超聲波-酶解法和超聲波法提取裙帶菜多糖的比較研究

張勝幫，于 萍，曾小明

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

超聲波-酶解法和超聲波法提取裙帶菜多糖的比較研究

張勝幫，于 萍，曾小明

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

比較研究超聲波-酶解法和超聲波法提取裙帶菜多糖，并采用Fenton體系研究裙帶菜中多糖對羥自由基清除活性作用。選取浸提時間、酶用量、固液比及溫度4因素采用L16(45)和L9(34)兩個方案分別對超聲-酶解提取裙帶菜多糖和超聲波法提取進行正交試驗。得到最佳的提取條件為：超聲-酶解提取的裙帶菜多糖得率與抗羥自由基優(yōu)化組合為超聲-酶解時間15min、纖維素酶用量2.8×104U/g(酶與藻粉比值)、溫度70℃、固液比1∶80為最佳條件，在此條件下，裙帶菜多糖提取率為(4.522±0.028)%，3.60g/L的裙帶菜多糖對羥自由基清除率為(51.70±0.47)%。超聲-酶解結(jié)合方法提取試驗條件對裙帶菜多糖提取率影響顯著(P＜0.01)。試驗條件對提取得到的裙帶菜多糖羥自由基清除率結(jié)果影響不顯著(P＞0.05)。超聲-酶解法的裙帶菜多糖提取效果和及其羥自由基清除率能力明顯優(yōu)于超聲波法，其結(jié)果具有顯著性差異(P＜0.01)。超聲波-酶解結(jié)合方法提取裙帶菜多糖，提取效率高，多糖清除自由基效果好。

超聲波-酶解法；超聲提??；裙帶菜；多糖；羥自由基

隨著對海洋生物活性物質(zhì)的深入研究[1]，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)藻多糖可能具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗凝血、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等[2-6]生物活性功能和對細胞保護功能[7]，海洋多糖研究越發(fā)得到重視。

裙帶菜(Undaria pinnatifida)屬海帶目翅藻科，裙帶菜屬，主要產(chǎn)于中國、日本、朝鮮半島等沿海清潔海域。裙帶菜是一種溫帶性多年生大型褐藻，主要包括褐藻膠、硫酸多糖和褐藻淀粉等。含有19種氨基酸，其中包括人體所需要的8種必需氨基酸。孢子葉中還含有一定量的蛋白質(zhì)和人體必需的脂肪酸，其中，二十碳五烯酸占脂肪酸的15%～20%。裙帶菜的葉狀體不但可食用，還可作為中藥使用，裙帶菜與昆布化學(xué)成分相似，將其作為中藥昆布入藥，具有消痰軟堅利水退腫的功效[8]。

多糖提取純化方法和結(jié)構(gòu)分析已經(jīng)有較多報道[9-10]，文獻[11-14]報道了酶法和超聲波法等多糖提取純化方法，而超聲-酶解法提取裙帶菜多糖鮮見報道?！H是活性氧中最活潑的自由基之一，也是毒性最大的自由基，可直接損傷各種生物膜，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，從而危及生物體。多糖清除·OH活性已有較多研究[15-17]，而對裙帶菜多糖的抗氧化作用研究相對較少[18]。

本實驗以裙帶菜多糖為原料，在超聲波法提取研究基礎(chǔ)上，采用Fenton體系研究裙帶菜中多糖的提取工藝及其對羥自由基的清除活性作用。選取浸提時間、酶用量、固液比及溫度4因素，采用L16(45)和L9(34)兩個方案分別研究超聲-酶結(jié)合法提取和超聲法提取的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥裙帶菜 大連凌井水產(chǎn)食品有限公司。

丙酮、硫酸亞鐵、鹽酸 衢州巨化試劑有限公司；氫氧化鈉、氯化鋇、硫酸 浙江中星化工試劑有限公司；苯酚 浙江省蘭溪市屹達化工試劑有限公司；30%雙氧水 宜興市第二化學(xué)試劑廠；葡萄糖 廣東汕頭市隴化工廠；水楊酸 汕頭市西隴化工有限公司；無水乙醇 杭州蕭山化學(xué)試劑廠；三氯乙酸(以上均為AR)江蘇永華精細化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶(140萬U/g)甘肅華羚生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；HHS型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KQ-300VDV型三頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；TDL-5-A臺式離心機 上海安婷科學(xué)儀器廠；微電腦控制冷藏柜 河南冰熊制冷工業(yè)集團立式冷柜廠；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BS224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；真空干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

裙帶菜在清水中浸泡10min洗凈，瀝干，放入烘箱內(nèi)于70℃干燥至質(zhì)量恒定。取出用粉碎機粉碎得到裙帶菜粉，過1 0 0目篩，備用。

1.3.2 裙帶菜多糖的提取工藝

1.3.2.1 提取工藝

稱取裙帶菜干粉2.000g于三角瓶中，加入不同體積蒸餾水，用各自方法提取處理后，冷卻， 4500r/min離心20min，取上清液，再取其中的1.0mL，采用硫酸-苯酚比色分析測定，其余加入3倍體積乙醇沉淀，放置過夜，4500r/min離心20min后取沉淀，最后用無水乙醇洗滌兩次，放入小燒杯中，干燥得裙帶菜粗多糖。

1.3.2.2 超聲波法提取裙帶菜多糖

超聲裙帶菜多糖的提取，參考文獻[19-20]，結(jié)合單因素預(yù)試驗結(jié)果，選擇確定超聲波功率100W基礎(chǔ)上，設(shè)計5因素4水平L16(45)正交表，設(shè)計超聲波法裙帶菜多糖提取的水平因素見表1。

表1 超聲裙帶菜多糖提取正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design for optimizing ultrasonic extraction of Undaria pinnatifida polysaccharides

稱取超聲裙帶菜干粉2.000g于三角瓶中，制成固液比為1∶50、1∶60、1∶70、1∶80的裙帶菜漿液，在超聲波功率100W條件下進行裙帶菜多糖的提取試驗，冷卻、離心、濃縮、乙醇沉淀、干燥，具體見1.3.2.1節(jié)。

1.3.2.3 超聲波-酶解提取裙帶菜多糖

根據(jù)超聲波、水浴、酶解、酸提等方法提取裙帶菜多糖初步實驗結(jié)果。選擇超聲波輔助結(jié)合酶解法對裙帶菜多糖提取進行研究。

[21-22]等，結(jié)合單因素預(yù)試驗結(jié)果，選擇確定超聲波功率300W基礎(chǔ)上，超聲波-酶解提取裙帶菜多糖的因素水平表見表2，設(shè)計4因素3水平L9(34)正交表，分別以多糖提取率、羥自由基清除率為指標，進行正交試驗。

稱取裙帶菜干粉2.000g于三角瓶中，加蒸餾水，按照要求配制成固液比為1∶40、1∶60、1∶80的裙帶菜漿液。調(diào)pH 6.0，分別加入1.4×104、2.8×104、4.2×104U/g纖維素酶(酶與藻粉比)，即1%、2%、3%的用量(酶與藻粉質(zhì)量比)，超聲波-酶解提取處理，取出迅速升溫至80℃使酶鈍化1h，冷卻，離心，濃縮，乙醇沉淀，干燥，具體見1.3.2.1節(jié)。

表2 超聲波-酶解提取裙帶菜多糖正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal array design for optimizing ultrasonic-enzymatic extraction of Undaria pinnatifida polysaccharides

1.3.3 裙帶菜多糖的脫色

參照文獻[16]，采用H2O2進行脫色實驗。

1.3.4 裙帶菜多糖的脫蛋白

采用三氯乙酸法除去裙帶菜多糖中的蛋白，在多糖提取液中滴加3%三氯乙酸，直到不再有混濁為止，5℃放置過夜，離心除去膠狀沉淀，即可除去蛋白。

1.3.5 裙帶菜多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定裙帶菜多糖含量。取1.0mL多糖提取液，加入6%苯酚溶液1.0mL，搖勻，然后加入濃硫酸5.0mL，充分搖勻，室溫放置30min，同時以蒸餾水做空白對照，紫外分光光度法測定吸光度。

1.3.6 多糖對羥自由基清除功能

本實驗采用Fenton模型裙帶菜多糖對·OH的清除作用，采用水楊酸參與的·OH反應(yīng)體系。利用FeSO4、乙醇、水楊酸、過氧化氫的混合溶液，分別對不同濃度的裙帶菜粗多糖溶液和脫蛋白多糖溶液進行研究，37℃水浴90min后，冷卻，510nm波長處測定吸光度。

1.3.7 裙帶菜多糖的硫酸根含量測定

取0.100g裙帶菜多糖，加10mL 1.0mol/L HCl溶液，100℃水解3h。冷卻后加HCl溶液補至刻度線，過濾除去不溶物，即得樣品溶液。吸取樣品液3.0mL，加4.0mL 0.2mol/L HCl溶液，1.0mL 10g/L明膠氯化鋇溶液A，充分搖勻，放置30min后，于500nm波長處測其吸光度，根據(jù)標準曲線計算硫酸根含量[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線方程的確定

2.1.1 葡萄糖標準曲線

精確量取葡萄糖標準溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL用蒸餾水分別補至1.0mL再按苯酚-硫酸法比色測定吸光度，以標準葡萄糖質(zhì)量濃度(χ，g/L)為橫坐標、吸光度(y)為縱坐標，得到標準曲線，其回歸方程為y＝9.8509χ＋0.0216，R2＝0.9962。葡萄糖質(zhì)量濃度在0.00～0.10g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 硫酸根標準曲線

分別取0.35g/L標準硫酸鉀溶液0.0、0.5、1.0、1.5、 2.0、2.5、3.0mL，分別加蒸餾水至3.0mL，加4.0mL 0.2mol/L HCl溶液，1.0mL 10.0g/L明膠氯化鋇溶液A，充分搖勻，放置30min后，于500nm波長處測其吸光度。以標準硫酸鉀質(zhì)量濃度(χ，g/L)為橫坐標、吸光度(y)為縱坐標，得到硫酸根含量標準曲線，其回歸方程為y＝0.7053χ-0.002，R2＝0.9956。硫酸根質(zhì)量濃度在0.00～0.35g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 超聲提取裙帶菜多糖工藝的研究

表3 超聲波法提取裙帶菜多糖的正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design for optimizing ultrasonic extraction of Undaria pinnatifida polysaccharides and corresponding experimental results

根據(jù)表1進行超聲波法提取裙帶菜多糖正交試驗，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表4 超聲波法提取結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of extraction rate of Undaria pinnatifida polysaccharides with various ultrasonic extraction conditions

由表4可見，固液比對提取結(jié)果的影響差異極顯著(P＜0.01)。超聲時間、水浴溫度、水浴時間對提取結(jié)果影響差異不顯著。根據(jù)表3極差分析可知，以裙帶菜多糖的提取率為指標，對裙帶菜多糖的提取率影響為固液比最大，其次依次為時間、溫度、超聲波處理時間，而且結(jié)果變動不大，與方差分析一致。結(jié)合方差分析結(jié)果，超聲波提取的最優(yōu)組合為A1B4C4D4，從經(jīng)濟角度可以選擇A1B1C1D4，考慮到作為方法對比實驗，仍然選擇超聲波提取的最優(yōu)組合為A1B4C4D4。即超聲波時間15min水浴溫度100℃水浴時間6h以及固液比1∶80為裙帶菜多糖的最佳提取工藝。

2.3 超聲-酶解提取裙帶菜多糖最佳工藝條件的確定

根據(jù)表2設(shè)計的4因素3水平L9(34)正交表，分別以多糖提取率(%)、羥自由基清除率(%)為指標，進行正交試驗，結(jié)果見表5，結(jié)果的方差分析表6。

表5 超聲-酶解提取裙帶菜多糖的正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Orthogonal array design for optimizing ultrasonic-enzymatic extraction of Undaria pinnatifida polysaccharides and corresponding experimental results

由表6可見，在本試驗條件下，A、B、C、D對裙帶菜多糖提取率的影響差異極顯著(P＜0.01)，根據(jù)表5極差分析可知，以提取率為指標時，因素主次順序為C＞D＞B＞A，因素A的水平改變，對結(jié)果幾乎沒有影響，從經(jīng)濟角度可以選擇A1。所以，按照表5結(jié)果，確定超聲-酶解提取的最優(yōu)組合為A1B2C3D1。

由表6可見，各因素對裙帶菜多糖羥自由基清除率影響差異不顯著(P＞0.05)。而根據(jù)表5極差分析可知，以裙帶菜多糖對羥自由基的清除率為指標時，因素影響次序和多糖抗羥自由基優(yōu)化組合均與以提取率為指標時一致，同樣，因素A的水平改變，對試驗結(jié)果幾乎沒有影響，從經(jīng)濟角度可以選擇A1。因此，確定超聲-酶解提取的最優(yōu)組合為A1B2C3D1。

表6 超聲-酶解提取結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of extraction rate of Undaria pinnatifida polysaccharides with various ultrasonic-enzymatic extraction conditions

結(jié)合裙帶菜多糖提取率的影響和提取得到的裙帶菜多糖羥自由基清除率影響程度的一致性，根據(jù)上述結(jié)合正交試驗和方差分析得出的最佳結(jié)果綜合分析，確定超聲-酶解提取的最優(yōu)組合為A1B2C3D1。即時間15min、酶用量2.8×104U/g (酶與藻粉比值)、固液比1∶80、溫度70℃為超聲-酶解提取裙帶菜多糖的最佳提取工藝。

2.4 驗證實驗

2.4.1 超聲提取裙帶菜多糖工藝的研究

稱取2.0 0 g的裙帶菜干粉3份，在超聲波時間15min、水浴溫度100℃、水浴時間6h及固液比1∶80的最佳提取條件下，進行驗證實驗，裙帶菜多糖的提取率為(2.474±0.220)%，高于正交試驗中的最高多糖提取率2.466%。說明實驗效果良好，也驗證了最佳條件合理。同時測定粗多糖的硫酸根質(zhì)量分數(shù)平均為10.81%，蛋白平均含量為0.718%。在多糖質(zhì)量濃度3.60g/L時，超聲波法得到的多糖自由基清除率為(48.65±0.565)%。

2.4.2 超聲-酶解提取裙帶菜多糖最佳工藝條件的確定

稱取2.000g的裙帶菜干粉3份，在超聲-酶解時間15min、酶用量2.8×104U/g(酶與藻粉比值)、溫度70℃以及固液比1∶80的最佳條件下，進行驗證實驗，裙帶菜多糖的提取率為(4.522±0.028)%，高于正交試驗中的最高多糖提取率4.494%。在多糖質(zhì)量濃度為3.60g/L時，羥自由基的清除率實驗結(jié)果為(51.70±0.47)%，高于正交試驗中的最高值51.41%。

2.5 超聲-酶解法與超聲波法的提取裙帶菜多糖比較

在兩種最佳提取實驗條件下，超聲-酶解法與超聲波法的提取裙帶菜多糖結(jié)果見表7。

表7表明，超聲-酶解法與超聲波法的提取裙帶菜多糖的提取率和羥自由基清除率結(jié)果具有極顯著差異性(P＜0.01)，因此，超聲-酶解法的提取裙帶菜多糖效果明顯優(yōu)于超聲波法(P＜0.01)，得到裙帶菜多糖的羥自由基清除率能力強于超聲波法(P＜0.01)。

表7 兩種最佳提取實驗結(jié)果的比較(n=3)Table 7 Comparisons of extraction rate and hydroxyl radical scavenging activity of Undaria pinnatifida polysaccharides by ultrasonic extraction and ultrasonic-enzymatic extraction (n=3)

3 結(jié) 論

本實驗在進行超聲波法提取裙帶菜多糖研究的基礎(chǔ)上，比較研究了超聲-酶解結(jié)合方法提取裙帶菜多糖。選取浸提時間、酶用量、固液比及溫度4因素采用L16(45)和L9(34)兩個方案分別對超聲-酶解提取和超聲提取進行正交試驗。得到最佳的提取條件為：超聲-酶解提取的裙帶菜多糖得率與抗羥自由基優(yōu)化組合為超聲-酶解時間15min、纖維素酶用量2.8×104U/g(酶與藻粉比值)、溫度7 0℃、固液比1∶8 0為最佳條件，在此條件下，裙帶菜多糖提取率為(4.522±0.028)%，3.60g/L的裙帶菜多糖對羥自由基清除率為(51.70±0.47)%。超聲-酶解結(jié)合方法提取試驗條件對裙帶菜多糖提取率影響顯著(P＜0.01)。試驗條件對提取得到的裙帶菜多糖羥自由基清除率結(jié)果影響不顯著(P＞0.05)。與超聲提取相比，超聲-酶解法的裙帶菜多糖提取效果和及其羥自由基清除率能力提高，其結(jié)果具有顯著性差異(P＜0.01)。原因可能是酶解細胞表面結(jié)構(gòu)及胞間連接物，有助于裙帶菜多糖的提取，使超聲-酶解結(jié)合方法的提取率高于超聲波法提取的結(jié)果。

所用的輔助提取手段都是為了破碎裙帶菜細胞，同時保持多糖有效成分的原有結(jié)構(gòu)和活性。超聲波作為一種新的提取手段，破碎效果好。而研究以超聲波為基礎(chǔ)的結(jié)合提取法，提高裙帶菜多糖的提取率已成為新的課題。結(jié)果表明與超聲波法提取相比，超聲波-酶解結(jié)合方法提取裙帶菜多糖，提取效率高，多糖清除自由基效果好，具有一定的實際價值。

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A Comparative Study of Ultrasonic Treatment Alone and in Combination with Cellulase Hydrolysis for Extraction of Undaria pinnatifida Polysaccharides

ZHANG Sheng-bang，YU Ping，ZENG Xiao-ming
(School of Life and Environmental Science, Wenzhou University, Wenzhou 325035, China)

In the present study, the extraction of Undaria pinnatifida polysaccharides by ultrasonic treatment alone and in combination with cellulase hydrolysis was optimized by orthogonal array designs L16(45) and L9(34), respectively. The optimal ultrasonic-cellulase treatment conditions for simultaneously improved polysaccharide yield and scavenging activity of polysaccharide extracts against hydroxyl radicals generated in Fenton system were treatment time of 15 min, cellulase amount of 2.8 × 104U/g algae power, treatment temperature of 70 ℃ and solid-to-liquid ratio of 1∶80. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of Undaria pinnatifida polysaccharides was (4.522 ± 0.028)%. The hydroxyl radical scavenging rate of the obtained extract was up to (51.70 ±0.47)%. In addition, each of the four process conditions showed a significant effect on the extraction rate of Undaria pinnatifida polysaccharides (P＜0.01) and no significant effect on the scavenging activity of polysaccharide extracts against hydroxyl radicals (P＞0.05). The combination of ultrasonic and cellulase could significantly increase the extraction rate of Undaria pinnatifida polysaccharides and the scavenging activity of polysaccharide extracts against hydroxyl radicals as compared with ultrasonic alone (P＜0.01).

ultrasonic-enzymatic extraction；ultrasonic extraction；Undaria pinnatifida；polysaccharide；hydroxyl radical

TS201.1

A

1002-6630(2011)16-0141-05

2011-04-07

張勝幫(1964—)，男，副教授，碩士，主要從事食品資源開發(fā)、分析化學(xué)研究。E-mail：sbzhang@wzu.edu.cn