腫瘤細胞增殖特異性分子影像探針3'-脫氧-3'-[18F]氟胸苷的自動化生產

王明偉 章英劍 張勇平

（復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科 復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系 上海 200032）

3'-脫氧-3'-[18F]氟胸苷(18F-FLT)是胸苷激酶-1(TK-1)的底物，參與DNA合成，是一種特異性細胞增殖顯像探針[1,2]。放射性核素標記胸苷用于檢測細胞增殖早已成為生命科學領域內重要的研究手段，用于體外細胞實驗的3H標記胸苷已近半個世紀，短半衰期核素11C(t1/2=20.4 min)標記胸苷用于荷瘤鼠PET顯像實驗則始于1978年Crawford等的研究[3]。1991年后，較長半衰期的理想核素18F(t1/2=109.6 min)標記胸苷類似物18F-FLT[4]、1-(2'-脫氧-2'-[18F ]氟-b-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-甲基尿嘧啶(18F-FMAU)[5]和 2'-脫氧-2'-[18F]氟胸苷(18F-FT)[6]，相繼用于細胞增殖顯像或基因顯像，三者化學結構式見圖1。目前，臨床上18F-FLT PET/CT顯像已廣泛用于包括腦瘤和肺癌等的研究[2,7]。因此，有必要建立18F-FLT自動化生產方法以滿足臨床需要。

圖1 胸苷及其18F標記類似物Fig.1 Thymidine and its 18F-labeled analogues.

18F-FLT自動化生產主要取決于放射化學合成和自動化合成模塊。從1991年Wilson等[4]開始，根據(jù)標記前體化合物的結構類型，18F-FLT放化合成的第一步反應即親核[18F]氟化標記可分為兩大類：3-N-和5'-O-受保護的胸苷衍生物(I)為前體[8–10]和2,3'-脫水胸苷衍生物(II)為前體[11,12](圖2)。其中(I)較好，優(yōu)化放化產率的研究表明，其最佳結構為R1=Ns，R2= DMTr，R3=BOC[9,10]，對應的化合物為3-N-t-叔丁氧羰基-5'-O-二甲氧基三苯基-3'-O-對硝基苯磺?；?胸苷(BDNT)。目前，BDNT作為標記前體是18F-FLT自動化合成的首選，其放化產率可為20%–40%(因合成模塊而異)[13–17]。然而，由于合成模塊自身的局限性，現(xiàn)有18F-FLT自動化合成法存在反應條件不易控制、無連續(xù)多次合成的能力等缺點。

基于PET分子影像探針藥物自動化合成法[18–20]，本文以BDNT為標記前體，采用“一鍋-兩步”法，用升級改進的Explora GN模塊和半制備HPLC分離純化系統(tǒng)，完成親核放射[18F]氟化反應、水解反應、分離純化與質量控制，發(fā)展了18F-FLT的快速、穩(wěn)定和高產率的自動化生產，實現(xiàn)18F-FLT的常規(guī)化生產。

圖2 18F-FLT的兩類前體化合物Fig.2 Two types of precursors of 18F-FLT.

1 實驗材料和儀器

1.1 試劑與材料

前體3-N-t-叔丁氧羰基-5'-O-二甲氧基三苯基-3'-O-對硝基苯磺?；?胸苷(BDNT)、參考品3'-脫氧-3'-[19F]氟胸苷(FLT)，德國ABX公司產品；K222(Kryptofix 222)、無水乙腈和無水碳酸鉀，美國Sigma- Aldrich公司產品；HPLC/光譜純乙腈，美國TEDIA公司產品；富[18O]氧水，以色列Rotem公司產品。藥用乙醇，南京化學試劑有限公司產品。醋酸鈉、濃鹽酸、甲醇和二氯甲烷等均為國產分析純或光譜純，購自國藥集團上?；瘜W試劑公司。所有化學藥品均未進一步純化，直接使用。

Sep-Pak Plus QMA和中性 Al2O3柱，美國Waters公司產品；GF254薄層層析硅膠板(2.5 cm×10.0 cm，玻璃基片)，山東煙臺匯友硅膠開發(fā)有限公司產品；Millexò-GS 0.22 mm 微孔過濾器，Milipore公司產品。

1.2 儀器

醫(yī)用回旋加速器(Eclipse ST,40 mA×11 MeV)、18F正電子藥物合成模塊(Explora GN, 配有可編寫合成控制軟件)和半制備型高效液相色譜儀(HPLC,Explora LC, 配有紫外和放射性檢測器)，德國Siemens公司產品；ODS-BP C18半制備柱 (10 μm, 10×250 mm)，中國大連依利特分析儀器公司產品；分析型 HPLC(1200系列)，配有四元梯度泵、可變波長檢測器、流式g放射性檢測器(Gabi Star,德國 Raytest 公司)、Zorbax 300SB-C18 分析柱(4.6×250 mm, 5 mm)、真空脫氣機和 ChemStation 色譜控制和分析軟件，美國Agilent公司產品；放射性薄層色譜掃描儀(miniGita Star)，配有BGO-V探頭、miniGita儀器控制軟件和GINA- Star TLC色譜分析軟件，德國 Raytest 公司產品；超純水制備系統(tǒng)(Synergy?UV)，美國Milipore公司產品；放射性活度計(CRC?-15PET)，美國Capintec公司產品。

2 實驗內容

2.1 18F-FLT的放射化學合成路線

本文取BDNT為標記前體[9,13]和“一鍋-兩步”法，圖3為18F-FLT的合成路線，包括前體BDNT的親核放射[18F]氟化反應、水解反應、中和與分離純化。具體過程如下：首先，干燥活化的18F離子與前體BDNT在無水乙腈中120oC加熱氟化反應5 min，產生標記中間體 3-N-t-叔丁氧羰基-5'-O-二甲氧基三苯基-2'-脫氧-3'-[18F]氟胸苷(18F-BDFT)；再加入鹽酸溶液，110°C加熱水解反應5 min；最后，加入醋酸鈉溶液中和，經過 HPLC分離純化即獲得18F-FLT注射液。

圖3 18F-FLT的放射化學合成Fig.3 Radiochemical synthesis of 18F-FLT.

2.2 自動化合成模塊

合成模塊是經過升級改進即配有Explora LC分離系統(tǒng)的 Explora GN模塊，其詳細結構參見文獻[21]。其中，Explora GN是多功能18F標記PET顯像探針藥物的自動化合成模塊，具有連續(xù)多次合成的特點。Explora LC是集成化半制備HPLC分離系統(tǒng)，適合安裝于屏蔽熱室內，而且自身配有紫外和放射性檢測器，方便用于放射性藥物的分離純化。

2.3 18F-FLT的自動化合成

運行合成模塊的自動化清洗程序，進行模塊準備工作。將各種反應試劑、試劑瓶和預處理后的QMA柱和Al2O3柱等放置于對應位置，正確連接，并進行壓力和真空測試。準備就緒，關閉熱室，運行預先編寫的18F-FLT自動化合成程序，控制合成模塊執(zhí)行所有自動化合成步驟。

18F-FLT的自動化合成過程如下：質子轟擊后，用N2壓力使含有18F離子的富[18O]氧水通過QMA柱，18F離子被吸附而留在柱上，富[18O]氧水被收集到回收瓶中；定量轉移1.2 mL K222/K2CO3的乙腈-水溶液(K222: 15.0 mg/mL, K2CO3: 2.75 mg/mL, 乙腈:水=39:1 (V/V))，淋洗QMA柱，18F離子的洗脫液收集在反應瓶中；100oC加熱，通氣鼓泡，蒸發(fā)吹干，除去溶劑；再加入1.5 mL無水乙腈，110oC加熱，通氣鼓泡，蒸發(fā)吹干，完全除去水分；轉移前體BDNT(30.0 mg)的無水乙腈溶液(1.0 mL)到反應瓶內，120oC加熱回流5.0 min，進行放射氟化反應。反應液被冷卻后，轉移 2.0 mL HCl溶液(1.0 mol/L)到反應瓶中，110oC加熱回流5.0 min，完成水解反應。冷卻反應液后，加入3.5 mL NaOAc溶液(1.0 mol/L)進行中和。將18F-FLT反應混合物溶液過 Al2O3柱和微孔過濾器(0.45 mm, 水相)，收集在HPLC進樣器內，體積約5.0 mL。

2.4 18F-FLT的分離純化

啟動HPLC進樣器，將其中18F-FLT粗產品溶液注射到5.0 mL進樣環(huán)內。運行Explora LC程序，開始18F-FLT的分離純化，其條件是：流動相為藥用乙醇:水=10:90 (V/V)，流速為3.0 mL/min，分離柱為半制備反相ODS-BP C18柱。18F-FLT的保留時間為20.0 min，收集時間在19.5–21.5 min。所得組份峰溶液經過0.22 μm無菌過濾器，收集在產品瓶，即獲得無色、透明的18F-FLT注射液。

2.5 18F-FLT的質量控制

開展如下實驗，評價18F-FLT溶液的質量控制指標。分析型 HPLC和放射性薄層掃描色譜(radio-TLC)用于測定18F-FLT的放射化學純度和化學純度。HPLC流動相是乙腈:水=10:90(V/V)，流速為1.0 mL/min，分析柱為Zorbax 300SB-C18柱，采取260 nm UV和放射性檢測器。radio-TLC的展開劑是三氯甲烷:甲醇=4:/1(V/V)，薄層板為GF254硅膠板。用HPLC測定18F-FLT的比活度，檢測其3個半衰期內的放射化學純度，檢驗其穩(wěn)定性。目測其外觀顏色和澄清度，用精密pH試紙測pH值，TLC層析和碘蒸汽顯色法檢測K222。參考2005年版國家藥典進行異常毒性實驗、細菌內毒素實驗、無菌實驗等。

3 結果與討論

本文以BDNT為標記前體，基于“一鍋-兩步”法，利用經過升級改進即配有HPLC分離系統(tǒng)的Explora GN模塊，發(fā)展了18F-FLT的自動化生產方法，其主要參數(shù)與實驗結果見于表1。該方法合成18F-FLT的總時間小于65 min，放射化學產率為15%–25%(未衰減校正，n＞20)，放射化學純度大于99%，滿足了18F-FLT的常規(guī)臨床腫瘤PET/CT顯像診斷的需求。

18F-FLT自動化合成的首要條件是其成功的放射化學合成路線。目前，成功用于18F-FLT合成的標記前體化合物主要分為(I)和(II)兩大類(圖2)，其選擇決定了18F-FLT的放化合成路線和產率高低?；衔?II)為標記前體時，通常反應條件較為苛刻(DMSO為溶劑、加熱溫度高達160oC)，18F-FLT的放化產率<10%[11,12]，故很少被自動化合成法采用[22]。大量研究表明，化合物(I)、特別是BDNT(結構式中R1=Ns, R2=DMTr, R3= BOC)是18F-FLT理想的標記前體，成為發(fā)展18F-FLT自動化合成法的首選，其反應條件溫和(乙腈為溶劑、溫度通常為110–130oC)，放化產率高(20%–40%)[8–10,13–17]。進一步優(yōu)化BDNT為前體的實驗發(fā)現(xiàn)，BDNT用量和堿K2CO3用量是影響18F-FLT放化產率的主要因素[10,23]。Suehiro等[23]報道，BDNT與K2CO3摩爾比大于1.5，18F-FLT的產率趨于飽和而穩(wěn)定。我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)，K2CO3用量不變，BDNT為10–15 mg時，18F-FLT的產率低且不穩(wěn)定；而為30 mg時，產率高并且穩(wěn)定。因此，本文中BDNT和K2CO3的用量分別為30 mg和3.3 mg，其摩爾比為1.5，18F-FLT的放化產率為15%–25%(未衰減校正)，以(4.44–5.55)×1010Bq的18F離子開始，其典型產量為(0.74–1.11)×1010Bq18F-FLT。

18F-FLT的自動化合成還依賴于合適的放射性藥物化學合成模塊。到目前為止，以BDNT為起始反應物，已有多種商品化模塊被用于18F-FLT自動化合成，它們的主要參數(shù)和結果見表1。然而，Oh等[13]使用的TracerLab Mx模塊無冷卻功能，[18F]氟化反應需先高溫-后低溫的兩階段加熱，并于結束后先將反應液轉移到相鄰的注射器內以降低壓力，使其步驟多并導致放射性殘留損失。其它模塊的主要局限性是不能連續(xù)多次合成，一次試劑準備，只能進行單次合成[14–16]。本文采取的Explora GN模塊具備快速加熱升溫和冷卻、及多次定量轉移、添加試劑的能力，具有多次合成18F-FLT的優(yōu)勢。另外，分離純化功能是自動化合成模塊的重要組成部分。根據(jù)所用模塊的特點，不同作者使用了HPLC[13,14]或固相萃取(SPE)分離純化18F-FLT[15,16]。Bourgeois等[24]認為，HPLC分離純化18F-FLT最為可靠，各項指標均嚴格符合臨床用放射性藥物的質量標準。我們的實驗表明，18F-FLT合成過程中產生大量化學雜質，進行HPLC時須仔細檢驗流動相，以免雜質混入產品18F-FLT溶液(圖4)。例如，流動相為乙醇:水=20:80(V/V)時，保留時間為9.5 min，產品18F-FLT的放射性峰與雜質的紫外峰緊密相連(圖4a)；流動相為10/90(V/V)時，保留時間延長為20.0 min，則產品峰與相鄰雜質峰完全分開(圖4b)，充分保證了18F-FLT的化學純度。

表1 18F-FLT各種自動化合成的主要參數(shù)與結果 (BDNT為前體)Table 1 Major parameters and results of various automated syntheses of 18F-FLT (BDNT as precursor)

圖4 18F-FLT分離的半制備HPLC譜圖。流動相乙醇:水的體積比為20:80 (a) 和 10:90 (b)Fig.4 Semipreparative HPLC of 18F-FLT separation.EtOH/H2O in 20/80 (a) and 10/90 (b) as mobile phase.

18F-FLT注射液的各項質量控制指標均符合臨床放射性藥物的質控要求，具體實驗結果如下。HPLC和radio-TLC的結果顯示，18F-FLT的放射化學純度大于99%，對應的保留時間和比移植分別為6.2 min(圖5a)和0.58(圖5c)，前者與參考標準品FLT的保留時間一致(圖5d)。HPLC的UV色譜進一步表明其化學純度高(圖5b)，除了容積峰以外，沒有其它化學雜質存在。18F-FLT注射液外觀呈無色透明，pH 值為 7.0，比活度為(2.32±0.27)×1014Bq/mmol，放射性濃度大于 1.11×109Bq/mL。經過HPLC檢驗，18F-FLT注射液的穩(wěn)定性良好，3個半衰期之內放射化學純度沒有明顯變化。細菌內毒素實驗和無菌實驗結果均為陰性，異常毒性實驗結果正常，所有實驗動物均無異常行為表現(xiàn)。

4 結論

利用升級改進的Explora GN模塊和半制備HPLC，采取基于標記前體BDNT的“一鍋-兩步”法的放射化學合成路線，我們發(fā)展了18F-FLT的自動化生產方法。18F-FLT的總合成時間小于65 min，放射化學產率為15%–25%(未衰減校正，n＞20)，放射化學純度大于99%，并具有很高的化學純度和比活度。該方法實現(xiàn)了18F-FLT快速、穩(wěn)定和高產率的自動化生產，又具有連續(xù)多次合成的能力，將會大大方便18F-FLT臨床應用、特別有利于其多中心臨床研究的大量藥物配送。

圖5 18F-FLT注射液的分析型HPLC (放射性信號(a)和紫外信號(b))和radio-TLC ((c), 展開距離為50–110 mm) 圖譜和標準品FLT的HPLC圖譜(d)Fig.5 Analytical HPLC spectrums of the 18F-FLT radioactive trace (a) and UV trace (b), the radio-TLC (c) with 50–110 mm as developing distance, and HPLC spectrum of standard FLT(d).

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