補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)在腦缺血/再灌注炎癥損傷中的作用

鮮盡紅，何 莉，汪正清

缺血性腦血管病的發(fā)病率、致殘率和病死率都很高，嚴(yán)重危害人類的健康。大腦短暫缺血后，恢復(fù)血供時(shí)會(huì)觸發(fā)一個(gè)強(qiáng)烈的炎癥應(yīng)答，引起腦組織繼缺血后的第2次損傷，即腦缺血/再灌注(ischemia and reperfusion，I/R)損傷。興奮氨基酸中毒、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基及其脂質(zhì)過氧化、炎癥反應(yīng)等在腦缺血的病理生理過程中發(fā)揮著重要的作用。補(bǔ)體作為炎癥反應(yīng)的重要組成部分日益受到重視。研究認(rèn)為，補(bǔ)體系統(tǒng)過度激活的炎癥效應(yīng)片段是腦內(nèi)炎癥反應(yīng)損傷的主要始動(dòng)因素之一［1、2］。腦I/R后補(bǔ)體系統(tǒng)被過度激活，導(dǎo)致白細(xì)胞大量聚集和激活，組織和血管嚴(yán)重?fù)p傷。雖然腦I/R損傷的發(fā)病機(jī)制還不十分明確，但許多實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)與I/R損傷有直接關(guān)系。

1 腦內(nèi)補(bǔ)體表達(dá)

1．1 腦內(nèi)補(bǔ)體合成 一般認(rèn)為，腦組織是免疫特惠區(qū)，血-腦脊液屏障將腦組織與血液分開，阻止了常規(guī)淋巴細(xì)胞再循環(huán)，限制了大分子物質(zhì)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)和腦脊液。因此，很少或沒有血漿成分進(jìn)入腦組織。腦內(nèi)補(bǔ)體主要由星形細(xì)胞合成。1987年Levi-Strauss首次證明了腦細(xì)胞能合成補(bǔ)體成分。近年來的研究表明［3］，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)能夠合成包括補(bǔ)體、補(bǔ)體調(diào)控分子及補(bǔ)體受體在內(nèi)的完整的補(bǔ)體系統(tǒng)。人類星形細(xì)胞株在細(xì)胞因子的刺激下能表達(dá)和分泌補(bǔ)體的絕大部分成分，且星形細(xì)胞還能合成細(xì)胞因子，通過自分泌形式調(diào)控腦內(nèi)補(bǔ)體合成。另外，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元均有合成補(bǔ)體的功能［4］。這些研究結(jié)果表明腦組織可以合成完整的補(bǔ)體系統(tǒng)。

1．2 血液補(bǔ)體成分進(jìn)入腦內(nèi) 血-腦脊液屏障由腦內(nèi)毛細(xì)血管和小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)合的基膜細(xì)胞組成，具有一定的通透性。腦某些區(qū)域(如丘腦正中隆起、垂體、松果體和延髓最后區(qū)等)缺乏構(gòu)成血-腦脊液屏障的血管內(nèi)皮細(xì)胞層、基底膜和星形細(xì)胞終足，由有孔的毛細(xì)血管組成，其解剖特點(diǎn)決定血液中的補(bǔ)體成分可能在生理情況下進(jìn)入腦內(nèi)，但其非腦內(nèi)補(bǔ)體的主要來源。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腦缺血后腦實(shí)質(zhì)內(nèi)存在補(bǔ)體成分，主要是由于腦血流減少時(shí)腦內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，血腦屏障通透性改變，血液中的補(bǔ)體向腦內(nèi)滲漏所致;再灌注時(shí)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)的中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞也可合成補(bǔ)體。

2 腦內(nèi)補(bǔ)體的激活

正常情況下，腦內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活和抑制處于平衡狀態(tài)。補(bǔ)體通過3條途徑激活，即經(jīng)典途徑、旁路途徑和甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)途徑。生理情況下，腦內(nèi)細(xì)胞(如星形細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞)能分泌抑制物，使腦內(nèi)補(bǔ)體處于平衡狀態(tài)。腦缺血時(shí)，缺血區(qū)pH值和離子濃度改變使細(xì)胞表面補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子減少或缺失，導(dǎo)致C3/C5轉(zhuǎn)化酶活性增高，補(bǔ)體激活增加，腦內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞被破壞，引起MBL沉積，經(jīng)MBL途徑激活補(bǔ)體［5］。血漿與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的抗原物質(zhì)(如髓鞘等)接觸，形成抗原抗體復(fù)合物，通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體［6］。腦缺血變性壞死的組織細(xì)胞、變性的蛋白聚集物、受損組織釋放的蛋白水解酶、缺血壞死后釋放的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(如線粒體)、血腫液中的紅細(xì)胞溶解等能經(jīng)旁路途徑直接激活補(bǔ)體［7］。旁路途徑在I/R損傷中起重要作用，它是腦缺血時(shí)補(bǔ)體激活的重要放大機(jī)制。由此可見，腦I/R發(fā)生后，3種補(bǔ)體激活途徑先后都被不同程度的激活，補(bǔ)體在腦內(nèi)過度活化，導(dǎo)致微血管損傷和神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡［8］。

3 腦內(nèi)補(bǔ)體激活導(dǎo)致腦損傷的機(jī)制

在腦I/R中，補(bǔ)體系統(tǒng)活化產(chǎn)物通過直接或間接的方式介導(dǎo)組織損傷。直接損傷是激活的補(bǔ)體固有成分作用的結(jié)果，間接損傷是由活化的補(bǔ)體成分觸發(fā)的一系列中間反應(yīng)造成的損傷［9］。

3．1 補(bǔ)體C1q C1q是補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑的關(guān)鍵起始因子。研究人員制作小鼠的大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型，發(fā)現(xiàn)在I/R后，手術(shù)一側(cè)的大腦皮層神經(jīng)元在mRNA水平上表達(dá)C1q，而在對側(cè)幾乎看不到表達(dá)，實(shí)驗(yàn)對照組則完全沒有表達(dá)。Van等［10］通過一個(gè)持續(xù)的MCAO模型，應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法檢測到缺血側(cè)大腦皮層有C1qB和C4mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)在缺血時(shí)能在系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生補(bǔ)體成分。同時(shí)作者認(rèn)為，局部的補(bǔ)體激活可能促成了第2次腦損傷。

3．2 補(bǔ)體C3a和和補(bǔ)體C5a 補(bǔ)體激活產(chǎn)生大量過敏毒素C3a和C5a，促進(jìn)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放炎癥遞質(zhì)組胺，導(dǎo)致血管通透性增加，破壞血-腦脊液屏障;C3a和C5a還是有效的趨化因子，能夠吸引白細(xì)胞聚集，大量白細(xì)胞在微血管內(nèi)皮局部聚集，穿過內(nèi)皮細(xì)胞，釋放溶酶體酶，使組織蛋白水解，產(chǎn)生自由基和不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，破壞血-腦脊液屏障。Nishino等［11］建立了一個(gè)大鼠大腦I/R模型，用免疫組織化學(xué)染色的方法證明了在缺血再灌注1天和3天后腦缺血的核心區(qū)有補(bǔ)體成分C3和IgG的存在。由此，作者認(rèn)為在短暫的缺血后，再灌注會(huì)引起血-腦脊液屏障的損傷，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對抗炎癥的機(jī)制受到破壞。C3a和C5a還可引起巨噬細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、前列腺素和白細(xì)胞三烯，并上調(diào)黏附分子(ICAM)和E-選擇素(E-selectin)。而TNF-α能增加基質(zhì)金屬蛋白酶的含量，可使單核細(xì)胞表達(dá)組織因子，從而激活凝血級聯(lián)反應(yīng)，并產(chǎn)生凝血酶，凝血酶在腦出血早期腦水腫發(fā)生過程中起重要作用。C5a與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合后產(chǎn)生氧自由基，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，也可產(chǎn)生彈性蛋白酶以擾亂內(nèi)皮細(xì)胞間連接，改變血-腦脊液屏障的通透性，從而破壞屏障功能。體外研究證實(shí)，C5a對神經(jīng)細(xì)胞凋亡起直接神經(jīng)毒性作用，而腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡又可加重繼發(fā)性腦損害。

3．3 補(bǔ)體C5b-9(攻膜復(fù)體物)［C5b-9(MAC)］ 再灌注損傷中補(bǔ)體的最后共同途徑都是形成MAC。研究者提出，開始的局部缺血導(dǎo)致細(xì)胞丟失了在膜水平調(diào)節(jié)補(bǔ)體循環(huán)的能力，MAC在細(xì)胞膜上的沉積，最后會(huì)引起一系列急性缺血和血流較少的部位形成不可逆的損傷。此外，MAC在再灌注的上皮細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，這可能是MAC導(dǎo)致了內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。亞溶解濃度的MAC可能啟動(dòng)血液的凝固和內(nèi)皮的回縮，引起微血管衰竭和組織氧化損傷。MAC可直接插入細(xì)胞表面，形成雙向親水孔道，使Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)丟失，最終細(xì)胞發(fā)生滲透性溶解死亡。紅細(xì)胞溶解后釋放出血紅蛋白，后者具有神經(jīng)毒性，能引起腦水腫［12］。MAC可插入神經(jīng)元、星形細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和BBB破壞。MAC能破壞細(xì)胞膜，增加組織因子活性，從而激活外源性凝血途徑，導(dǎo)致凝血酶產(chǎn)生增加。MAC還可沉積于細(xì)胞膜，使細(xì)胞分泌組胺、細(xì)胞間黏附分子-1、E-選擇素、P-選擇素和血小板活化因子等引起細(xì)胞膜滲透性增加和細(xì)胞水腫 ，破壞血-腦脊液屏障，還可直接激活單核細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞因子、活性氧自由基和金屬基質(zhì)蛋白酶等的產(chǎn)生，引起遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，加劇炎癥反應(yīng)。Casarsa等［13］將有溶細(xì)胞活性的MAC注入大鼠側(cè)腦室，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射6小時(shí)后大鼠脈絡(luò)叢和腦膜血管白細(xì)胞滲出增多，細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)增加，腦脊液中性粒細(xì)胞趨化性蛋白-1和單核細(xì)胞趨化性蛋白-1水平增高，而且在腦室周圍和腦脊液中發(fā)現(xiàn)IL-1表達(dá)。這說明MAC可通過多種途徑導(dǎo)致炎癥損傷。

4 補(bǔ)體抑制劑在腦缺血再灌注中的應(yīng)用研究

通過大量的實(shí)驗(yàn)研究，越來越多的證據(jù)表明補(bǔ)體在大腦I/R損傷中起重要作用。因此，研究補(bǔ)體抑制劑以減輕I/R損傷，為臨床治療缺血性腦病帶來了新的策略。針對補(bǔ)體的激活途徑，目前補(bǔ)體抑制劑的研究主要有以下幾大類。

4．1 補(bǔ)體受體Ⅰ型(omplement receptor type 1，CR1)分子是C3b/C4b的受體，是一種單鏈的膜結(jié)合糖蛋白，分布于多種細(xì)胞表面，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)組成。在人群中最常見的基因型為F的CR1胞外區(qū)由30個(gè)短同源重復(fù)序列(short consensus repeat，SCR)組成，每7個(gè)SCR為1組，構(gòu)成4個(gè)長同源重復(fù)序列(LHRs)。LHR A中的前3個(gè)SCR組成有功能的位點(diǎn)Ⅰ，而LHR B和LHR C中的前3個(gè)SCR有3個(gè)氨基酸不同，但有相同的功能，都稱為位點(diǎn)Ⅱ。LHR-A中有一個(gè)C4b結(jié)合位點(diǎn)，LHR-B和LHR-C有C3b結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步研究證實(shí)［14］，C4b的結(jié)合殘基在SCR 1-3，C3b的結(jié)合殘基在SCR8-10或15-17?？扇苄匝a(bǔ)體受體Ⅰ型(sCR1)是CR1的胞外片段，功能性位點(diǎn)Ⅰ和位點(diǎn)Ⅱ都在 sCR1內(nèi)。Huang等［15］建立小鼠大腦缺血再灌注模型，并在術(shù)前給予sCR1治療。研究表明，在sCR1治療組，小鼠的神經(jīng)損傷顯著減輕，中性粒細(xì)胞和血小板的聚集減少，梗死面積也有減小的趨勢。它作為一個(gè)高效的補(bǔ)體抑制劑備受關(guān)注。

4．2 C5a單克隆抗體 抗C5a的單克隆抗體可以特異性地抑制C5裂解成C5a和C5b-9，阻止這些促炎反應(yīng)遞質(zhì)的增加。在大鼠MCAO動(dòng)物模型上顯示［16］，抗C5a單克隆抗體組較對照組腦梗死面積減小，水腫減輕，中性粒細(xì)胞聚集降低，并且運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)功能學(xué)評分明顯提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗C5a單克隆抗體能夠減輕腦缺血再灌注引起的損傷。

4．3 C1酯酶抑制劑(C1-INH)C1-INH能共價(jià)結(jié)合補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑的絲氨酸蛋白酶C1s、C1r，MBL途經(jīng)中與絲氨酸蛋白酶1(MASP1)和絲氨酸蛋白酶2(MASP2)結(jié)合［17］。De Simoni等［18］在小鼠MCAO的模型上靜脈給予C1-INH后對神經(jīng)元有保護(hù)作用。在缺血48小時(shí)后，C1-INH能夠明顯減輕神經(jīng)元丟失，梗死面積減少。中性紅染色顯示對大腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體都有很好的保護(hù)作用。用CD45的免疫組織化學(xué)染色顯示，中性粒細(xì)胞浸潤明顯降低。以上顯示C1-INH在防治腦缺血再灌注損傷中治療價(jià)值。

4．4 眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)CVF是一種來源于眼鏡蛇毒性物質(zhì)的抗補(bǔ)體蛋白，可與B因子結(jié)合形成穩(wěn)定的C3/C5轉(zhuǎn)化酶，導(dǎo)致補(bǔ)體被快速和持續(xù)地消耗［19］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用CVF耗竭大鼠體內(nèi)的補(bǔ)體后向其腦內(nèi)注入自體動(dòng)脈血，2小時(shí)后血腫周圍腦組織TNF-α的產(chǎn)生減少，補(bǔ)體C3d、C5a、C9和中性粒細(xì)胞聚集的標(biāo)志——髓過氧化物酶(MPO)陽性細(xì)胞數(shù)均減少，4、72小時(shí)后補(bǔ)體沉積較對照組明顯減少，腦含水量顯著減少。實(shí)驗(yàn)提示，CVF是一個(gè)潛在的可以非特異性地抑制補(bǔ)體減輕I/R損傷。

5 小結(jié)

腦缺血再灌注后補(bǔ)體系統(tǒng)通過缺血后變性壞死的組織細(xì)胞等經(jīng)旁路途徑直接激活補(bǔ)體，但也可經(jīng)經(jīng)典和MBL途徑不同程度地被激活。補(bǔ)體系統(tǒng)激活產(chǎn)物C3a、C4a、C5a和C5b－9等在腦缺血再灌注炎癥損傷中起主要作用，其作用機(jī)制尚不完全清楚。目前抗補(bǔ)體的藥物雖多，但尚無一種人工抑制補(bǔ)體制劑在特異性和有效性方面能滿足臨床應(yīng)用的要求。所以，尋求新的的治療策略是亟待攻克的重要課題。CR1、C1-INH等補(bǔ)體抑制劑具有較好的抑制補(bǔ)體效果，但距離真正應(yīng)用到臨床尚有一定的距離，其中還有不少的問題需要解決。但可以相信特異性補(bǔ)體抑制劑的研究將會(huì)為腦缺血再灌注損傷等多種相關(guān)性疾病的治療提供一條新的途徑。

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