2005年—2010年我國部分地區(qū)PRRSV流行毒株的遺傳變異分析*

范培虎,危艷武,郭龍軍,吳洪麗,黃立平,劉長明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/豬傳染病研究室,黑龍江哈爾濱150001)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)也稱豬藍(lán)耳病,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的,以妊娠母豬死產(chǎn)、流產(chǎn)、弱仔、木乃伊胎等繁殖障礙以及各生長階段豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病[1]。該病首次在1987年發(fā)生于美國。郭寶清等[2]在我國首次分離到PRRSV CH-1a株。2006年在我國南方地區(qū)暴發(fā)了由PRRSV突變株引起的高致病性高死亡率的PRRS[3-5],造成了嚴(yán)重的危害。PRRSV為尼多病毒目、動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬。PRRSV病毒顆粒是由脂質(zhì)雙分子層包裹的核衣殼的球形粒子[6],直徑為45 nm～80 nm,基因組為單股、正鏈RNA,長15.4 kb左右,含有9個相互重疊的開放閱讀框(ORFs),從5′端到3′端依次為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b和ORF3-7,ORF1a和ORF1b編碼PRRSV的RNA復(fù)制酶和聚合酶,其余的ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7依次編碼GP2、E、GP3、GP4、GP5、基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N[7]。M和GP5以二硫鍵連接的異源二聚體形式存在,是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,占病毒蛋白總量的50%以上[8],該二聚體能跟唾液酸粘附素的N端結(jié)合,在病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要作用[9]。GP2和GP4與CD163分子SRCR的第5功能區(qū)共同參與病毒被內(nèi)吞到細(xì)胞后基因組的釋放過程[10-11]。2006年我國南方暴發(fā)豬“高熱病”嚴(yán)重疫情,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[12-13]。經(jīng)病原學(xué)研究證實由高致病性PRRSV變異株引起的,與經(jīng)典的PRRSV毒株在NSP2基因有90個堿基的缺失。GP5為病毒的囊膜糖蛋白,是能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的靶抗原,鑒于GP5在病毒感染與免疫過程中起到重要作用,在病毒分子遺傳變異分析中也將ORF5序列作為基因分型依據(jù)。安同慶等[14]研究表明,近年國內(nèi)PRRSV流行毒株變異較大,可分為2個亞群,亞群1的中和表位高度變異,亞群2的中和表位相對保守。本研究采用RT-PCR法對我國不同地區(qū)病料進(jìn)行PRRSV檢測,選擇有代表性9份陽性樣品進(jìn)行ORF5～7基因擴(kuò)增和測序,與GenBank下載的PRRSV序列進(jìn)行遺傳變異分析,為探討我國PRRS發(fā)生規(guī)律提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 來自我國13個省(市區(qū))發(fā)病豬的腹股溝淋巴結(jié)、肝、脾、腎、肺、腦、流產(chǎn)胎兒等臟器組織共282份,采集樣品的地區(qū)、時間和各自的數(shù)量為:黑龍江2005年—2010年間102份,吉林2005年—2009年55份,遼寧2005年28份,河北2005年—2007年13份,內(nèi)蒙古2005年—2008年10份,山東2007年12份,北京2009年18份,湖南2006年—2009年22份,上海2006年12份,安徽2008年8份,浙江2005年1份,湖北2005年1份。

1.1.2 主要試劑 提取總RNA用TRIzol,BioFlux公司產(chǎn)品;One Step RT-PCR Kit,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;Cycle-Pure Kit,OMEGA公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank上發(fā)表的PRRSV基因序列(AY032626;AY262352),用Oligo6.0軟件設(shè)計引物,由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.1.4 GenBank下載的其他分離毒株的情況 從GenBank中提取了絕大部分來自我國的GP5基因序列27株,其地理分布和分離時間見表2。

表2 我國其他PRRSV分離毒株序列Table 2 The sequences of other PRRSV isolates in China

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和RT-PCR檢測 用T RIzol法提取病料中的總RNA。One Step RT-PCR Kit對病料總RNA進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為(25 μ L):Rnase Free ddH2O 10.5 μ L,MgCl2(5 mol/L)5 μ L,dNTP Mixture:2.5 μ L,10×One Step RNA PCR buffer 2.5 μ L,引物(20 pmol/L)F2923 0.5 μ L,R3272 0.5 μ L,AMV Reverse T ranscriptase XL 0.5 μ L,AMV-Optimized Taq 0.5 μ L,Ranse Inhibitor 0.5 μ L,模板2 μ L。反應(yīng)條件為:50℃30 min,94℃2 min。94℃30 s,58℃30 s,72℃45 s,共40個循環(huán);72℃延長10 min。15 g/L凝膠電泳,150 V,25 min。

1.2.2 基因的擴(kuò)增和序列的測定 以總RNA為模板,用RT-PCR擴(kuò)增ORF5～7基因。反應(yīng)體系為(25 μ L):RNase Free ddH2O 10.5 μ L,MgCl2(5 mol/L)5 μ L,dNTP Mixture:2.5 μ L,10×One Step RNA PCR buffer 2.5 μ L,引物(20 pmol/L)F13600 0.5 μ L,R15208 0.5 μ L,AMV Reverse transcriptase XL 0.5 μ L,AMV-Optimized Taq 0.5 μ L,RNase inhibitor 0.5 μ L,模板2 μ L。反應(yīng)條件為:50℃30 min,94℃2 min。然后,94℃30 s,55℃30 s,72℃2 min,共30個循環(huán);72℃延長10 min。15 g/L凝膠電泳,150 V,25 min。PCR產(chǎn)物純化按試劑盒說明書進(jìn)行,純化的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行基因測序。

1.2.3 序列分析 用DNA Star中的MegAlign軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析,用Gene Runner軟件對所得序列進(jìn)行糖基化位點的預(yù)測,與參考毒株和國內(nèi)在GenBank下載的27株P(guān)RRSV進(jìn)行同源性比較,繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣品檢測

來自13省(市、區(qū))送檢病料的282份進(jìn)行PRRSV檢測,有53份為PRRSV核酸陽性,陽性檢出率為18.8%。用RT-PCR法對部分病料檢測結(jié)果見圖1,擴(kuò)增產(chǎn)物為263 bp為變異毒株,所有檢測的陽性樣品均為變異毒株,未檢出產(chǎn)物350 bp的經(jīng)典毒株。

圖1 RT-PCR法對我國部分地區(qū)送檢病料PRRSV核酸檢測Fig.1 Detection of PRRSV nucleic acid for samples from partial regions of China by RT-PCR

2.2 ORF5～7基因的擴(kuò)增與鑒定

對9個PRRSV流行毒株的ORF5～7基因擴(kuò)增結(jié)果見圖2,擴(kuò)增片段大小為1 629 bp,與預(yù)期結(jié)果一致。將這9個毒株分別命名為JLSY-08(吉林松源毒株2008年),HLJHRB-05(黑龍江哈爾濱毒株2005年),H LJMS-07(黑龍江佳木斯毒株2007年),LNCT-05(遼寧昌圖毒株2005年),HN-06(湖南毒株2006年),BJCP-08(北京昌平毒株2008年),HBDZ-07(河北定州毒株2007年),HLJHRB-09(黑龍江哈爾濱毒株2009年),HLJMS-10(黑龍江佳木斯毒株2010年)。

圖2 對9株P(guān)RRSV GP5～GP7基因RT-PCR擴(kuò)增Fig.2 The amplification ORF5-7 gene of Nine PRRSV isolates by RT-PCR

2.3 ORF5序列比較

將9個流行毒株的ORF5基因序列及編碼的氨基酸序列,9個毒株間的核苷酸序列同源性為95.0%～99.2%,氨基酸序列的同源性為92.0%～99.0%;這9個毒株與CH-1a、VR2332、HB-2和LV毒株的相應(yīng)序列比較,核苷酸序列的同源性依次為93.4%～95.5%、87.6%～89.4%、91.2%～92.7%、63.0%～64.0%;氨基酸序列的同源性依次為91.0%～94.0%、85.6%～88.6%、89.6%～92.0%、54.7%～58.2%(表3)。

表3 對9株P(guān)RRSV ORF5核苷酸和氨基酸序列同源性比較Table 3 Alignment nucleotide and amino acid sequences of ORF5 gene of nine PRRSV isolates

2.4 ORF5遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建與分析

這9個流行毒株與下載的國內(nèi)不同年代、地域的毒株比較,建立遺傳進(jìn)化樹(圖3),圖中方框為本研究的9個毒株,黑圓點代表參考毒株,黑方塊代表疫苗毒株。結(jié)果明顯分為2個亞群(SG1和SG2),2個亞群之間的氨基酸同源性為89%,各亞群內(nèi)毒株之間的氨基酸同源性達(dá)100%。有研究證實,SG1中毒株的中和表位變異程度較高[14]。本研究中的9個毒株均屬于SG1,屬于中和表位高變毒株。

2.5 GP5糖基化位點比較

對9個毒株GP5蛋白潛在糖基化位點與數(shù)目分析,5個糖基化位點有3株,4個糖基化位點有5株,3個糖基化位點有1株;糖基化位點分布在30位～55位點氨基酸之間,以44、55位點比較保守,其他3個位點變異幅度較大。有研究報道,GP5蛋白的糖基化與病毒毒力及中和抗體表位有關(guān)[8],表明我國流行的PRRSV毒株變異幅度較大,GP5糖基化位點不同可能與毒力存在一定的聯(lián)系。糖基化位點分布統(tǒng)計結(jié)果見表4。

2.6 GP5蛋白抗原表位比較

用DNA Star中的MegAlign軟件對PRRSV GP5抗原表位分析結(jié)果見圖4,病毒中和表位37位～44位氨基酸中存在變異,9個流行毒株與CH-1a、VR2332、HB-2和LV株比較,中和表位39位的苯丙氨酸或亮氨酸變?yōu)楫惲涟彼醷(F/L)39→I39}。此外,有1株(LNCT-05)誘騙表位(27位～30位氨基酸)的28位的亮氨酸變?yōu)楦彼?L28→P28)。

圖3 9個PRRSV流行毒株與GenBank下載的其他毒株ORF5序列繪制的遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of nine PRRSV isolates and other strains from GenBank based on ORF5 sequences

表4 9個PRRSV流行毒株GP5蛋白糖基化位點數(shù)目及分布Table 4 GP5 protein gly cosylation sites of nine P RSSV isolates

圖4 9個PRRSV流行毒株與GenBank下載的參考毒株的GP5抗原表位預(yù)測分析Fig.4 Analysis and forecast of GP5 protein epitopes of nine PRRSV isolates and other strains from GenBank

3 討論

自1996年郭寶清等首次在我國分離到PRRSV(Ch-1a)以來,幾乎每年都有PRRS疫情出現(xiàn),2006年我國南方江西、湖南、湖北等省暴發(fā)了高致病性豬藍(lán)耳病,證明由PRRSV變異株引起的。有報道證實,暴發(fā)過PRRS的省份于2007年又發(fā)生了同樣疫情,如湖南、北京、河北、廣東、遼寧等[15],2010年吉林的部分豬場也有高致病性PRRSV的感染[16]。表明PRRSV具有高變異特性,能夠逃避機(jī)體的免疫清除作用,使豬群長期帶毒,呈持續(xù)性感染。

對2005年—2010年間9個PRRSV流行株ORF5基因進(jìn)行了序列測定,與CH-1a、VR2332、HB-2、LV株的進(jìn)行了同源性比較,這9個流行毒株ORF5變異明顯,仍屬于美洲型。9個流行毒株與CH-1a株同源更高,有可能為其演化而至。9個流行毒株的GP5蛋白糖基化位點以5、4、3模式,其中以5和4個位為主流。有研究證實,GP5蛋白的糖基化與病毒感染細(xì)胞的能力密切相關(guān),將44位和51位天冬酰胺(N44和N51)突變后,病毒不再具有感染細(xì)胞的能力[17]。還有研究表明,N44糖鏈和其前一個N糖鏈之間正好是病毒的中和表位,由于存在空間位阻作用而影響中和抗體對中和表位的有效識別,從而降低了中和抗體的中和作用,使病毒逃避了機(jī)體的免疫保護(hù)[14]。相關(guān)研究指出,有些動物病毒的毒力隨著其結(jié)構(gòu)蛋白N糖基化位點的增多而增強(qiáng),如馬傳染性貧血病毒、猴免疫缺陷病毒等[18-21]。9個流行毒株的GP5的潛在糖基化位點數(shù)目,與經(jīng)典毒株有增加趨勢,表明我國流行毒株的毒力較強(qiáng)。GP5糖基化位點集中在N44糖鏈的前面鄰近區(qū)域,對中和抗體識別抗原表位增加了空間位阻,阻礙了中和抗體對病毒的中和作用,進(jìn)而表現(xiàn)出病毒的毒力增強(qiáng)效應(yīng)。

對9個流行毒株GP5蛋白氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),這些毒株的病毒中和表位中,39位氨基酸均有變異[(F/L)39→I39],這一點與安同慶等[14]報道一致,說明病毒的中和表位存在著變異,有利于病毒逃避機(jī)體的免疫。在GP5蛋白中和表位37位～41位氨基酸序列[S37(F/L)QLIYN]上游存在一個誘騙表位[(A/V)27LVN],這個表位可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的非中和抗體,延遲中和抗體的產(chǎn)生,其延遲效應(yīng)能達(dá)3周以上[22]。本研究中的LNCT-05流行毒株的誘騙表位28位氨基酸發(fā)生突變[L28→P28],這種變化使誘騙表位與中和表位之間增加了復(fù)雜性,可能更有利于病毒的逃逸,但仍需要試驗證據(jù)。

這9個流行毒株的ORF5序列與我國其他分離毒株、以及2個國外參考毒株[VR2332、LV]和3個疫苗毒株的序列進(jìn)行了比較,9個流行毒株都屬于PRRSV美洲型基因I群。安同慶等[14]對1996年—2006年中國大陸的42個分離株的ORF5基因序列發(fā)現(xiàn),各分離株基因變異較大,分別屬于2個不同的亞群。9個流行毒株與國外的3個疫苗株關(guān)系較遠(yuǎn),提示國外的疫苗免疫效果可能有限。

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