腸道病毒及其實(shí)驗(yàn)室診斷概況

秦劍秋 (廣西壯族自治區(qū)南寧市疾病預(yù)防控制中心,廣西南寧530011)

近幾年,隨著手足口病疫情日益為政府及大眾所重視,其病原體腸道病毒 (Enterovirus,EV)也成為廣大疾控工作者的工作重點(diǎn)。腸道病毒血清型眾多,一種綜合征可由不同病毒所引起,同一種(型)病毒可以導(dǎo)致不同綜合征,這是腸道病毒屬病毒感染的普遍現(xiàn)象。在腸道病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法中,傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)與血清中和試驗(yàn)方法是金標(biāo)準(zhǔn),但具有費(fèi)時(shí)、繁瑣,且敏感性不高等局限性,而血清型多樣性又限制其血清學(xué)檢測(cè)方法的應(yīng)用。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,為腸道病毒的診斷與分類提供了快速、準(zhǔn)確的方法。

1 腸道病毒概況

腸道病毒是小RNA病毒科4屬成員中的一大屬病毒,人類EV共有70余個(gè)血清型。早期根據(jù)病毒在人或靈長(zhǎng)類動(dòng)物來源細(xì)胞上的復(fù)制能力,在不同動(dòng)物種類上的感染性、致病性和抗原差異性,將人EV分為脊髓灰質(zhì)炎 (脊灰)病毒 (Poliovirus,PV Ⅰ～ Ⅲ型)、柯薩奇 (Coxsackie)病毒A組和B組(CAV1～22和24型、CBV1～6型)、埃柯病毒 (Echovirus,ECV1～7、9、11～27、29～33型)。鑒于這種分類在一定程度上受到可應(yīng)用細(xì)胞系和自然情況下EV固有生物表現(xiàn)型變異等情況的限制,自1970年起,新鑒定的血清型不再歸入以上組別,而以數(shù)字編碼命名為EV68～71型[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)與生物信息學(xué)方法的應(yīng)用,新血清型病毒不斷被鑒定,至今已報(bào)道的新病毒編碼到EV111[2-4]。根據(jù)生物學(xué)及遺傳特性將其分為4個(gè)組 (species):CAV2、3、5、7、8、10、14、16和EV71組成A組;所有CBV、ECV血清型、CAV9和EV69組成B組;PV 3種血清型,CAV1、11、13、17、18、20、21、24組成C組;EV68、70組成D組[5-7]。也有將PV3種血清型另列為一組,分為5組[8]。

EV因寄居腸道而得名,其共同特點(diǎn)為:病毒呈圓球狀顆粒,呈現(xiàn)20面體,立體對(duì)稱,病毒顆粒裸露,無囊膜。病毒含有一個(gè)單股正鏈RNA分子,大小約7～8kb。主要衣殼蛋白有1A、1B、1C、1D,通常分別稱為VP4、VP2、VP3、VP1。腸道病毒可引發(fā)多種感染,情況較為復(fù)雜。主要包括急性呼吸道疾病、無菌性腦膜炎、腦膜腦炎、心肌炎、手足口病、新生兒多器官衰竭和急性弛緩性麻痹(AFP)[9]等。其發(fā)病多以綜合征出現(xiàn),嬰幼兒患者可引發(fā)嚴(yán)重心肌炎或重癥肺炎,而導(dǎo)致死亡。近幾年引起大眾關(guān)注的主要還是腸道病毒所致的手足口病疫情。2008年～2010年7月,中國大陸出現(xiàn)Cox-A16和EV71共循環(huán)引起手足口病爆發(fā),部分地區(qū)以EV71為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)型別,少數(shù)以CoxA16為優(yōu)勢(shì)型別[10]。腸道病毒感染臨床表現(xiàn)多樣化,一種綜合征可由不同病毒單獨(dú)或共同引起,同一種 (型)病毒可以導(dǎo)致不同綜合征,這是腸道病毒屬病毒感染的普遍現(xiàn)象。而某種癥狀也常由多種血清型的腸道病毒引起,如小兒麻痹癥就是脊髓灰質(zhì)炎病毒與腸道病毒其他血清型共同作用的結(jié)果[11-12]。因而從公共衛(wèi)生的角度,對(duì)病原體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷十分必要。只有對(duì)病原體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷,才能在一次疾病的爆發(fā)或流行中確定各病例間的流行病學(xué)關(guān)聯(lián),進(jìn)而確定EV特異血清型的病原譜。

2 腸道病毒診斷方法

2.1 病毒分離與血清中和試驗(yàn)

利用組織培養(yǎng)技術(shù)從感染部位或傳染源分離出病毒并鑒定其特異性血清型是病毒性疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。病人糞便標(biāo)本是最常采集的標(biāo)本,其他如咽拭子、腦膜炎患者的腦脊液、心包炎患者的心包積液、手足口病患者的皰內(nèi)滲出液、結(jié)膜炎患者的眼部分泌物等都是常用分離病原的標(biāo)本。EV常用接種細(xì)胞系有:猴腎細(xì)胞系 (I I C-MK2)、人肺細(xì)胞系 (MRC-5)、人橫紋肌肉瘤系 (RD)、非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero)和人肺癌細(xì)胞系 (A549)等[13]。

病毒接種后經(jīng)過培養(yǎng),可以利用電子顯微鏡進(jìn)行觀察鑒定。一般來說,腸道病毒型特異性鑒定主要靠血清中和試驗(yàn)。在病毒分離基礎(chǔ)上,應(yīng)用組合血清和/或型特異性血清進(jìn)行中和試驗(yàn)來定型分類。因在實(shí)踐中不可能用70多個(gè)型特異性抗血清進(jìn)行逐一中和,所以發(fā)展了超免疫組合血清進(jìn)行初步定型,再用特異單型抗血清證實(shí)。目前常用的Lim Benyesh Melnick(LBM)組合血清 (A～H)可鑒別42個(gè)型EV[14](包括ECV22、23)。如果未鑒定成功,可再用另外含19個(gè)型CAV抗體組合 (J～P)進(jìn)行鑒定[15]。另一種組合血清是目前世界衛(wèi)生組織 (WHO)推薦脊灰實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的RIVM組合血清,它還可對(duì)EV68～71型進(jìn)行鑒定[16]。但中和時(shí)常遇到無法定型的病毒株,主要原因有[17]:①2種及以上型別混合感染。由于EV不同型別的混合感染發(fā)生率較高,可在定型前通過對(duì)分離物進(jìn)行空斑形成試驗(yàn)或3′系列終末稀釋傳代進(jìn)行純化;②組合血清未包含所有血清型,如運(yùn)用LBM組合血清,CAV3、11、15、17、24和EV68～71型就無法鑒定;③EV有時(shí)會(huì)聚集在一起,必須通過脫氧膽酸鈉或氯仿或超濾處理,使其分散后才能進(jìn)行鑒定;④可能由于抗原變異與標(biāo)準(zhǔn)株抗血清不產(chǎn)生中和反應(yīng);⑤確實(shí)是新型別無法定型。

病毒培養(yǎng)對(duì)縮短抗生素治療和住院期有積極作用,其定型診斷對(duì)流行病分析有重要意義。但是,病毒的分離鑒定繁瑣、費(fèi)力、耗時(shí),一般需要1周甚至更長(zhǎng)的時(shí)間才能觀察到細(xì)胞病理反應(yīng) (CPE),不能滿足疫情處置對(duì)時(shí)間的要求。而根據(jù)細(xì)胞病理反應(yīng)無法確定病毒的類型,同時(shí)費(fèi)用高、敏感性低,檢測(cè)結(jié)果受主觀因素干擾較大,并需要較高的專業(yè)知識(shí)及實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。更重要的是許多腸道病毒不能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),或者可以培養(yǎng)但不出現(xiàn)細(xì)胞病理效應(yīng),如柯薩奇A組病毒,往往貽誤特異性治療。同時(shí)對(duì)診斷某些腸道病毒血清型和腦膜炎的敏感性也欠佳,給臨床診斷和快速檢測(cè)工作帶來困難和挑戰(zhàn)[18]。

2.2 血清學(xué)檢測(cè)

人體感染腸道病毒后,可產(chǎn)生3種特異性抗體:IgA,由唾液及腸道局部產(chǎn)生;血清中受染后1～3d可出現(xiàn)IgM,提示為新近感染,中和抗體可維持?jǐn)?shù)周;IgG主要為IgG1和IgG2 2個(gè)亞型,具有較持久性特異性免疫力,提示為既往感染。血清學(xué)試驗(yàn)主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)、中和試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)等方法檢測(cè)這些抗體。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)捕捉法或間接法檢測(cè)早期病人血清中的IgM和IgG抗體,是較常用的檢測(cè)指標(biāo),尤其以柯薩奇B組病毒的感染診斷較多。另外,病毒抗原還可從心、腦、脾、胰、肝和胸腺等多器官檢出。在暴發(fā)疫情的腸道病毒血清學(xué)鑒定中,一般單份血清IgM抗體效價(jià)無意義,因?yàn)榻】等搜逯蠭gM抗體都有一定效價(jià),易造成誤判;雙份血清檢測(cè)IgG抗體,恢復(fù)期抗體效價(jià)呈4倍以上升高,才具診斷意義。由于,第二份血清采集時(shí)間比第一份至少延后1～2周時(shí)間,得到明確診斷需至少1周以上時(shí)間。因此該方法在檢測(cè)中不適用于暴發(fā)疫情的早期診斷,可作為回顧性調(diào)查手段之一;同時(shí)因腸道病毒血清型別眾多,臨床使用檢測(cè)價(jià)值有限,而多為流行病學(xué)采用[18]。

2.3 分子生物學(xué)方法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,EV診斷鑒定方法已從血清學(xué)分析轉(zhuǎn)向遺傳學(xué)分析。基于RT-PCR方法的EV診斷技術(shù)是目前靈敏度最高的RNA檢測(cè)技術(shù)[19],它以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA(cDNA)的第一條鏈,再以該鏈為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),由此可以檢測(cè)出單個(gè)細(xì)胞中少于10個(gè)拷貝的特異的RNA。RT-PCR技術(shù)克服了傳統(tǒng)方法檢測(cè)靈敏度低、操作繁瑣的缺點(diǎn),PCR檢測(cè)一般可在收到標(biāo)本后2～5h內(nèi)提供診斷結(jié)果,是目前較理想的診斷技術(shù)[20-22],已在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用。

早期大多數(shù)研究都采用針對(duì)5'NCR的RT-PCR,然后進(jìn)行核苷酸測(cè)序。雖然不能用于分型鑒定,但由于5'NCR編碼HEV基因組的一段保守序列,比較易于設(shè)計(jì)引物,可以用于EV的RT-PCR初步篩查。根據(jù)VP1全序列對(duì)EV的遺傳學(xué)分類與第7次國際病毒分類委員會(huì) (ICTV)通過的分類結(jié)果完全一致,但應(yīng)用RT-PCR和測(cè)序技術(shù)測(cè)定VP1部分序列對(duì)EV進(jìn)行分型鑒定僅能鑒定42個(gè)原型株。這可能是因?yàn)楦餮逍椭幸镄蛄械母叨榷鄻有运碌囊锾禺愋缘驮斐傻摹?duì)不能定型的EV至少要用5套簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增VP1全序列,而且少數(shù)分離株也難以擴(kuò)增。Caro等[23]又在VP1和2C設(shè)計(jì)了一套引物擴(kuò)增所有HEV的原型株,但仍不能擴(kuò)增CAV5、19、22型等在乳鼠增殖的原型株,以及EV68型和EV70型原型株。在將EV分成亞組方面VP4序列定型方法不如VP1序列敏感,但VP4序列定型法中使用的引物能擴(kuò)增所有的EV原型株,而且引物序列比較保守,能擴(kuò)增30a間在不同地區(qū)收集的26個(gè)血清型的89株EV。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,Hiroaki等[24]建立了應(yīng)用HEV衣殼蛋白VP4的207個(gè)核苷酸序列的種系發(fā)生樹進(jìn)行分子診斷的方法。

新近發(fā)展的RT-PCR技術(shù),利用PCR對(duì)DNA的高效擴(kuò)增,探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高靈敏性的特點(diǎn),不僅克服了常規(guī)PCR檢測(cè)的不足,并且具有直觀、重復(fù)性好、靈敏性高和易操作等特點(diǎn)[25],逐漸應(yīng)用于常規(guī)腸道病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷。由于近年手足口病疫情的進(jìn)一步發(fā)展,國內(nèi)多家實(shí)驗(yàn)室都自行研發(fā)了用于手足口病實(shí)驗(yàn)室診斷的EV71及CoxA16的引物探針,使得這一技術(shù)在疫情的處置上充分發(fā)揮了作用。

在PCR作為診斷技術(shù)主流的同時(shí),建立在核酸基礎(chǔ)上的新一代診斷技術(shù)正在形成,如檢測(cè)遺傳物質(zhì)的環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù) (LAMP)和基因芯片技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù) (LAMP)是一項(xiàng)比PCR更具活力的方法,它需要便宜簡(jiǎn)單的儀器,在野外就可以使用這種方法?；谠撎攸c(diǎn),國內(nèi)已有人建立了適于腸道病毒現(xiàn)場(chǎng)或臨床檢測(cè)的快速方法[26]。核酸芯片技術(shù)用單一操作可以檢測(cè)數(shù)百種或數(shù)千種病原/菌株,具有高通量、靈敏度高、特異性強(qiáng)和檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),因此特別適合用于腸道病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷。目前,我國崔倫標(biāo)等[27]建立的液相芯片檢測(cè)方法正是基于該技術(shù)并成功應(yīng)用于手足口病的病原檢測(cè)。

3 結(jié)語

腸道病毒作為一種古老的病毒已經(jīng)與人類共同存在了數(shù)千年,隨著脊髓灰質(zhì)炎被消滅后,這一屬病毒中最引人注目的當(dāng)是引起手足口病的柯薩奇病毒及新腸道病毒 (以71型為主)。由于這些病毒的易變性,目前尚無疫苗可防。而這些年來手足口病疫情勢(shì)頭不減,給防控工作帶來了難度。為此,快速準(zhǔn)確的分子生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)是應(yīng)對(duì)突發(fā)的手足口病疫情的有效的技術(shù)手段。針對(duì)其血清型別眾多的特點(diǎn),基于基因芯片技術(shù)的高通量的檢測(cè)將是腸道病毒分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)今后發(fā)展的主要方向。

[1]劉克洲,陳 智.人類病毒性疾病[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:13-27.

[2]Oberste M S,Schnurr D,Maher K,et al.Molecular identification ofnew picornaviruses and characterization of a proposed enterovirus 73 seroty pe[J].J Gen Virol,2001,82:409-416.

[3]Norder H,Bjerregaard L,Magnius L,et al.Sequencing of‘unty pable'enteroviruses reveals two new ty pes,EV277 and EV278,within human enterovirus type B and substitutions in the BC loop of the VP1 protein fo r known types[J].J Gen Virol,2003,84:827-836.

[4]Oberste M S,Maher K,Michele S M,et al.Enteroviruses 76,89,90 and 91 represent a novel group withein the species Human enterovirus A[J].J Gen Virol,2009,86:445-451.

[5]Huttunen P,Santti T,Pulli T,et al.The major echovirus g roup is genetically coherent and related to cox sackie B viruses[J].J Gen Virol,1996,77:715-725.

[6]Pulli T,Koskimies P,Hyypia T.Molecular comparison of coxsackie A virus serotypes[J].Virology,1995,212:30-38.

[7]Hyypia T,Hovi T,Knowles N J,et al.Classification of enteroviruses based on molecular and biological properties[J].J Gen Virol,1997,78:1-11.

[8]Caro V,Guillot S,Delpeyroux F,et al.Molecular strategy for‘serotyping'of human enteroviruses[J].J Gen Virol,2001,82:79-91.

[9]M elnick J L.Enteroviruses:polioviruses,coxsackieviruses,echoviruses,and newer enteroviruses[A].Fields B N,Knipe D M,Howley P M.Fields Virology(3rd ed)[C].Philadelphia:Lippincott-Raven,1996:655-712.

[10]許文波.手足口病流行病和病毒學(xué)特征[EB/OL].http://www.yncdc.cn/UploadFile/files/20110527112514.ppt,2011-05-25.

[11] Melnick J L.Enteroviruses:polioviruses,coxsackieviruses,echoviruses,and newer enteroviruses[A].Fields B N,Knipe D M.Virology[C].New York:Raven Press,1990:549-605.

[12]Cherry J D.Enteroviruses:polioviruses(poliomyelitis),coxsackieviruses,echoviruses,and enteroviruses[A].Feigin R D,Cherry J D.Tex tbook of Pediatric Infectious Diseasesnded[C].Philadelphia:Saunders,1987:1729-1841.

[13]Wu S C,Liu C C,Lian W C.Optimization of microcarriercell culture process for the inactivated enterovirus type 71 vaccine development[J].Vaccine,2004,22:3858-3864.

[14]Melnick J L,Rennick V,Hampil B,et al.Lyophilized combination pools of enterovirus equine antisera:preparation and test procedures for the identification of field strains of 42 enteroviruses[J].Bull WHO,1973,48:263-268.

[15]Melnick J L,Schmidt N J,Hampil B,et al.Lyophilized combinationpools of enterovirus equine antisera:preparation and test procedures for the identification of field strains of 19 group A cox sackievirus serotypes[J].Intervirology,1977,8:172-181.

[16]Kapsenberg J G.Picornaviridae:the enteroviruses(polioviruses,cox sackieviruses,echoviruses)[A].Lennette E H,Halonen P,M urphy F A.Laboratory diagnosis of infection diseases[C].Princip Pract,1998,2:692-722.

[17]Muir P,Kammerer U,Korn K,et al.Molecular typing of enteroviruses:current status and future requirements[J].Clin Microbial Rev,1998,11:202-227.

[18]Stefania M,Michde M,Giuseppina L R,et al.Moleculalp identification and ty ping of enteroviruses isolated from clinical specimens[J].J Clin Microbiol,2002,40:4554-4560.

[19]藥立波.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002.

[20]Sawyer M H,Holland D,Aintablian N,et al.Diagnosis of enteroviral central nervous system infection by polymerase chain reactionduring a large community outbreak[J].Pediatr Infect Dis J,1994,13:177-182.

[21]Rothart H A,Ahmed A,Hickey S,et al.Diagnosis of enterovirus infection by polymerase chain reaction of multiple specimen types[J].Pediatr Infect Dis J,1997,16:409-411.

[22]Hamilton M S,Jackson M A,Abel D,et al.Clinical utity of polymera chain reaction testing for enteroviral meningitis[J].Pediatr Infect Dis J,1999,18:533-537.

[23]Caro V,Guillot S,Delpey roux F,et al.Molecular strategy fo r“serotyping” of human enteroviruses[J].J Gen Virol,2001,82:79-91.

[24]Ishiko H,Takeda N,Miyamura K.Diagnosis of Human Enteroviruses by Phylogeny Based Classification by Use of the VP4 Sequence[J].J infect Dis,2002,185:744-754.

[25]陽 帆,劉建軍,何建凡,等.TaqMan PCR檢測(cè)乙型腦炎病毒方法的建立及應(yīng)用[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,(10):1962-1963.

[26]唐 震,李 顯,郭喜玲,等.一種基于NASBA技術(shù)的新型快速腸道病毒檢測(cè)方法的應(yīng)用研究[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版),2010,(12):1729-1731.

[27]崔侖標(biāo),葛以躍,史智揚(yáng),等.手足口病病原液相芯片檢測(cè)方法的建立[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué),2010,(1):11-14.