5-脂氧合酶與動脈粥樣硬化關(guān)系研究進(jìn)展

劉春麗綜述 蔡 輝審校

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是心腦血管疾病的重要病理生理基礎(chǔ),近年來,大量人體和動物實驗研究表明,5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase,5-LO)在 AS形成中發(fā)揮重要作用。本文就5-LO與AS形成的有關(guān)內(nèi)容作一綜述。

1 5-LO的生物學(xué)特性

1.1 5-LO途徑

5-LO是三種脂氧合酶(5-LO、12-LO、15-LO)同工酶的一種,分子量約為72 000～80 000D,是機(jī)體催化花生四烯酸(Arachidonic Acid,AA)生成生物活性分子—白三烯(Leukotrienes,LTs)的關(guān)鍵酶。人5-LO基因位于10號染色體上,長度為82kb,主要包括14個外顯子(Exons),13個內(nèi)含子(Introns)。5-LO蛋白主要由調(diào)節(jié)區(qū)和催化區(qū)兩個區(qū)域組成,二者均具有典型C2結(jié)構(gòu)域,其中含有的β折疊結(jié)構(gòu)主要與鈣離子、核苷酸、磷脂類結(jié)合[1],酶的催化活性主要受調(diào)節(jié)區(qū)控制。

在動物體內(nèi),5-LO催化 AA,產(chǎn)生5-羥-6,8,11,14-二十四碳四烯酸,生成環(huán)氧化物白三烯 A4(LTA4),LTA4在LTA4水解酶和 LTC4合成酶作用下分別生成 LTC4、LTD4,LTD4在脫肽酶作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成LTE4,后三者結(jié)構(gòu)中均含有半胱氨酸,故又合稱為半胱氨酸白三烯(Cysteinyl-Leukotrienes,CysLTs),這條合成LTs的途徑稱之為5-LO途徑(5-Lipoxygenase Pathway)。研究發(fā)現(xiàn),5-LO途徑生成的LTs與細(xì)胞膜特殊G蛋白耦聯(lián)LTs受體結(jié)合,其中LTB4主要與 LTB受體(包括LTBR1和LTBR2),Cys-LTs主要與 CysLT受體(包括CysLTR1和 CysLTR2)通過促進(jìn)炎性細(xì)胞黏附、脫顆粒(Degranulation)反應(yīng),增加血管通透性(Vascular Permeability)等作用,參與血管炎癥、動脈內(nèi)膜損傷過程。此外,近年研究發(fā)現(xiàn),5-LO途徑還具有轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)信號的作用。Orasanu等[2]發(fā)現(xiàn)5-LO途徑產(chǎn)物L(fēng)TB4與細(xì)胞核受體結(jié)合后,激活過氧化物酶體增生物激活受體-α(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor,PPAR-α),并誘導(dǎo) PPA R-α敏感基因轉(zhuǎn)錄,加劇內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

5-LO作為白三烯合成限速酶,主要定位于血清和/或細(xì)胞核中,免疫組化分析顯示5-LO主要表達(dá)于小鼠動脈粥樣硬化斑塊的巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中。動脈內(nèi)皮細(xì)胞雖不表達(dá)5-LO,但跨膜細(xì)胞代謝產(chǎn)生的LTA 4與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的LTA 4水解酶、LTC4合成酶結(jié)合后,生成 LTB4和CysLTs,進(jìn)而對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生作用。

1.2 5-LO活性調(diào)節(jié)因素

5-LO活性水平受多種因素調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白水平是5-LO激活的決定因素。研究發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞遷移至炎癥位點后,鈣離子釋放活化鈣通道(Calcium-Activated Release Channel,CA RC)開放后,細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高,鈣離子通過與5-LO的N末端C2樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合后,增加5-LO疏水性,促其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜,進(jìn)而與膜上5-LO激活蛋白(5-Lipoxygenase Activating Protein,FLAP)結(jié)合而發(fā)揮作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度在4～10μmol/L時,5-LO達(dá)到最高活性水平。體內(nèi)激酶水平對細(xì)胞5-LO活性也起重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn),絲裂原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶2(Mitogen-Activated Protein Kinase-Activated Protein 2,MAPKAP-K2)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular Signal-Regulated Kinase,ERK)通過磷酸化5-LO后,均可導(dǎo)致其活性水平升高[3]及與細(xì)胞膜結(jié)合作用增強(qiáng)。當(dāng)給予MAPKAP-K2和ERK抑制劑后,5-LO活性和膜結(jié)合能力均受到抑制。5-LO核心啟動子去甲基化(Demethylation)是5-LO完全表達(dá)的先決條件,當(dāng)用一種去甲基化抗原處理培養(yǎng)中的巨噬細(xì)胞,即能明顯上調(diào)這些細(xì)胞5-LO m RNA表達(dá)水平。此外,Fair等[4]研究發(fā)現(xiàn),利用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)處理U937和HL60髓細(xì)胞后,能夠顯著增加5-LO轉(zhuǎn)錄活性和FLAP的表達(dá)。

2 5-LO與AS

大量人體和動物實驗研究表明,5-LO在正常血管內(nèi)膜中表達(dá)很少或幾乎不表達(dá),而在AS損傷動脈中大量存在,主要集中于巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等,且與AS內(nèi)膜損傷程度呈正比。Mehrabian等[5]研究發(fā)現(xiàn),5-LO大量表達(dá)于載脂蛋白E和低密度脂蛋白受體基因敲除(ApoE-/-/LDLR-/-)小鼠AS斑塊中,當(dāng)將 5-LO+/-小鼠骨髓移入LDLR-/-高膽固醇血癥小鼠體內(nèi)后,子代LDLR-/-/5-LO-/-小鼠體內(nèi)AS動脈損傷明顯減少,5-LO mRNA表達(dá)水平較對照組小鼠降低5倍。此外,5-LO途徑下游產(chǎn)物L(fēng)TB4能夠減少脂肪細(xì)胞對游離脂肪酸的攝取,造成血清游離脂肪酸水平升高;而5-LO抑制劑能夠降低脂肪組織脂解(Lipolysis)和改善體內(nèi)脂質(zhì)代謝。在對ApoE-/-高脂血癥小鼠肝細(xì)胞的變性研究時發(fā)現(xiàn),在5-LO基因敲除小鼠體內(nèi),PPAR-γ、胰島素受體底物-1(Insulin Receptor Substrate-1)以及脂聯(lián)素(Adiponectin)表達(dá)水平均上調(diào),導(dǎo)致機(jī)體脂肪組織對胰島素敏感性顯著增強(qiáng)[6]。亦即5-LO的作用從多個方面影響AS形成。

2.1 5-LO基因多態(tài)性與心血管病變

人的5-LO基因起始密碼子ATG上游145～179bp有一富含GC區(qū),可以與轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合,核心啟動子GC區(qū)包含5個 Sp1/Egr1結(jié)合序列串。Geiger等[7]通過對187名健康無親緣關(guān)系的高加索人群5-LO基因結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn),Sp1/Egr1啟動子串聯(lián)重復(fù)序列突變率最高的等位基因頻率為84%。啟動子GC框變異能夠顯著增加血管內(nèi)-中膜厚度,提高血清C-反應(yīng)蛋白水平,并與LTs水平一致,表明該變異可能通過上調(diào)5-LO蛋白表達(dá)而發(fā)揮作用[8]。Dwyer等[9]對470名來自洛杉磯AS協(xié)會成員5-LO啟動子基因研究后發(fā)現(xiàn),6%成員發(fā)生變異,與正常野生基因組相比,攜帶兩種變異等位基因者頸動脈內(nèi)-中膜厚度增加80±19μm,但給予n-3游離脂肪酸飲食以競爭性抑制5-LO底物后,能夠減少AS發(fā)生,表明5-LO啟動子基因變異與AS形成有關(guān)。Allayee等[10]也發(fā)現(xiàn)5-LO啟動子等位基因變異導(dǎo)致5-LO表達(dá)增加,增加AS和心肌梗死發(fā)生風(fēng)險。但Maznyczka等[11]通過對北美高加索人群5-LO基因進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn),5-LO基因多態(tài)性并不是該人群心肌梗死的主要危險因素。

2.2 5-LO與炎癥

炎癥是AS形成的重要因素,大量炎性細(xì)胞聚集、激活,釋放大量細(xì)胞因子,造成內(nèi)膜炎癥反應(yīng),最終損傷血管結(jié)構(gòu)。

研究發(fā)現(xiàn),在人 AS內(nèi)膜中,炎癥激活的巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞均大量表達(dá)5-LO,在單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為組織巨噬細(xì)胞過程中,5-LO表達(dá)水平明顯上調(diào),然而在非炎癥期,5-LO活性水平無明顯變化。Horrillo等[12]發(fā)現(xiàn),在肥胖小鼠脂肪細(xì)胞中,5-LO在FLAP輔助作用下,激活脂肪細(xì)胞核因子-κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB),促進(jìn)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1)、白介素(Interleukin,IL-6)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factorα,TNF-α)釋放增加,加劇脂肪組織炎癥反應(yīng)。單核細(xì)胞聚集、黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞,最終激活、衍化成泡沫細(xì)胞是AS形成的早期事件和始動環(huán)節(jié)。MCP-1是激活單核細(xì)胞聚集、黏附過程最重要的細(xì)胞因子。在單核細(xì)胞中,5-LO能夠通過細(xì)胞表面LTB1R和LTB2R作用,快速誘導(dǎo)MAPKs,ERK1/2和Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal Kinase,JNK)1/2、磷脂酰肌醇-3-激酶/丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Phosphatidylinositol-3-kinase/Alanine Aminotransferase,PI3K/Akt)磷酸化,并在MAPK-ROS(Reactive Oxygen Species)依賴機(jī)制下增加NF-κBDNA結(jié)合活性,參與炎癥過程。在ApoE-/-/5-LO-/-小鼠損傷動脈內(nèi)膜中,MCP-1合成明顯減少。5-LO途徑合成的 LTB4通過 LTBR1介導(dǎo),通過激活ERK 1/2或JNK/MAPK通路,增加MCP-1轉(zhuǎn)錄活性,并呈時間和劑量依賴性,但這種作用能被LTBR1受體拮抗劑-CP105、696阻斷[13]。另外,LTB4還能增加IL-6、TNF-α表達(dá),促進(jìn)血管炎癥發(fā)生[14]。研究發(fā)現(xiàn),5-LO參與激活的炎癥反應(yīng)參與多種疾病的發(fā)生,而且這種炎癥對激素治療無效,但給予LTB1或CysLT1受體拮抗劑后,可明顯抑制這種炎癥反應(yīng)[15]。

2.3 5-LO與血管內(nèi)膜增生及斑塊形成

研究發(fā)現(xiàn),5-LO途徑與AS內(nèi)膜增生及斑塊形成密切相關(guān)。細(xì)胞因子IL-1β能夠促進(jìn)內(nèi)膜增厚、平滑肌細(xì)胞增殖,5-LO能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌IL-1β,當(dāng)抑制5-LO或FLAP作用時,IL-1β分泌減少。AS斑塊造成的血管狹窄起始于血小板沉積,由激活的血小板釋放大量促有絲分裂物質(zhì)促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生而形成。Berg等[16]通過RT-PCR等檢測發(fā)現(xiàn),當(dāng)成纖維細(xì)胞與血小板相互作用1h后,前者5-LO蛋白表達(dá)明顯增加,成纖維細(xì)胞增生作用也明顯增強(qiáng),當(dāng)給予5-LO抑制劑5,6-dAA(5,6-Dehydro Arachidonic Acid)處理后,成纖維細(xì)胞增殖作用明顯受到抑制,表明5-LO介導(dǎo)血小板誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖過程。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular Endothelial Cell Growth Factor,VEGF)在 AS形成中發(fā)揮重要作用,除了促進(jìn)血管生成,還有利于斑塊形成,增加血管通透性,介導(dǎo)單核細(xì)胞黏附和趨化作用。Celletti等[17]用VEGF(2μg/kg)處理ApoE-/-/B100-/-小鼠,發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓、外周血巨噬細(xì)胞水平、斑塊面積在處理后的第1、2、3周較對照組小鼠分別增加 5、14和4倍。Rome等[18]發(fā)現(xiàn)5-LO反義寡核苷酸能夠減少VEGF mRNA表達(dá),并呈時間依賴性;當(dāng)將5-LO cDNA轉(zhuǎn)染5-LO-/-細(xì)胞后,VEGF生成明顯增加,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),AA和5-羥-二十四碳四烯酸(5HETE)能夠促進(jìn)VEGF基因表達(dá)和蛋白釋放。

免疫組化顯示在不穩(wěn)定性斑塊以及容易破裂的斑塊纖維帽肩部,均有大量的5-LO表達(dá),表明5-LO與AS斑塊穩(wěn)定性有著密切聯(lián)系[21]。Cipollone等[22]發(fā)現(xiàn)在AS患者中,有臨床癥狀者粥樣硬化斑塊的5-LO表達(dá)水平較之無癥狀者明顯升高,基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix Metalloproteinase-2,MMP-2)和MMP-9表達(dá)水平和活性水平均增加,并與5-LO表達(dá)明顯相關(guān)。Zhao等[23]研究發(fā)現(xiàn),5-LO基因敲除小鼠動脈瘤形成明顯減少,免疫組化示MMP-2和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α(Macrophage Inflammatory Protein,MIP-1α)表達(dá)明顯下降。細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑通過激活磷脂酶A2(Phospholipase A 2,PLA 2)/5-LO途徑促進(jìn)MMP-2分泌,導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定性增加。

2.4 5-LO血管反應(yīng)

腎素-血管緊張素軸是體內(nèi)血管舒縮反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)軸。研究發(fā)現(xiàn),5-LO途徑合成的 LTs通過相應(yīng)受體介導(dǎo),也參與血管舒縮反應(yīng)。CysLTs主要分布在AS的平滑肌細(xì)胞、內(nèi)膜發(fā)生增生處和斑塊形成區(qū)域,介導(dǎo)血管舒縮反應(yīng),并呈劑量依賴性,CysLTR1主要介導(dǎo)收縮信號,而CysLTR2主要介導(dǎo)舒張信號,至于最終的血管反應(yīng),主要看何種受體分布占優(yōu)勢。Ishizaka等[19]發(fā)現(xiàn)血管緊張素II(Angiotensin,AngII)具有調(diào)節(jié)5-LO途徑成分LTA 4水解酶表達(dá)的作用,當(dāng)利用微型真空泵持續(xù)輸注AngII 7天后,LTA4水解酶mRNA和蛋白表達(dá)水平較之對照組上調(diào)達(dá)3.5倍。Voelkel等[20]發(fā)現(xiàn)FLAP抑制劑M K-886能夠抑制 AngII引起的血管收縮效應(yīng),5-LO-/-小鼠左心肥大較之對照組小鼠明顯減少。這些研究均表明,5-LO途徑可能通過腎素-血管緊張素軸參與調(diào)節(jié)血管舒縮反應(yīng),在AS形成中發(fā)揮作用。

2.5 5-LO與細(xì)胞凋亡

長期以來,人們在腫瘤細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),5-LO途徑產(chǎn)生5HETE和5-氧-二十四碳四烯酸(5-Oxo-Eicosatetraenoic Acid)對腫瘤細(xì)胞起促分裂作用,當(dāng)阻斷5-LO信號途徑后,能夠阻斷腫瘤細(xì)胞生長,并促使其發(fā)生凋亡。在AS斑塊中心,組織細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死,導(dǎo)致斑塊壞死中心的形成,是斑塊遭受侵蝕和發(fā)生破裂的重要病理生理基礎(chǔ)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),5-LO能夠誘導(dǎo)凋亡介質(zhì)表達(dá),采用 5-LO抑制劑Zileuton或MK-886能夠明顯抑制巨噬細(xì)胞凋亡,但不能阻斷5-LO-/-巨噬細(xì)胞的凋亡,表明5-LO可能參與巨噬細(xì)胞凋亡過程。Maccarrone等[24]研究發(fā)現(xiàn)5-LO介導(dǎo)線粒體解耦聯(lián)過程有助于細(xì)胞發(fā)生凋亡,給予5-LO抑制劑能夠阻斷凋亡小體形成。此外,5-LO途徑產(chǎn)物L(fēng)TB4、LTD4和5HETE均能增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)。5-LO與AS斑塊中的巨噬細(xì)胞凋亡是否具有相關(guān)性,以及具體作用機(jī)制,尚待進(jìn)一步研究。

3 小 結(jié)

總之,5-LO通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)、改變斑塊穩(wěn)定性、介導(dǎo)血管反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等過程參與AS形成,是認(rèn)識并干預(yù)AS形成過程的新的路徑。但對其具體機(jī)制、調(diào)節(jié)方式及阻斷策略等有待進(jìn)一步探索、研究,使之更有效地干預(yù)5-LO作用過程,減少AS的發(fā)生和發(fā)展。

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