雙水相萃取法提取條斑紫菜R-藻紅蛋白工藝

岳 岑，馮維希，黃 文，王 益,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院，江蘇 連云港 222006)

雙水相萃取法提取條斑紫菜R-藻紅蛋白工藝

岳 岑1，馮維希2，黃 文1，王 益1,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院，江蘇 連云港 222006)

以條斑紫菜為原料，采用雙水相萃取法對R-藻紅蛋白進(jìn)行提取，討論不同工藝條件聚合物分子大小及質(zhì)量分?jǐn)?shù)、成相鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、離子強(qiáng)度對藻紅蛋白的提取效果，通過正交試驗(yàn)確定藻紅蛋白的最佳提取條件。結(jié)果表明當(dāng)6%聚乙二醇4000、13%硫酸鈉、1.5%氯化鈉時，蛋白純度可由粗液的0.187上升至0.727，是傳統(tǒng)硫酸銨鹽析法的2.25倍，說明雙水相萃取法比硫酸銨鹽析法更適合提取R-藻紅蛋白。

條斑紫菜；藻紅蛋白；雙水相萃取；優(yōu)化

藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)是藻類中的天然色素蛋白，其中以R-藻紅蛋白(R-phycoerythrin，RPE)最具代表性。RPE是多亞基、超大分子質(zhì)量的色素蛋白化合物，據(jù)報道其蛋白分子質(zhì)量為230～300kD，主要見于紅藻和部分藍(lán)藻中，由于RPE具有強(qiáng)烈的熒光性，同時具有其抗氧化、提高免疫力[1]、抗腫瘤及抗炎等生物活性[2]，因此RPE不僅為天然的增色劑也是營養(yǎng)劑[3]，而且廣泛應(yīng)用于食品、軟飲料、化妝品和紡織品中[4]。

目前，對于藻紅蛋白的提取常采用鹽析法，但由于鹽析法所獲得的純度有限，因此還需要額外的多步層析來達(dá)到純度目標(biāo)，步驟過多、操作復(fù)雜、動力能消耗高等導(dǎo)致產(chǎn)量損失及規(guī)?；a(chǎn)的困難[5]，這對于工業(yè)生產(chǎn)極為不利；雙水相萃取法(aqueous tw o-phase extraction，ATPS)又稱水溶液兩相分配技術(shù)，是近年來出現(xiàn)的新型分配技術(shù)[6]。雙水相萃取不僅條件溫和，容易放大，可連續(xù)操作，還能使目標(biāo)蛋白的純度得到較大提升，現(xiàn)已被廣泛用于蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多肽、細(xì)胞器等產(chǎn)品的分離和純化[7]。專家預(yù)測ATPS是目前為止對生物活性物質(zhì)純化分離最有希望應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)[8]，它在工業(yè)應(yīng)用上的已日漸成熟，為蛋白質(zhì)尤其是藻膽蛋白這樣的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的提取開辟了新的途徑。

目前，國內(nèi)外對于ATPE提取藻膽蛋白的研究集中在于螺旋藻藻藍(lán)蛋白[9]、紫球藻B-藻紅蛋白[10]中，對RPE的雙水相萃取尚未見報道，紫菜是獲取藻紅蛋白的理想資源[11]，本研究以條斑紫菜(Porphyra yezoensis)為原料，考慮不同因素對萃取效果的影響，通過正交試驗(yàn)對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并將其與傳統(tǒng)硫酸銨鹽析法進(jìn)行比較，從而體現(xiàn)雙水相萃取對于純度的提升的優(yōu)勢，為雙水相萃取應(yīng)用于RPE的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

條斑紫菜粉末：條斑紫菜干片購于江蘇連云港市，粉碎成8 0目干粉于-2 0℃避光保存；聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG，1000～6000D)、硫酸鈉、氯化鈉、硫酸銨(均為分析純)。

UV-9100紫外分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司；TDL-80-2B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；多功能粉碎機(jī) 永康市帥通工具有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RPE粗液制備

采用滲透壓破碎法[12]，準(zhǔn)確稱取0.5g條斑紫菜粉末置于15mL離心管中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1∶20加入蒸餾水，充分混勻后4℃浸泡5h，將懸浮液離心(10000×g)10min后收集上清液。

1.2.2 雙水相萃取

雙水相萃取一般常用“聚合物/聚合物”、“聚合物/鹽”這兩種體系所形成的雙水相體系，由于“PEG/鹽”體系相比雙聚合物體系而言，具有因黏度較低而縮短相分離時間的優(yōu)點(diǎn)，目前在藻膽蛋白的雙水相提取中，一般采用“P E G/鹽”體系。

在雙水相萃取中，相分離效果的好壞一般通過分配系數(shù)K來表現(xiàn)，K值越大則相分離程度越好。K不是一個確定的量[13]，它取決于溶質(zhì)與雙水相系統(tǒng)間的各種相互作用。影響藻紅蛋白在雙水相體系中的分配因素有很多，本實(shí)驗(yàn)選取“PEG/硫酸鈉”體系進(jìn)行研究，考察PEG分子質(zhì)量及質(zhì)量分?jǐn)?shù)，成相鹽硫酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以及離子強(qiáng)度對藻紅蛋白的提取效果的影響。

[10]將一定質(zhì)量比的PEG、無機(jī)鹽、蒸餾水加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的RPE上清液中，使總體系質(zhì)量為定值，25℃攪拌30min達(dá)到相分離，25℃、1500×g離心20min，直接從刻度管上評估上下兩相的體積并計算體積比Vr，從體系中小心提取上相樣品，用0.01mL/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)稀釋并測定兩相溶液在波長280、614、561、652nm處的吸光度，計算RPE的分配系數(shù)K、純度及提取率。

1.2.3 R PE純度、質(zhì)量濃度、提取率、分配系數(shù)及相比計算

式中：A280、A561、A614、A652分別代表波長280、561、614、562nm處的吸光度；V表示溶液體積；0、t、b分別代表粗液、雙水相體系上相和下相溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG平均分子質(zhì)量對雙水相體系平衡的影響

PEG分子質(zhì)量對于雙水相體系的平衡影響很大，由表1可知，在相同PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，分子質(zhì)量1000D和2000D均不能成相，可見小分子質(zhì)量的PEG雖可使水溶性增大，提高成相的臨界質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但PEG分子質(zhì)量過小則無法形成雙水相體系。在可成相的分子質(zhì)量4000D與6000D中，由于聚合物的分子質(zhì)量越小，體系黏度越低，可使相分離時間縮短，更易于工業(yè)化的分離，因此選取PEG 4 000為成相聚合物。

表1 PEG平均分子質(zhì)量對雙水相體系的影響Table 1 Effect of PEGs of different molecular weights on phase partitioning in aqueous two phase systems

2.2 PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對RPE雙水相萃取效果的影響

表2 PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對RPE雙水相萃取效果的影響Table 2 Effect of PEG 4000 concentration on R-phycoerythrin extraction and phase partitioning in aqueous two phase systems

如表2所示，當(dāng)硫酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)保持在12%、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)從7%增加到12%時，分配系數(shù)K由14.71提高到51.77，提取率也相應(yīng)增大至41.2%，可見，分配系數(shù)K的增加，有利于目標(biāo)蛋白在上相的富集，這也同樣表現(xiàn)在體積比Vr的增加上(由0.47升至0.72)。但隨著K的增大，蛋白純度降低，這意味著K增大會導(dǎo)致雜蛋白的引入。當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%時，可得到最大純度0.507。

2.3 硫酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對RPE雙水相萃取效果的影響

表3 硫酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對RPE提取效果的影響Table 3 Effect of Na2SO4concentration on R-phycoerythrin extraction and phase partitioning in aqueous two phase systems

如表3所示，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)保持在8%時，RPE的純度與Vr的變化規(guī)律相似，當(dāng)硫酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～14%時，RPE純度隨著體積比Vr的增大(0.5～0.61)而增大(0.451～0.533)，并且Vr的增大在提高蛋白純度的同時，也增加了RPE的提取率及分配系數(shù)K。當(dāng)硫酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于14%后，Vr開始下降，蛋白純度也隨之減小?？梢奦r的降低(上相體積減少)，使雜蛋白在上相濃縮而導(dǎo)致目標(biāo)蛋白純度下降，該結(jié)論[14]也通過實(shí)驗(yàn)得以證明。當(dāng)硫酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%時，可得到最高純度0.533。

2.4 離子強(qiáng)度對RPE雙水相萃取效果的影響

在雙水相體系中，適當(dāng)增加離子強(qiáng)度可以加快分相速度，并可提高目的產(chǎn)物的選擇性[7]。提高離子強(qiáng)度一般可加入的中性鹽有氯化鈉、氯化鉀等[15]，本實(shí)驗(yàn)選用氯化鈉作為研究對象，影響結(jié)果如表4所示，當(dāng)氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大時，RPE的提取率、純度、體積比Vr都呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時，出現(xiàn)最大分配系數(shù)K及提取率。當(dāng)氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時，此時RPE純度最高(0.691)。

表4 離子強(qiáng)度對RPE提取效果的影響Table 4 Effect of ion strength on R-phycoerythrin extraction and phase partitioning in aqueous two phase systems

2.5 雙水相萃取正交試驗(yàn)方案設(shè)計

為獲得最優(yōu)提取工藝條件，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以純度為考察指標(biāo)，以PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察因素，采用L16(34)正交試驗(yàn)，因素與水平選擇見表5，正交試驗(yàn)方案與方差分析結(jié)果見表6、7。

表5 雙水相萃取正交試驗(yàn)因素水平表Table 5 Factors and their coded levels in orthogonal array design

表6 雙水相萃取L16(43)正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 6 Orthogonal array design and corresponding experimental results

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 7 Variance analysis of R-phycoerythrin purity with various extraction conditions

由表6可見，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對RPE純度的影響程度依次為：B(硫酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù))＞A(PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù))＞C(氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù))，由表7可知，硫酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對RPE純度有顯著影響，最佳萃取條件為A1B1C2，即所得RPE純度最高時的配比為6% PEG、13% Na2SO4、1.5% NaCl。

2.6 最佳工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取20g RPE粗液按正交試驗(yàn)所得最佳提取工藝條件(A1B1C2)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)5次。計算得出，RPE的純度為0.727，提取率為66.5%，說明此方法穩(wěn)定可行。

2.7 雙水相萃取與硫酸銨鹽析的提取效果比較

根據(jù)文獻(xiàn)[16]方法，向20g RPE粗液中加入飽和度為60%的硫酸銨，4℃放置過夜，10000×g離心10min，收集沉淀并用0.01mL/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)溶解稀釋至適量體積，測定RPE純度及提取率，并與ATPE法進(jìn)行比較。比較結(jié)果為ATPE法RPE純度0.727、提取率66.5%；硫酸銨鹽析法純度0.322、提取率85.4%。

由結(jié)果可知，ATPE所得RPE提取率雖稍低于鹽析法，但純度明顯得到很大提升。鹽析法可將RPE的純度由粗液的0.187上升為0.322，而通過ATPE法可達(dá)0.727，是鹽析法的2.25倍?？梢?，通過ATPE法使純度的提高，可減少鹽析法后續(xù)為進(jìn)一步純化而進(jìn)行的多次層析，從而減少了在層析過程中導(dǎo)致的蛋白流失，在經(jīng)濟(jì)適用的前提下還克服了提取率不及鹽析法的弱點(diǎn)，由此顯示了ATPE在工業(yè)生產(chǎn)上的優(yōu)勢。

另外，RPE的等電點(diǎn)為4.56左右，遠(yuǎn)離pH中性的雙水相體系環(huán)境，利于蛋白的分配；同時RPE在40℃以下及pH7.0時最為穩(wěn)定[16]，ATPE的溫和萃取條件也恰能最大程度的保持RPE的生物活性。

3 結(jié) 論

粗液純度0.187的條斑紫菜R-藻紅蛋白，通過雙水相萃取法的最佳工藝條件為6% PEG 4000、13% Na2SO4、1.5% NaCl，可得到RPE最高純度為0.727，是傳統(tǒng)硫酸銨鹽析法的2.25倍。相比鹽析法，雙水相萃取的生產(chǎn)工藝更加簡單，條件更加溫和，蛋白純度更高，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

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Process Optimization for Aqueous Two-phase Extraction of R-Phycoerythrin from Porphyra yezoensi

YUE Cen1，F(xiàn)ENG Wei-xi2，HUANG Wen2，WANG Yi1,*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；2. Lianyungang Chinese Medicine Branch, Jiangsu Union Technical Institute, Lianyungang 222006, China)

On the basis of one-factor-at-a-time experiments, an L16(43) orthogonal array design was performed to optimize process conditions for aqueous two-phase extraction of R-phycoerythrin from Porphyra yezoensi. The effects of PEGs of different molecular weights, PEG 4000 dosage, the concentration of Na2SO4 as the phase-forming salt and ionic strength on the extraction of R-phycoerythrin were examined. The results indicated that the optimal aqueous two-phase extraction conditions were PEG 4000 as the phase-forming polymer at 6%, Na2SO4concentration 13%, NaCl concentration 1.5%. After the optimized aqueous two-phase extraction, the purity of R-phycoerythrin was increased to 0.727 from 0.187, showing a 2.25-fold increase. Therefore, aqueous two-phase extraction is more suitable for R-phycoerythrin extraction than ammonium sulfate precipitation.

Porphyra yezoensis；R-phycoerythrin；aqueous two-phase extraction；optimization

TS201.21

A

1002-6630(2011)16-0041-04

2011-03-11

連云港市2008年科技發(fā)展計劃(綜合類)項(xiàng)目(ZH200808)

岳岑(1985—)，女，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：yuecen7@yahoo.com.cn

*通信作者：王益(1967—)，男，工程師，本科，研究方向?yàn)槭称芳庸?。E-mail：wywtx@mail.hzau.edu.cn