高血壓患者外周血白細胞端粒長度的變化

解麗艷 王云英 溫成泉 張七一 (青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266011)

原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是一種由遺傳因素與環(huán)境因素共同作用而引起的多基因遺傳性疾病，隨著高血壓遺傳學(xué)的研究進展，人們發(fā)現(xiàn)端粒損耗特別是染色體的丟失會導(dǎo)致基因不穩(wěn)定，端粒長度隨年齡改變將會影響年齡依賴性高血壓相關(guān)基因的表達，端粒損耗可能參與高血壓發(fā)生發(fā)展的病理過程，白細胞端?？s短可能是高血壓患者易患動脈粥樣硬化的危險因素之一。因此，本文擬探討高血壓患者白細胞端粒長度的變化及與高血壓相關(guān)危險因素的關(guān)系，以期進一步了解高血壓致動脈粥樣硬化的病理機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 根據(jù)2005年《中國高血壓防治指南》診斷標準:收縮壓(SBP)≥140 mmHg或舒張壓(DBP)≥90 mmHg或正在服用降壓藥物者，選取高血壓患者162例，男84例，女78例，平均年齡(71.0±6.3)歲。同時選擇年齡、性別相匹配的健康對照者112例，男59例，女53例，平均年齡(70.8±5.5)歲。兩組入選對象均來自青島地區(qū)漢族人群，無血緣關(guān)系，排除繼發(fā)性高血壓、嚴重急慢性感染、心力衰竭、支氣管哮喘、自身免疫病及腫瘤患者。

1.2 研究方法

1.2.1 頸動脈超聲 應(yīng)用美國GE-vivid5型彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率5.0～10.0 MHz，由專人進行測量。血管內(nèi)徑測定:測量頸總動脈分叉近段1.5 cm處的內(nèi)徑，于心室收縮期及舒張期末期分別測量頸總動脈前壁中膜-外膜交界區(qū)與后壁內(nèi)膜-血管腔交界區(qū)的垂直距離，每次測量3個心動周期，取其平均值。根據(jù)收縮期血管內(nèi)徑(Ds)和舒張期血管內(nèi)徑(Dd)計算橫斷面膨脹系數(shù)(cross-sectional distensibility coefficient，CSDC)和硬化參數(shù)(stiffness parameter)β。CSDC計算公式為:CSDC=(Ds2-Dd2)/Dd2×(SBP-DBP);硬化參數(shù)β=㏑(SBP/DBP)/〔(Ds-Dd)/Dd〕。

1.2.2 外周血白細胞端粒長度測定 抽取空腹外周靜脈血3 ml，-80℃保存。統(tǒng)一提取基因組DNA?；蚪MDNA提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司(產(chǎn)品編號:W6531)，嚴格按照說明書操作。紫外分光光度儀檢測提取DNA的濃度及純度，OD260/280≥1.8為合格，用于測定端粒長度。應(yīng)用LightCycler2.0(Roche，Mannheim，Germany)熒光定量 PCR 儀擴增端粒和單拷貝基因36B4。測出端粒重復(fù)序列的拷貝數(shù)(telomere repeat copy number)與單拷貝基因拷貝數(shù)(single copy gene copy number)的比值(T/C)，該值與端粒的平均長度成線性相關(guān)〔1〕，從而得出相對端粒長度。端粒及36B4引物序列分別為:端粒:前向 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3';反向 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3';36B4:前向5'-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3';反 向 5'-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3'。反應(yīng)體系為:LightCycler?Fast-Start Reaction MixSYBR GreenⅠ，10 × conc.(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)10 μl，MgCl23 mmol/L，引物各0.15μmol/L，尿嘧啶 DNA糖基酶(UNG)0.1 U。反應(yīng)條件為:37℃ 120 s激活 UNG，95℃ 10 min滅活UNG同時激活FastStart酶，端粒擴增條件為:95℃ 5 s，63℃5 s，72℃ 20 s，30 個循環(huán)，退火轉(zhuǎn)換速率為 4℃ /s。基因 36B4擴增條件為:95℃ 5 s，58℃ 10 s，72℃ 40 s。共30 個循環(huán)，退火轉(zhuǎn)換速率為20℃/s。用倍比稀釋的標準品(標準品濃度5～80 ng)進行PCR擴增，根據(jù)Ct值建立標準曲線。在PCR過程中設(shè)立無模板陰性對照(no templates control，NTC)。在實驗結(jié)束后進行融解曲線分析，以鑒定產(chǎn)物是否單一。相對端粒長度的計算方法參照曹東維和Brouilette方法執(zhí)行〔2，3〕，所得相對端粒長度與Southern印跡方法的結(jié)果一致〔4，5〕。

1.2.3 血脂、血糖檢測 采用酶法測定血漿總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平;直接測定法測定血漿高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平;雙波長免疫透射比濁法測定血漿載脂蛋白 A1(ApoA1)、載脂蛋白 B(ApoB)水平;己糖激酶法測定空腹血糖(FPG)水平，以上所有項目均在日立7170自動生化分析儀上測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以±s表示。兩組計量資料的比較采用t檢驗;計數(shù)資料采用χ2檢驗;端粒長度比值在統(tǒng)計學(xué)分析時進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，其與各參數(shù)間的相關(guān)關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析或偏相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線和融解曲線 在退火溫度升至63℃、退火及延伸時間分別降至5 s和20 s的情況下，端粒和基因36B4的標準曲線斜率分別是-3.693和-3.520(見圖1)，反應(yīng)效率分別是1.87和1.92。融解曲線未發(fā)現(xiàn)非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)(見圖2)。

圖1 端粒及36B4的標準曲線

2.2 研究對象的一般資料 高血壓組與對照組之間性別、年齡、飲酒史無顯著性差異 (P＞0.05)。高血壓組的BMⅠ、SBP、DBP、TC、TG和LDL均顯著高于對照組(P＜0.01);而HDL明顯低于對照組(P＜0.01)。高血壓組CSDC顯著低于對照組(P＜0.01)，而硬化參數(shù)β顯著高于對照組(P＜0.05)。吸煙史、高血壓家族史兩組之間有顯著性差異(P＜0.01)。兩組間的FPG、ApoA1和 ApoB水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。見表1。

2.3 外周血白細胞相對端粒長度的變化 275例研究對象的相對端粒長度參照相關(guān)文獻〔3，6〕進行對數(shù)轉(zhuǎn)換。轉(zhuǎn)換后的端粒長度比值與年齡呈顯著負相關(guān)(r=-0.345，P＜0.001)，高血壓組和對照組的相關(guān)系數(shù)分別為:-0.306(r2=0.094，95%CI-0.020 ～ -0.007，P ＜0.001)和 -0.357(r2=0.127，95%CI-0.024～-0.008，P＜0.001)。高血壓組和對照組的相對端粒長度比較有顯著性差異，高血壓組較對照組顯著縮短(P＜0.01)。兩組端粒長度比值經(jīng)年齡校正后與CSDC呈顯著正相關(guān);與硬化參數(shù)β呈顯著負相關(guān);偏相關(guān)系數(shù)分別為0.286(r2=0.094，P ＜0.001)和 -0.126(r2=0.016，P=0.037)。高血壓組端粒長度比值與CSDC的相關(guān)性較對照組弱，高血壓組和對照組偏相關(guān)系數(shù)分別為0.133(P=0.045)和0.406(P＜0.001);兩組端粒長度比值與硬化參數(shù)β的相關(guān)性相似。但兩組端粒長度比值經(jīng)年齡校正后與ApoA1、ApoB、HDL、LDL和TC的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

圖2 端粒及36B4的融解曲線

表1 研究對象的端粒長度和各生化指標比較

圖3 高血壓組和對照組端粒長度比值與年齡、CSDC及硬化參數(shù)β的關(guān)系

3 討論

端粒是位于真核細胞染色體兩端一段特殊的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，由短串聯(lián)重復(fù)序列(TTAGGG)n和與之相連的端粒結(jié)合蛋白組成。人端粒是以5'-TTAGGG-3'為重復(fù)單位的富含鳥苷酸的序列，具有保護末端免于降解，防止染色體斷裂、融合、重組和丟失，維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的功能。出生時新生兒的端粒長度無性別差異，并且新生兒外周血白細胞、臍血和皮膚成纖維細胞的端粒長度高度一致。人類精子端粒長度約為15 kb;外周血細胞端粒長約7 000～10 000 bp;端粒平均長度為5～15 kb。成人端粒長度的變化是一個慢性損耗過程，是遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。與年齡相關(guān)的高血壓是遺傳易感性與環(huán)境因素相互作用的異質(zhì)性疾病，因此，端粒長度的變化很可能與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文對163例高血壓患者和112例健康對照者端粒長度的研究結(jié)果顯示:高血壓組外周血白細胞相對端粒長度(T/S比值)較對照組明顯縮短，且與年齡呈顯著負相關(guān)，表明高血壓患者存在端粒長度過度耗損;或者隨著年齡增長端粒長度耗損可能是高血壓發(fā)病的危險因素之一。此結(jié)果與 Huzen〔7〕和 Brouilette〔3〕的研究結(jié)果一致。

高血壓是動脈粥樣硬化的一個主要危險因素。有學(xué)者觀察到，高血壓患者血白細胞中端粒長度縮短程度與動脈粥樣硬化程度顯著相關(guān)〔8〕，高血壓伴頸動脈粥樣斑塊形成者較無斑塊者端粒長度顯著縮短〔9〕。本研究結(jié)果也顯示:高血壓組外周血白細胞相對端粒長度與CSDC呈正相關(guān)，與頸動脈硬化參數(shù)β呈負相關(guān)，提示端粒長度縮短與高血壓患者動脈彈性有關(guān)。端粒長度的變化可能是生物血管齡的標志之一，它反映了動脈系統(tǒng)伴隨年齡的衰老過程，端粒耗損可能參與這一高血壓動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程。動脈粥樣硬化是一個多因子參與的復(fù)雜病理過程，主要危險因素包括年齡、血脂異常、血壓、吸煙、糖尿病和糖耐量異常等。盡管研究表明端粒功能失調(diào)與上述因素密切相關(guān)，本研究也顯示，端粒參與高血壓動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程，但其病理過程目前尚不清楚。有研究表明，端粒長度與高血壓血管內(nèi)皮炎癥〔10〕、氧化應(yīng)激〔11〕、高半胱氨酸血癥〔12〕、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)〔13〕、葉酸代謝〔14〕等有關(guān)。炎癥反應(yīng)可造成DNA損傷，DNA斷裂片段堆積降低了DNA的修復(fù)效率，致端粒耗損加速〔15〕。用高半胱氨酸誘導(dǎo)內(nèi)皮培養(yǎng)細胞加速衰老，發(fā)現(xiàn)高半胱氨酸慢性刺激形成的慢性氧化壓力增加了細胞間黏附分子-1(ⅠCAM-1)和Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制因子(PAⅠ-1)的表達水平，使端粒長度的損失量增加，致端?？s短，進一步加速內(nèi)皮細胞衰老導(dǎo)致的動脈硬化，提示端?？s短可能為氧化損傷學(xué)說與動脈粥樣硬化之間提供了一種鏈接〔12〕。ox-LDL和葉酸代謝也分別通過影響端粒酶活性〔13〕和DNA甲基化而影響端粒長度〔14〕。但在本研究中，兩組端粒長度比值與ApoA1、ApoB、HDL、LDL和TC的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義，該結(jié)果與Brouilette等的研究結(jié)果一致〔3〕。脂質(zhì)代謝紊亂是一個復(fù)雜的過程，任何單一指標很難全面反映代謝狀態(tài)。而動脈彈性改變往往是長期的動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的結(jié)果，是血管內(nèi)皮功能、動脈血流切應(yīng)力改變、脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激等引起血管病變后期的表現(xiàn)，在本研究中，動脈彈性指標與端粒長度相關(guān)，且其相關(guān)性在對照組較高血壓組更好，表明端粒長度與動脈彈性的關(guān)系可能有一定的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，二者的關(guān)系尚需更多的研究加以證實。

1 Gil ME，Coetzer TL.Real-time quantitative PCR of telomere length〔J〕.Mol Biotechnol，2004;27:169-72.

2 曹東維.定量聚合酶鏈反應(yīng)對系膜細胞端粒長度的測定研究〔J〕.南通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2006;2:108-10.

3 Brouilette SW，Moore JS，McMahon AD，et al.Telomere length，risk of coronary heart disease，and statin treatment in the West of Scotland primary prevention study:a nested case-control study〔J〕.Lancet，2007;369:107-14.

4 Epel ES，Blackburn EH，Lin J，et al.Accelerated telomere shortening in response to life stress〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA，2004;101:17312-5.

5 Grabowski P，Aleskog A，Thunberg U，et al.Telomere length as a prognostic parameter in chronic lymphocytic leukemia with special reference to VH gene mutation status〔J〕.Blood，2005;105:4807-12.

6 Zee RY，Michaud SE，Germer S，et al.Association of shorter mean telomere length with risk of incident myocardial infarction:A prospective，nested case-control approach〔J〕.Clin Chim Acta，2009;403:139-41.

7 Huzen J，de Boer RA，van Veldhuisen DJ，et al.The emerging role of telomere biology in cardiovascular disease〔J〕.Front Biosci，2010;15:35-45.

8 Benetos A，Gardner JP，Zureik M，et al.Short telomeres are associated with increased carotid atherosclerosis in hypertensive subjects〔J〕.Hypertension，2004;43:182-5.

9 Urbanek K，Torella D，Sheikh F，et al.Myocardial regeneration by activation of multipotent cardiac stem cells in ischemic heart failure〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA，2005;102:8692-7.

10 Carrero JJ，Stenvinkel P，F(xiàn)ellstr?m B，et al.Telomere attrition is associat-ed with inflammation，low fetuin-A levels and high mortality in prevalent haemodialysis patients〔J〕.Ⅰnt Med，2008;263:302-12.

11 Voghel G，Thorin-Trescases N，F(xiàn)arhat N，et al.Cellular senescence in endothelial cells from atherosclerotic patients is accelerated by oxidative stress associated with cardiovascular risk factors〔J〕.Mech Ageing Dev，2007;128:662-71.

12 Xu D，Neville R，F(xiàn)inkel T.Homocysteine accelerates endothelial cell senescence〔J〕.FEBSletters，2000;470:20-4.

13 Tsirpanlis G，Chatzipanagiotou S，Boufidou F，et al.Serum oxidized lowdensity lipoprotein is inversely correlated to telomerase activity in peripheral blood mononuclear cells of haemodialysis patients〔J〕.Nephrology(Carlton)，2006;11:506-9.

14 Paul L，Cattaneo M，D'Angelo A，et al.Telomere length in peripheral blood mononuclear cells is associated with folate status in men〔J〕.JNutr，2009;139:1273-8

15 Wang C，Jurk D，Maddick M，et al.DNA damage response and cellular senescence in tissues of aging mice〔J〕.Aging Cell，2009;8:311-23.