性結(jié)構(gòu),如具有與豬捷申病毒(Porcine tescho virus)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)相似的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn);而引導(dǎo)蛋白長(zhǎng)度較短,與其他小RNA病毒不同。Jin X等[11]對(duì)DHV-1湖北分離株JX進(jìn)行了全序列測(cè)定,該株病毒在鴨胚中和反應(yīng)和雛鴨保護(hù)性試驗(yàn)中顯示出良好的抗原性。通過(guò)全基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),本研究對(duì)象FC64毒株與JX株和C80毒株存在極高的同源性(99.6%)。這暗示利用該毒株制成的弱毒疫苗與國(guó)內(nèi)其他幾株疫苗株一樣,能夠很好地抵抗DHV-1A血清型強(qiáng)毒的攻擊。本研究對(duì)該毒株的全基因組測(cè)序結(jié)果更加佐證了該疫苗株的免疫原性。

然而,DHV不同血清型之間的同源性不高(＜80%),交叉免疫原性很低。隨著近年來(lái)DHV-1C血清型類韓國(guó)毒株在我國(guó)開(kāi)始流行,嚴(yán)重地影響了DVH的控制[7]。而目前不僅缺乏DVH 1A血清型疫苗,而且1B和1C血清型毒株的培育剛剛起步,尚未見(jiàn)顯著進(jìn)展。因此,研制DHV-1單價(jià)或多價(jià)疫苗以控制不同血清型的DHV感染顯得異常緊迫。除此之外,已有通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)行弱毒疫苗的研究[12-13],方便了對(duì)DHV抗原的分子修飾,并使得研制DHV多種血清型嵌合的弱毒疫苗成為可能。

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