樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及在移植中應(yīng)用的研究進(jìn)展

鄒林洪綜述,王豫蓉審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科 400015)

樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)由Steinman和Cohn[1]于1973年首次在小鼠脾淋巴結(jié)中分離出來,因在體內(nèi)成熟時細(xì)胞表面伸出樹突樣或偽足樣突起而得名,是目前已知的專職抗原提呈細(xì)胞[2],能夠激活初始T細(xì)胞。有研究表明DC在免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用[3],在移植免疫中起著雙向作用。一方面,DC向受體T細(xì)胞提呈供體抗原以及激活信號,誘導(dǎo)排斥反應(yīng)的發(fā)生;另一方面,某些DC具有免疫調(diào)節(jié)作用,誘導(dǎo)機體對自體和外來抗原免疫耐受的發(fā)生。因此,利用DC的免疫調(diào)節(jié)作用誘導(dǎo)特異性的免疫耐受已成為當(dāng)前移植領(lǐng)域的研究熱點之一。Steinman和Banchereau[4]研究表明DC的免疫功能與細(xì)胞成熟與否有關(guān),成熟DC啟動免疫排斥反應(yīng),未成熟DC誘導(dǎo)免疫耐受。DC存在體內(nèi)的部位較多,但數(shù)量有限,目前尚不能直接從組織中大量分離獲得,需要進(jìn)行培養(yǎng)擴增并純化才能滿足應(yīng)用的需要。因此,如何培養(yǎng)獲得大量且純度更高的DC是進(jìn)行各種研究的前提,是目前研究的重點之一。

目前,已能利用小鼠、大鼠和人的多種組織進(jìn)行DC的體外培養(yǎng),在基礎(chǔ)實驗中以小鼠和大鼠DC的培養(yǎng)研究最常見?，F(xiàn)將對DC體外培養(yǎng)的取材來源、培養(yǎng)方法、鑒定方法及在器官移植中應(yīng)用的研究進(jìn)展綜述如下。

1 DC培養(yǎng)的取材來源

1.1 小鼠

1.1.1 骨髓 最早開始用于體外培養(yǎng)DC的動物是小鼠。DC是由骨髓干細(xì)胞分化而來,因而用于培養(yǎng)小鼠DC的組織來源主要是骨髓,也是目前動物體外培養(yǎng)DC最常見的來源。骨髓中含有大量的CD34+造血干細(xì)胞,可在細(xì)胞因子的刺激下誘導(dǎo)產(chǎn)生一定數(shù)量及質(zhì)量的DC。常采用的方法是取出小鼠四肢的股骨和脛骨[5],用RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗出骨髓腔內(nèi)的骨髓及髓內(nèi)細(xì)胞,分離得到CD34+造血干細(xì)胞后進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.1.2 脾臟 1973年DC首次由 Steinman和Cohn[1]從小鼠脾臟中分離而來。他們先利用酶消化脾臟,再通過梯度密度離心過濾懸浮細(xì)胞,經(jīng)過短時間貼壁后,培養(yǎng)過夜進(jìn)行分離,可以得到一定數(shù)量的DC。Yao等[6]將小鼠脾臟消化培養(yǎng)獲得了大于90%純度和95%生存能力的DC。Huber等[7]也用小鼠脾臟成功培養(yǎng)出DC。

1.1.3 淋巴結(jié) 從各種淋巴結(jié)收集培養(yǎng)DC是另外一個獲得DC有效的方法,Clare-Salzler和Mullen[8]將小鼠斷頸處死,將淋巴結(jié)無菌分離,切碎制備細(xì)胞懸浮液,再進(jìn)行分離培養(yǎng),可以獲得大量70%～90%純度的DC。胰腺淋巴結(jié)(PLN)、腘窩引流淋巴結(jié)(PO-LNs)[9]、腸系膜淋巴結(jié)[10]均是小鼠DC培養(yǎng)的重要來源。

1.2 大鼠

1.2.1 骨髓 骨髓來源的DC是大鼠DC培養(yǎng)研究的重要途徑。1982年Klinkert等[11]首次利用伴刀豆球蛋白A處理的脾細(xì)胞上清液來刺激低密度的大鼠骨髓前體細(xì)胞而獲得大鼠骨髓來源的DC。此后,不斷有研究報道成功從骨髓細(xì)胞培養(yǎng)獲取大鼠骨髓來源DC,但是產(chǎn)量均較低。隨著研究的深入,在利用重組大鼠GM-CSF的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用重組大鼠IL-4和IL-10等細(xì)胞因子,使大鼠骨髓來源的DC的產(chǎn)量有了顯著提高,現(xiàn)在每只大鼠可獲得具有典型特征的 DC約1×107個,采用免疫分選法可使其純度達(dá)90%以上。在實驗研究中,其骨髓采集容易,易于培養(yǎng)、擴增,費用相對便宜。因此,從大鼠骨髓中分離誘導(dǎo)培養(yǎng)DC是許多學(xué)者主要的選擇方法。

1.2.2 脾臟 脾臟是一個重要的免疫器官,DC在脾臟中參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[12]。大鼠脾臟來源DC的收集培養(yǎng)同小鼠一樣也多采取消化過濾的方法[13],可獲得較高純度的DC。大鼠的脾臟DC可以分為3種形態(tài)和表型不同的亞型:CD4+、CD4-、類漿細(xì)胞[14]。最近研究表明未培養(yǎng)過夜而分離的脾臟DC較按常規(guī)方法培養(yǎng)的DC表現(xiàn)出更多未成熟DC的典型特征[15]。

1.2.3 淋巴結(jié) Matsuno等[16]直接通過周圍淋巴結(jié)或中樞淋巴管收集DC,是在最接近生理條件狀況下收集得到80%～90%純度的DC,其生存能力達(dá)到95%以上,更具備DC本身的活性。

1.2.4 外周血 有研究指出DC的含量在大鼠外周血中小于0.1%[17],大鼠外周血DC的培養(yǎng)一般是采取大鼠的髂外靜脈血進(jìn)行培養(yǎng)。有報道指出臍帶血和外周血來源的DC不能用于免疫正常動物的體內(nèi)研究,而只能用于免疫缺陷動物的體內(nèi)研究[18]。因而有學(xué)者建議用外周血來源的DC進(jìn)行免疫缺陷的治療,但這一特性也縮小了對外周血來源DC研究應(yīng)用的范圍。

1.3 人類

1.3.1 臍帶血 臍帶血是DC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的一個重要來源,是目前DC培養(yǎng)研究的熱點之一[19-20]。臍帶血一般用于對人類DC培養(yǎng)的相關(guān)研究[21]。臍帶血中含有較多的CD34+造血干細(xì)胞,其來源廣泛,培養(yǎng)相對方便,具有較好的組織相容性。常采取新生胎兒臍帶血,離心后加入細(xì)胞因子定向誘導(dǎo)DC的生成。

1.3.2 外周血 大量的基礎(chǔ)研究證實通過細(xì)胞因子可以將人類外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行分離誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC[22]。外周血來源廣泛,采集方法簡單、方便,不易污染。但此方法存在以下缺點:(1)外周血中DC量相對骨髓中較少;(2)對實驗人員的技術(shù)操作要求高,操作步驟相對較復(fù)雜,容易造成DC分離不純、丟棄過多或混入較多的雜質(zhì)。

2 DC的分離及培養(yǎng)方法

2.1 培養(yǎng)DC常用細(xì)胞因子的種類 目前用來誘導(dǎo)培養(yǎng)DC的細(xì)胞因子主要有粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)、核因子-κ B(NF-κ B)圈套寡核苷酸,脂多糖(LPS)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等。細(xì)胞因子的單獨或幾種聯(lián)合使用誘導(dǎo)擴增DC、是最常用的方法。其中GMCSF是最基本、最重要的細(xì)胞因子[23],有研究指出單獨使用低劑量的GM-CSF即可以培養(yǎng)出未成熟的DC。根據(jù)培養(yǎng)要求的不同常在使用GM-CSF的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他細(xì)胞因子進(jìn)行培養(yǎng),如 LPS、TNF-α、IFN-γ是比較常用的促DC 成熟的細(xì)胞因子,而 IL-4[24]、IL-10[25]、TGF-β[26]和 NF-κ B 圈套寡核苷酸則能抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,維持DC處于未成熟狀態(tài)。其中經(jīng)IL-10處理的DC可致T細(xì)胞無能或凋亡,有報道稱這些細(xì)胞可引起Th1向Th2的免疫偏離,TGF-β則不僅抑制DC成熟,還可增加DC的產(chǎn)量。這些細(xì)胞因子對DC的作用機制比較復(fù)雜,其效果與培養(yǎng)DC的組織來源和培養(yǎng)方法有密切的關(guān)系。

2.2 分離DC的方法

2.2.1 物理方法 亦稱“培養(yǎng)黏附法”,是根據(jù)DC和單核細(xì)胞的黏附性、密度大小等的不同進(jìn)行分離[15],培養(yǎng)一定時間后收集懸浮的細(xì)胞即為DC,DC純度達(dá)60%～80%。由于“培養(yǎng)黏附法”方法簡單,價格便宜,是目前最常用的獲取DC的方法?！芭囵B(yǎng)黏附法”最主要缺點是收集的DC常出現(xiàn)抗原標(biāo)志的改變,容易造成部分DC前體細(xì)胞的丟失從而使產(chǎn)量減少,且純度尚有待進(jìn)一步提高。

2.2.2 免疫分選法 亦稱“單抗法”,包括流式細(xì)胞術(shù)、磁性細(xì)胞分離術(shù)等,是以密度梯度離心法[27]配合以免疫磁珠清除法[28]或流式細(xì)胞術(shù)法,此法培養(yǎng)出的DC純度可達(dá)90%以上?！皢慰狗ā狈蛛x純度高,可保持DC原有特征,一些要求較高的實驗研究中常用“單抗法”來獲取DC,但單抗消耗量大,價格昂貴,如果單抗選用不當(dāng),很容易造成部分DC丟失。

2.3 DC的培養(yǎng)方法 最常見的是先將DC的前體細(xì)胞分離出來,然后再在細(xì)胞因子的作用下誘導(dǎo)分化成為DC[21],但是這種方法由于受到前體細(xì)胞數(shù)量的限制,分離得到的DC數(shù)量有限。因此,有學(xué)者先對干細(xì)胞進(jìn)行擴增后再誘導(dǎo)分化成DC。對臍帶血通常采取“兩步法”,首先選擇重組人卵泡抑素(FST)、IL-3、IL-7、IL-13等從臍帶血中將 CD34+造血干細(xì)胞中分離出,并將CD34+造血干細(xì)胞擴增至一定數(shù)量,然后再選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子如用GM-CSF、IL-4等誘導(dǎo)培養(yǎng)[29-30],最終培育出大量成熟的或未成熟的DC。李紀(jì)鵬等[31]先利用CD34抗體將骨髓中CD34+細(xì)胞進(jìn)行分離純化及傳代擴增,至第4代時加入GM-CSF、IL-4等誘導(dǎo)骨髓CD34+細(xì)胞向 DC分化,從而獲得大量DC細(xì)胞。

3 DC的鑒定方法

3.1 DC形態(tài)學(xué)鑒定 (1)倒置相差顯微鏡下觀察:根據(jù)培養(yǎng)方法的不同,培養(yǎng)后的細(xì)胞逐漸出現(xiàn)細(xì)胞集落,大部分貼壁,細(xì)胞逐漸增大而不規(guī)則,有樹枝狀的突起伸出,呈現(xiàn)出未成熟DC的特點。隨著培養(yǎng)時間的延長細(xì)胞逐漸成熟,細(xì)胞從集落中釋放出來,細(xì)胞呈懸浮或半貼壁生長,偽足逐漸生長,分叉逐漸增多[32]。(2)掃描電鏡觀察:根據(jù)培養(yǎng)方法及培養(yǎng)階段的不同,主要表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,表面粗糙,有皺褶和不規(guī)則突起,胞質(zhì)內(nèi)可見吞飲泡以及多泡體等特點。

3.2 DC表面特異性標(biāo)記物鑒定 流式細(xì)胞學(xué)是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞鑒定術(shù),DC的表型鑒定主要用流式細(xì)胞學(xué)進(jìn)行分析。小鼠的表面特異性標(biāo)志物主要是CD11c和共刺激因子MHC-Ⅱ、CD80、CD86等。大鼠的表面特殊標(biāo)記物較少,目前較多的主要有 OX6、OX62和共刺激因子 MHC-Ⅱ、CD40、CD54、CD80、CD86等[33]。隨著對大鼠DC生物學(xué)特性的深入研究發(fā)現(xiàn),大鼠DC的表面標(biāo)記物OX62的表達(dá)率高于OX6,因而近年來越來越多的學(xué)者將OX62作為表面特異性標(biāo)記物來對大鼠DC進(jìn)行研究。共刺激因子CD80、CD86、MHC-Ⅱ等表達(dá)的高低主要反應(yīng)DC成熟度的高低,其表達(dá)越高說明DC細(xì)胞成熟度越高。

3.3 功能學(xué)鑒定 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)是目前檢測DC抗原提呈能力的重要方法,通過四甲基偶氮唑鹽法檢測混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),計算淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(加刺激細(xì)胞的A值/不加刺激細(xì)胞的A值),刺激指數(shù)與DC/T細(xì)胞的比值呈正相關(guān),隨DC/T細(xì)胞的比值增大而增大[34]。

4 DC在器官移植中應(yīng)用

近年來DC的應(yīng)用得到許多學(xué)科的肯定[35],DC具有誘導(dǎo)免疫耐受的特性在誘導(dǎo)移植免疫耐受方面已經(jīng)展現(xiàn)出獨特的應(yīng)用價值,在器官移植中得到了廣泛應(yīng)用,在心臟、腎臟、肝臟、小腸、胰腺、肢體移植等的報道較多,在角膜、皮膚、動脈、性腺、胰島、喉、脾、腎上腺等器官移植中也有報道。研究結(jié)果指出將具有致耐受作用的DC輸入受體體內(nèi)能明顯減低受體的免疫排斥作用,能夠在一定程度上延長移植物或受體存活時間。

5 展 望

DC通過多種機制誘導(dǎo)免疫耐受或減輕同種異體免疫反應(yīng),在移植中展示出極強的可塑性已成為當(dāng)前研究熱點。目前人們對DC的研究尚處于初級階段,現(xiàn)有實驗尚停留在動物實驗階段,許多問題如DC誘導(dǎo)耐受的具體機制尚不完全清楚,細(xì)胞的類型和劑量、輸注時間和時機、輸注的途徑等都有待進(jìn)一步深入研究。提取高純度的DC是進(jìn)行各項研究的基礎(chǔ),雖然目前已能在體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)產(chǎn)生DC,但依然存在不足,仍然有許多問題需要進(jìn)行更深層次的研究。相信隨著對DC的進(jìn)一步研究和細(xì)胞生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展,培養(yǎng)出具有致耐受作用的DC,誘導(dǎo)移植免疫耐受的目的最終是有望實現(xiàn)的。

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