脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為Beagle犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植載體的實(shí)驗(yàn)研究

黃永玲 閆福華 鐘泉 江俊 林敏魁 趙欣 駱凱

·論著·

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為Beagle犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植載體的實(shí)驗(yàn)研究

黃永玲 閆福華 鐘泉 江俊 林敏魁 趙欣 駱凱

目的探討脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（Acellular dermal matrix，ADM）作為Beagle犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）移植載體的可行性。方法將BMSCs復(fù)合到ADM載體上，體外觀察ADM與BMSCs的生物相容性；ADM－BMSCs復(fù)合物植入裸鼠皮下，以單純ADM為對照組，分別于術(shù)后4周和8周進(jìn)行大體標(biāo)本觀察及組織學(xué)分析。結(jié)果體外觀察ADM與BMSCs的生物相容性良好。裸鼠皮下植入實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組4周后ADM部分降解吸收，BMSCs生長良好，出現(xiàn)新生組織，部分形成類骨樣結(jié)構(gòu)；8周后，ADM大部分吸收，形成大量的新生組織和類骨樣結(jié)構(gòu)；對照組新生組織形成較少，ADM支架材料降解速度與實(shí)驗(yàn)組類似。結(jié)論ADM可作為Beagle犬BMSCs的移植載體。

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞支架材料裸鼠

牙周病治療的目的是控制炎癥并重建喪失的牙周組織，形成新的附著及牙槽骨的再生。近年來，組織工程學(xué)的迅速發(fā)展,為牙周組織再生提供了新的思路，其研究的內(nèi)容包括種子細(xì)胞、支架材料及組織再生有關(guān)的生長因子等多個方面。在牙周組織工程中選擇合適的支架材料是個重要的問題。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（Acellular dermal matrix，ADM）具有良好的組織相容性、低抗原性、快速血管化和一定的穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)[1]。本實(shí)驗(yàn)以Beagle犬BMSCs為種子細(xì)胞，ADM為支架材料，觀察細(xì)胞在ADM表面的黏附情況；并將細(xì)胞載體復(fù)合物植入裸鼠皮下，觀察組織形成情況，探討ADM作為牙周組織工程支架材料的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性裸鼠6只，6周齡，體質(zhì)量16～18 g（購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司）。雄性Beagle犬1只，體質(zhì)量約10 Kg（購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物研究所）。實(shí)驗(yàn)動物購買后，飼養(yǎng)于中國人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與主要儀器

DMEM-LG培養(yǎng)基（Gibco，美國），新生牛血清（Gibco，美國），胰蛋白酶（Sigma，美國），L－谷氨酰胺（Sigma，美國），地塞米松（Sigma，美國），維生素C（Sigma，美國），β-甘油磷酸鈉（Sigma，美國）。生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司，上海），CO2培養(yǎng)箱（Heraeus，德國），熒光倒置相差顯微鏡（Olympus，日本），脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（桀亞萊福生物技術(shù)有限公司，北京），XL30型掃描電鏡（飛利浦有限公司，荷蘭）。

1.3 方法

1.3.1 ADM膜極性鑒別

通過肉眼大體觀察，常規(guī)HE染色，掃描電鏡觀察ADM的表皮面和真皮面結(jié)構(gòu)。

1.3.2 Beagle犬BMSCs體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定

參照文獻(xiàn)[2]方法，以全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSCs。氯胺酮全麻下，從Beagle犬股骨近端抽取骨髓7 mL，無菌條件下注入含無血清培養(yǎng)基20 mL的離心管，1 000 r/min、5 min離心2次，棄上清液，于100 mL培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，分別加入8 mL含10%胎牛血清的DMEM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（10-8mol/L地塞米松，50 mg/L維生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉）。于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，2 d后半量換液，5 d后全量換液。以后每隔3 d換液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)90%時，用2.5 g/L胰蛋白酶+1 g/L EDTA消化傳代。選取第3代成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞和未加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，分別以5.0×104個/孔接種于24孔板，每組6孔，每隔3 d換液，連續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見的白色結(jié)節(jié)，行Von Kosssa染色，倒置顯微鏡下觀察二者礦化結(jié)節(jié)染色情況，鑒定BMSCs是否成骨誘導(dǎo)成功。

1.3.3 細(xì)胞材料復(fù)合體的制備

將1 cm×1 cm的ADM剪成5 mm×5 mm大小，浸泡于含成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，觀察極性，使真皮面朝上。浸泡30 min后，吸去培養(yǎng)液，將其置入24孔板內(nèi)。將第3代BMSCs消化傳代后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107cells/L，每片ADM接種30 μL，然后37℃、5%CO2孵育2 h后取出，每孔中加入含10%胎牛血清的DMEM礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基800 μL，孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞附著情況。

1.3.4 Beagle犬BMSCs與ADM生物相容性的觀察

細(xì)胞-材料復(fù)合物制備后，孵育24 h，倒置相差顯微鏡、常規(guī)HE染色和掃描電鏡觀察BMSCs與ADM的復(fù)合情況。

1.3.5 BMSCs－ADM復(fù)合物植入裸鼠皮下

將24個細(xì)胞－材料復(fù)合物體外培養(yǎng)48 h后植入裸鼠一側(cè)皮下，于另一側(cè)裸鼠皮下植入單純ADM為對照組，每側(cè)分別植入2個樣本，共6只裸鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有的操作均在SPF級動物房的超凈臺內(nèi)進(jìn)行。將裸鼠用100 mg/Kg氯胺酮麻醉后消毒，于背部作前后兩個約0.6 cm的切口，分離皮下，將ADM真皮面朝下，從切口處塞向兩側(cè)，每個切口左右各塞一片膜。然后用5-0 Prolene不可吸收線嚴(yán)密縫合切口。術(shù)后將各組動物無菌條件下分籠飼養(yǎng)，觀察其生長狀況。分別于術(shù)后4周、8周時兩組隨機(jī)各選3只裸鼠切取標(biāo)本，4%多聚甲醛固定后，大體觀察標(biāo)本，10%EDTA脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，進(jìn)行Gomori[3]特殊染色。

2 結(jié)果

2.1 ADM極性鑒別

ADM在組織結(jié)構(gòu)上可分為表皮面和真皮面。肉眼觀察，表皮面對光反射時有光澤，表面有許多點(diǎn)狀凹陷和皮紋。真皮面對光無光澤，表面多隆起，無點(diǎn)狀凹陷和皮紋。組織學(xué)切片顯示，ADM的表皮面膠原較致密，孔隙較少，而真皮面膠原稀疏，存在很多不規(guī)則的空隙（圖1-A）。掃描電鏡顯示：ADM膜表皮面組織致密（圖1-B）；真皮面組織疏松，見大量的不規(guī)則的孔隙，呈篩孔狀（圖1-C）。

2.2 Von Kosssa染色鑒定BMSCs成骨誘導(dǎo)

成骨誘導(dǎo)組的BMSCs約3～4 d后有結(jié)節(jié)形成，未誘導(dǎo)組約6～7 d后才有結(jié)節(jié)形成。1周后，Von Kossa染色可見成骨誘導(dǎo)組形成的結(jié)節(jié)數(shù)目明顯高于未誘導(dǎo)組（圖2）。

2.3 Beagle犬BMSCs與ADM生物相容性的觀察

接種24 h后，倒置相差顯微鏡觀察，顯示ADM膜內(nèi)的BMSCs生長旺盛，細(xì)胞呈梭形，排列具有一定的方向性，未見ADM對BMSCs產(chǎn)生明顯影響（圖3-A）。HE染色（圖3-B）和掃描電鏡下觀察（圖3-C）均見接種的BMSCs在ADM膜中貼附伸展?fàn)顟B(tài)良好，部分細(xì)胞伸出偽足到ADM膜孔隙中。

2.4 BMSCs－ADM復(fù)合物置入裸鼠體內(nèi)生長情況

大體觀察：術(shù)后4周時，對照組ADM變得具有彈性，透明度下降；實(shí)驗(yàn)組ADM肉眼可見大面積的乳白色區(qū)域，整個ADM開始變硬。8周時，對照組出現(xiàn)部分白色區(qū)域，部分ADM開始吸收、變小；實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本乳白色區(qū)域面積更大，質(zhì)地更為堅(jiān)硬。

Gomori特殊染色：對照組4周后周圍細(xì)胞開始進(jìn)入ADM內(nèi)部，借助原有的膠原支架，開始自體化，Gomori染色陰性（圖4-A）。實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本可見BMSCs聚集生長，分泌基質(zhì)，并有血管長入，形成的基質(zhì)經(jīng)Gomori特殊染色，部分被染為紅色，證明為新形成的骨組織（圖4-B）。8周時，對照組周圍細(xì)胞大面積進(jìn)入ADM膜，部分ADM出現(xiàn)完全自體化。盡管周圍細(xì)胞進(jìn)入較多，但新生成的膠原纖維仍較少，周圍細(xì)胞只是占據(jù)原有的膠原支架生長，Gomori染色陰性（圖4-C）。實(shí)驗(yàn)組Gomori特殊染色見紅色區(qū)域（即類骨樣組織）面積在增大（圖4-D）。

圖1 ADM結(jié)構(gòu)Fig.1The structure of ADM

圖2 Von Kosssa染色（100×）Fig.2Von Kosssa staining(100×)

圖3 BMSCs與ADM的生物相容性觀察Fig.3The biocompatibility of ADM and BMSCs

圖4 Gomori特殊染色（400×）Fig.4Gomori special staining(400×)

3 討論

近年來，組織工程學(xué)的迅速發(fā)展為牙周組織再生提供了新的思路。種子細(xì)胞、支架材料是組織工程研究中的兩個重要方面。BMSCs是成體干細(xì)胞之一，具有多向分化潛能，在不同環(huán)境和相應(yīng)細(xì)胞因子作用下，能向骨、軟骨、肌肉和神經(jīng)等中胚層或外胚層組織細(xì)胞分化[4－5]，是目前用于牙周組織工程研究中主要的種子細(xì)胞之一，但對于其適宜的支架材料的選擇仍不明確。

支架材料是組織工程技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)，在實(shí)施修復(fù)的過程中，不僅直接支持細(xì)胞和組織，還能影響細(xì)胞的形態(tài)，調(diào)控細(xì)胞的正常代謝、遷移、增殖。理想的支架材料應(yīng)具備良好的生物相容性和表面活性，良好的可塑性以及生物降解性，并且具備三維立體結(jié)構(gòu)及高度的多孔性，以便于種子細(xì)胞的植入和黏附，同時也要保證營養(yǎng)成分的滲入以及代謝產(chǎn)物的排出[6]。目前，BMSCs常用的支架材料有人工合成的聚酯類材料（如乙烯－乙酸乙烯共聚物、聚乙交酯、聚乳酸等）、羥基磷灰石、β-磷酸三鈣、可溶性鈣磷玻璃等生物活性材料以及膠原蛋白等多種類型。

ADM是最近幾年發(fā)現(xiàn)的一種天然生物材料，最初用作真皮替代物，現(xiàn)已用于燒傷整形[7－8]、普通外科學(xué)[9]、口腔醫(yī)學(xué)[10-13]等學(xué)科領(lǐng)域的研究。國內(nèi)外已有大量的研究表明，ADM具有良好的生物相容性、低抗原性、快速血管化等優(yōu)點(diǎn)[14]。Vendramini等[15]通過一氧化氮及過氧化氫實(shí)驗(yàn)，表明ADM與巨噬細(xì)胞生物相容性良好。Krejci等[16]證實(shí)成纖維細(xì)胞接種于ADM后，不僅能在其中生長，而且還能沿著原毛囊及汗腺向真皮內(nèi)部浸潤生長達(dá)到真皮網(wǎng)狀層。汪海輪等[17]通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)及皮下埋藏實(shí)驗(yàn)表明ADM無毒性，成纖維細(xì)胞在ADM微粒上增殖良好，且無排異反應(yīng)。馬紹英等[18]的研究也表明，人成纖維細(xì)胞可以在ADM中黏附增殖。本實(shí)驗(yàn)通過倒置相差顯微鏡、HE染色及電鏡下觀察Beagle犬BMSCs與ADM復(fù)合情況，提示ADM無毒性，BMSCs可在其中生長增殖，二者生物相容性較好。

在牙周病學(xué)領(lǐng)域，ADM受到越來越多研究者的重視。Fotek等[10]在植骨術(shù)中，比較了ADM膜和聚四氟乙烯酸（Polytetrafluoroethylene，PTFE）膜覆蓋創(chuàng)面后的愈合效果，結(jié)果表明二者愈合效果無顯著差異。大量研究表明，ADM膜也是一種較好的引導(dǎo)骨再生的材料[19-21]。但目前大部分研究都只關(guān)注ADM膜的屏障功能，有關(guān)ADM膜是否可直接作為成骨細(xì)胞載體使用的報(bào)道較少。江健等[22]將其作為軟骨細(xì)胞移植載體修復(fù)兔軟骨缺損，證明ADM的組織相容性好，適于細(xì)胞黏附及長期生長。ADM膠原支架在兔體內(nèi)可基本降解，未見排異反應(yīng)，12周時實(shí)驗(yàn)組兔軟骨缺損基本修復(fù)，24周后軟骨缺損修復(fù)且ADM在體內(nèi)完全降解。本實(shí)驗(yàn)選用ADM作為BMSCs的支架材料進(jìn)行裸鼠皮下實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，BMSCs在裸鼠體內(nèi)生長良好，且隨著時間的延長，ADM逐漸降解，而BMSCs增殖旺盛并分泌大量基質(zhì)，同時可見血管的長入，并有特征性類骨樣結(jié)構(gòu)的生成。因此，我們認(rèn)為ADM膜與成骨細(xì)胞具有良好的生物相容性，細(xì)胞可在其中生長繁殖。我們在前期研究中使用ADM作為載體，在裸鼠背部皮下植入PDGF-B轉(zhuǎn)染的牙齦成纖維細(xì)胞，也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組中ADM具有類骨樣結(jié)構(gòu)[23]。

本實(shí)驗(yàn)通過體內(nèi)外研究表明，ADM與Beagle犬的BMSCs具有良好的生物相容性，可作為其移植載體。研究結(jié)果也進(jìn)一步表明，ADM可為細(xì)胞的生長和分化提供理想的三維空間，并具備作為牙周組織工程支架材料的潛力，在組織工程化牙周膜的構(gòu)建中具有良好的應(yīng)用前景。

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An Experimental Study on Cellular Dermal Matrix as a Transplantation Scaffold for Bone Marrow Stromal Cells in Beagle Dogs

ObjectiveTo explore the feasibility of the acellular dermal matrix(ADM)as a transplantation scaffold for bone marrow stromal cells(BMSCs)in Beagle dogs.MethodsThe induced BMSCs were seeded onto ADM and the biocompatibility of ADM and BMSCs were observed in vitro.The ADM and BMSCs complex were then implanted subcutaneously in nude mice as the experimental group,and the only ADM was also implanted at the other side of the nude mice as the control group.Formed tissues were harvested for gross observation and histological analysis at 4 and 8 weeks after implantation.ResultsThe biocompatibility of ADM and BMSCs was good in vitro.In the experimental group, histological analysis demonstrated obvious degradation of ADM,good growth of BMSCs,extensive formation of new tissue and bone-like tissue at 4 weeks after surgery.At 8 weeks after surgery,the degradation of ADM was even more obvious,and more extensive formation of bone was observed.In the control group,less new tissue was formed and the degradation speed of ADM scaffold materials was similar with the experimental group.ConclusionIt is feasible for ADM as a transplantation scaffold for BMSCs in Beagle dogs.

Acellular dermal matrix;Bone marrow stromal cells;Scaffold;Nude mice

Q813.1+2

A

1673－0364（2011）04－0181－05

HUANG Yongling,YAN Fuhua,ZHONG Quan,JIANG Jun,LIN Minkui,ZHAO Xin,LUO Kai.Key
Laboratory of Stomatology,School of Stomatology,Fujian Medical University,Fuzhou 350002,China.Corresponding author: YAN Fuhua(E-mail:fhyan2005@126.com).

2011年5月23日；

2011年7月2日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.04.001

國家自然科學(xué)基金（30471892），福建省自然科學(xué)基金（2008J0085），福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)學(xué)術(shù)發(fā)展基金（閩醫(yī)大口腔[2008]39號）。

350002福建省福州市福建省高?？谇会t(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院。

閆福華（E-mail:fhyan2005@126.com）。