羅非魚(yú)熱休克蛋白70在畢赤酵母中的表達(dá)與純化

陳明,王秋華、2,王瑞,黃婷,梁萬(wàn)文,李超,雷愛(ài)瑩,陳福艷,余曉麗,甘西

(1.廣西水產(chǎn)研究所,廣西南寧530021;2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧530005)

羅非魚(yú)熱休克蛋白70在畢赤酵母中的表達(dá)與純化

陳明1,王秋華1、2,王瑞1,黃婷1,梁萬(wàn)文1,李超1,雷愛(ài)瑩1,陳福艷1,余曉麗1,甘西1

(1.廣西水產(chǎn)研究所,廣西南寧530021;2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧530005)

以尼羅羅非魚(yú)血液mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得編碼羅非魚(yú)Hsp70完整cDNA,重組構(gòu)建羅非魚(yú)真核表達(dá)載體pPIC9K/rtHsp70;在畢赤酵母Pichia pastoris KM71中表達(dá)重組羅非魚(yú)的熱休克蛋白70(rtHsp70),對(duì)表達(dá)上清液進(jìn)行SDS-PAGE及Western blot分析;采用親和層析、HiTrap Desalting預(yù)裝柱脫鹽純化目的蛋白。結(jié)果表明:克隆至pMD載體上的基因與目的基因完整編碼區(qū)序列完全一致;誘導(dǎo)表達(dá)上清液經(jīng)SDS-PAGE及Western blot分析,上清液中蛋白條帶大小與目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小一致;每升誘導(dǎo)上清液可以獲得約2 mg純化蛋白。本研究中獲得的rtHsp70畢赤酵母工程菌及純化的rtHsp70為后期rtHsp70-肽疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。

重組羅非魚(yú)熱休克蛋白70(rtHsp70);基因表達(dá);畢赤酵母

熱休克蛋白Hsp70相對(duì)分子質(zhì)量約70 000,具有高度保守序列,在受到環(huán)境脅迫后能大量表達(dá)。因此,魚(yú)類等水生生物Hsp70在各種應(yīng)激條件下表達(dá)的變化是魚(yú)類熱休克蛋白被發(fā)現(xiàn)以來(lái)的研究熱點(diǎn)。有學(xué)者曾提出,熱休克蛋白可作為一種生物指標(biāo),通過(guò)檢測(cè)水生生物Hsp70表達(dá)水平,對(duì)水環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測(cè)。但是,Hsp70的表達(dá)水平并不總是與有害因素的作用強(qiáng)度平行,其機(jī)制較為復(fù)雜,監(jiān)測(cè)水質(zhì)時(shí)不能孤立考慮單項(xiàng)因素,因此利用Hsp70作為水環(huán)境污染的監(jiān)測(cè)指標(biāo)有它的局限性[1-2]。研究表明,Hsp70作為分子伴侶與腫瘤細(xì)胞中的內(nèi)源性多肽結(jié)合,經(jīng)細(xì)胞免疫途徑發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng), Hsp70與抗原肽結(jié)合的Hsp70-肽腫瘤疫苗具有很好的抗腫瘤作用,其可行性在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上已得到證實(shí)[3-4]。由于魚(yú)類規(guī)模化養(yǎng)殖的發(fā)展,魚(yú)類疾病越來(lái)越復(fù)雜,疫苗免疫將成為防治魚(yú)類疾病的重要途徑,但目前魚(yú)類疫苗缺乏有效且使用方便的劑型,實(shí)際生產(chǎn)中難以廣泛應(yīng)用。因此,研制高效且使用方便的口服型和浸泡型魚(yú)類疫苗已成為目前急需解決的問(wèn)題。Hsp70抗原載體和免疫佐劑的特性為研究新型水產(chǎn)疫苗提供了理論基礎(chǔ),同時(shí)以Hsp70為魚(yú)類疫苗免疫佐劑進(jìn)行研究將填補(bǔ)國(guó)內(nèi)外魚(yú)類Hsp70在應(yīng)用研究領(lǐng)域的空白。本研究中,作者利用畢赤酵母Pichia pastoris大量制備重組羅非魚(yú)熱休克蛋白70(rtHsp70),旨在為以熱休克蛋白作為免疫佐劑和腸道免疫增強(qiáng)劑用于羅非魚(yú)鏈球菌病口服型疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pMD-Hsp70為廣西遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存,表達(dá)載體pPlC9K及畢赤酵母菌株KM71購(gòu)于Invitrogen公司;Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase購(gòu)自TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶AvrⅡ、EcoRⅠ、PmeⅠ購(gòu)自NEB公司;DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取和純化試劑盒、酵母基因組抽提試劑盒和蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自天根生化科技有限公司;小鼠原性抗His-tag單克隆抗體購(gòu)自Novagen公司;Ni-NTA agarose購(gòu)自QIANGEN公司;HiTrap Desalting預(yù)裝柱購(gòu)自GE公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自威格拉斯公司;相對(duì)分子質(zhì)

量為5 000的超濾離心管購(gòu)自Millipore公司;引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

根據(jù)Hsp70編碼核甘酸序列及分泌型真核表達(dá)載體pPIC9K多克隆位點(diǎn)序列,設(shè)計(jì)了1對(duì)引物。上游引物Hspf,5'CGGACGAATTCTCTGCAGCTAAAGGTGTAGCGATC3',含EcoRⅠ酶切點(diǎn);下游引物Hspr,5'TATTTCCTAGGGTGATGGTGATGGTGATGGTCCACCTCCTCAATAGT3',含AvrⅡ酶切位點(diǎn),下游插入6個(gè)組氨酸標(biāo)簽。以質(zhì)粒pMD-Hsp70為模板,擴(kuò)增條件為:95℃下預(yù)變性5 min;95℃下變性30 s,55℃下退火30 s,72℃下延伸2 min,共30個(gè)循環(huán);72℃下再延伸10 min。將PCR產(chǎn)物電泳后,經(jīng)回收純化與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆鑒定,并送大連寶生物工程有限公司驗(yàn)證,獲得pMD18/rtHsp70克隆菌株。

1.2.2 表達(dá)載體pPIC9K/rtHsp70的構(gòu)建 用LB液體培養(yǎng)pMD18/rtHsp70克隆菌株,采用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒pMD18/rtHsp70。用EcoRⅠ和AvrⅡ酶分別消化pMD18/rtHsp70和質(zhì)粒pPIC9K,以8 g/L瓊脂糖凝膠電泳回收特異片段,用T4DNA Ligase連接。

1.2.3 pPIC9K/rtHsp70質(zhì)粒的擴(kuò)增及鑒定 連接產(chǎn)物用CaCl2熱休克法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌JM109中,并涂于含100 μg/mL Ampicillin LB平板上,于37℃下培養(yǎng)16 h。挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,再用EcoRⅠ和AvrⅡ酶進(jìn)行雙酶切鑒定,質(zhì)粒送大連寶生物公司測(cè)序驗(yàn)證,獲得pPIC9K/rtHsp70克隆菌株。

1.2.4 pPIC9K/rtHsp70質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌KM71 畢赤酵母菌株KM71電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備及質(zhì)粒提取按照Invitrogen公司的Pichia Expression Kit操作說(shuō)明進(jìn)行。按PmeⅠ反應(yīng)體系,在80 μL NEB Buffer反應(yīng)體系中加入2 μg pPIC9K/rtHsp70,于37℃下酶切4 h。取80 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞與5 μL線性化DNA混合,冰上放置5 min;轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中電擊轉(zhuǎn)化(1 500 V,5 ms);立即取出電擊杯,加入1 mL預(yù)冷的山梨醇(1 mol/L)至電轉(zhuǎn)杯中,輕輕混勻,將內(nèi)容物轉(zhuǎn)入滅菌離心管中。取適量涂于MD平板上,于28℃下培養(yǎng)3～5 d。

1.2.5 陽(yáng)性工程菌的PCR鑒定 用MD平板培養(yǎng)(28℃)72 h后,挑取10個(gè)菌落分別置于含10 mL MD培養(yǎng)液的50 mL錐形瓶中,以250 r/min搖床,28℃下培養(yǎng)至OD600nm值為5～10,離心回收菌體,用酵母基因組抽提試劑盒DNA進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.6 rtHsp70小量誘導(dǎo)表達(dá) 挑取PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子,置于含30 mL BMGY(pH 6.0)的三角瓶中,以250 r/min搖床,28℃下培養(yǎng)至OD600nm值為2.0;以1500 g離心5 min,棄上清液,將菌體懸浮于5 mL pH 6.0的BMMY中,每24 h補(bǔ)充一次甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為0.5%,分別取甲醇誘導(dǎo)后48、72、96 h的發(fā)酵液上清液進(jìn)行SDSPAGE及Western blot分析。

1.2.7 rtHsp70大量誘導(dǎo)表達(dá) 挑取經(jīng)過(guò)小量誘導(dǎo)表達(dá)篩選出的較高表達(dá)水平的菌株,接種至含10 mL BMGY培養(yǎng)基的小三角瓶中,以260 r/min搖床,28℃下培養(yǎng)至OD600nm=2.0～6.0(16～18 h)。將10 mL培養(yǎng)物接種至含1 L BMGY的3 L搖瓶中,以260 r/min搖床,28℃下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600nm=2.0～6.0)。室溫下以1 500 g離心5 min,收集細(xì)胞,將細(xì)胞重懸于300 mL BMMY培養(yǎng)基中,置于2 L的搖瓶中,28℃下以260 r/min搖床誘導(dǎo)表達(dá),加入體積分?jǐn)?shù)為0.5%的甲醇誘導(dǎo)至96 h,4℃下以1 500 g離心5 min,收集上清液。

1.2.8 蛋白純化及濃度測(cè)定 誘導(dǎo)表達(dá)上清液用Ni-NTA agarose親和層析柱進(jìn)行純化目的蛋白,用40 mmol/L咪唑液進(jìn)行洗脫,洗脫后采用AKTA蛋白純化系統(tǒng),用HiTrap Desalting預(yù)裝柱對(duì)Hsp70進(jìn)行脫鹽,收集目的蛋白組分。用超濾離心管進(jìn)行超濾濃縮,離心過(guò)程中用pH為7.3的PBS更換緩沖液,按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 rtHsp70基因的克隆

以質(zhì)粒pMD/rtHsp70為PCR模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到大小約1960 bp的基因片段(圖1)。經(jīng)克隆得到pMD/rtHsp70載體,挑選其中10個(gè)陽(yáng)性克隆送檢,經(jīng)核酸序列分析證實(shí),所得基因序列與目的基因完整編碼區(qū)序列完全一致。

2.2 rtHsp70表達(dá)工程菌的篩選

構(gòu)建的表達(dá)載體pPIC9K/rtHsp70用AvrⅡ和EcoRⅠ酶消化后,經(jīng)8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳,

結(jié)果顯示大約有9 300 bp和1 960 bp兩個(gè)片斷。經(jīng)質(zhì)粒核酸序列分析確證表達(dá)載體的閱讀框和序列均正確。用重組質(zhì)粒線性化轉(zhuǎn)化KM71,提取酵母工程菌基因組DNA,Hsp70上游引物和質(zhì)粒3'AOX引物經(jīng)PCR法擴(kuò)增,獲得約2 100 bp的片段(圖2),而陰性對(duì)照無(wú)此條帶。上述結(jié)果證明, rtHsp70基因已整合入酵母菌KM71的基因組中。

圖1 Hsp70基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The PCR amplification of the Hsp70 gene in Tilapia

圖2 重組菌pPIC9K/rtHsp70/KM71基因組的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The PCR amplification of the genomic DNA of pPIC9K/rtHsp70/KM71

2.3 rtHsp70的表達(dá)及鑒定

對(duì)PCR結(jié)果陽(yáng)性的酵母菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,誘導(dǎo)72、96 h可見(jiàn)蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)96 h后,3號(hào)菌可見(jiàn)較明顯的蛋白表達(dá)條帶。經(jīng)Western blot檢測(cè),結(jié)果顯示,在相對(duì)分子質(zhì)量約70 000處出現(xiàn)特異性條帶(圖3)。

圖3 重組菌pPCI9k/rtHsp70/KM71表達(dá)產(chǎn)物Westernblotting的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Western-blot analysision of pPCI9k/rtHsp70/ KM71 expression products

2.4 rtHsp70的純化及濃度測(cè)定

選擇表達(dá)量高的3號(hào)菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)表達(dá)上清液進(jìn)行Ni-NTA agarose親和層析純化后,采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)對(duì)洗脫的目的蛋白用Hi-Trap Desalting預(yù)裝柱進(jìn)行脫咪唑。由于蛋白濃度較低,咪唑濃度較高,從色譜圖(圖4)中可見(jiàn)到明顯的咪唑峰(A4～A8),蛋白峰(A1～A3)則較平。由于蛋白組分與咪唑較接近,因此,收集蛋白組分超濾濃縮的同時(shí)更換緩沖液,最終將蛋白保存在PBS中。用BCA方法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果每升誘導(dǎo)上清液中可以得到純化蛋白2 mg。將純化的目的蛋白經(jīng)SDS—PAGE電泳分析可見(jiàn),在相對(duì)分子質(zhì)量為66 200和94 000之間有清晰的目的蛋白條帶(圖5)。

圖4 AKTA液相系統(tǒng)脫鹽Fig.4 Desalination by AKTA HPLC system

圖5 純化后rtHsp70 SDS-PAGE電泳Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified rtHsp70

3 討論

熱休克蛋白(heat shock protein,Hsp)的佐劑樣效應(yīng)以及在腫瘤和抗感染免疫中的應(yīng)用,一直是Hsp研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Hsp70是熱休克蛋白家族中最重要的一員,被認(rèn)為是最具有免疫耐受性的分子,原核生物和真核生物中的Hsp70約有50%的氨基酸具有同源性,不同真核生物有60%～78%氨基酸具有同源性[5-10]。對(duì)Hsp70蛋白質(zhì)晶體的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究證明,其具有多肽結(jié)合槽位,具備結(jié)合多肽的結(jié)構(gòu)特征[11]。目前,采用Hsp70——抗原肽復(fù)合物作為疫苗誘導(dǎo)抗腫瘤、抗感染免疫已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,并顯示了良好的應(yīng)用前景[12]。但要實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,前提是必須獲得大量的Hsp70蛋白。因此對(duì)Hsp70進(jìn)行體外表達(dá)是一個(gè)重要途徑。畢赤酵母是20世紀(jì)80—90年代發(fā)展起來(lái)的酵母表達(dá)系統(tǒng),為甲醇型酵母,能利用甲醇作為唯一的碳源和能源。由于畢赤酵母在蛋白質(zhì)表達(dá)方面具有其它系統(tǒng)所不可比擬的優(yōu)點(diǎn),因而得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[13]。畢赤酵母中有兩個(gè)基因AOX1和AOX2,編碼醇氧化酶,兩者序列相似,細(xì)胞中絕大多數(shù)醇氧化酶是AOX1基因產(chǎn)物,甲醇可緊密調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)AOX1高水平的表達(dá),AOX2基因只承擔(dān)很少一部分活力[14-15]。本研究中采用的KM71宿主菌,其染色體上大部分AOX1基因被刪除,本身為Muts,轉(zhuǎn)化后,轉(zhuǎn)化子為Muts,不必進(jìn)行表型篩選及鑒定。張維延等[16]對(duì)畢赤酵母KM71和GS115的發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,通過(guò)調(diào)整發(fā)酵工藝中的各種參數(shù),KM71和GSl15均適用于不同性質(zhì)外源蛋白的表達(dá),而且表達(dá)量較高,是一種理想的表達(dá)系統(tǒng)。通常認(rèn)為,轉(zhuǎn)化子中整合目的基因拷貝數(shù)越多,表達(dá)目的蛋白量越高。本研究中選用的載體pPIC9K含kan基因,可以通過(guò)遺傳霉素進(jìn)行多拷貝子的篩選,操作簡(jiǎn)單方便。

生物活性是基因工程表達(dá)重組蛋白的重要指標(biāo),研究重組蛋白生物活性的前提是獲得純化的蛋白。目前蛋白純化主要方法有沉淀法、離子交換色譜法、親和層析法、凝膠過(guò)濾法和電泳分離法等。本研究中采用親和層析法和凝膠過(guò)濾法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化,每升誘導(dǎo)表達(dá)上清液可獲得2 mg rtH-sp70。親和層析是基于目的蛋白與固化的配基特異性結(jié)合而滯留,未結(jié)合的雜蛋白被洗掉,從而使目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純化的液相層析方法[17]。近幾十年來(lái),親和層析技術(shù)發(fā)展十分迅速,廣泛用于分離純化蛋白質(zhì)、肽、酶及其底物和抑制劑等。凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)蛋白質(zhì)大小不同而達(dá)到分離效果,凝膠過(guò)濾填料中含有大量微孔,只允許緩沖液及小分子量蛋白質(zhì)通過(guò),大分子蛋白及一些蛋白復(fù)合物則被阻擋在外。因此,高分子量的蛋白質(zhì)在填料顆粒間隙中流動(dòng),比低分子量蛋白更早的被洗脫下來(lái),通過(guò)收集不同時(shí)段的洗脫液來(lái)得到目的蛋白。本研究中在目的蛋白N端添加6個(gè)組氨酸,使目的蛋白與親和柱載體上的鎳離子特異性結(jié)合,再用含咪唑緩沖液競(jìng)爭(zhēng)性置換目的蛋白。為了除去親和層析純化后蛋白液中的咪唑,本研究中采用凝膠過(guò)濾法進(jìn)一步純化目的蛋白,但由于咪唑濃度較高,目的蛋白峰與咪唑峰分離不明顯,因此本實(shí)驗(yàn)中凝膠過(guò)濾純化rtHsp70各參數(shù)還需進(jìn)一步優(yōu)化。

常用的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法有280 nm光吸收法、Bradford檢測(cè)法、Lowry檢測(cè)法、BCA檢測(cè)法、半點(diǎn)濾膜結(jié)合法。本研究中采用的BCA檢測(cè)法是一種改進(jìn)的Lowry測(cè)定法,在堿性環(huán)境下蛋白分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物,同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。而B(niǎo)CA試劑可敏感特異地與Cu+結(jié)合,形成穩(wěn)定的有顏色復(fù)合物,在562 nm處有最大吸收值。顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,可根據(jù)吸收值大小計(jì)算蛋白質(zhì)的含量[18]。該方法反應(yīng)簡(jiǎn)單,終產(chǎn)物穩(wěn)定,幾乎沒(méi)有干擾物質(zhì)的影響。本研究中采用BCA方法測(cè)定,每升誘導(dǎo)上清液中可獲得純化蛋白約為2 mg。

本研究中從羅非魚(yú)DNA文庫(kù)中克隆編碼Hsp70 DNA,構(gòu)建了分泌型表達(dá)載體,采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)羅非魚(yú)熱休克蛋白70進(jìn)行表達(dá),篩選了表達(dá)羅非魚(yú)Hsp70水平較高工程菌,為后期羅非魚(yú)Hsp70作為免疫佐劑在羅非魚(yú)疫苗研制中奠定基礎(chǔ)。

[1] 祝璟琳,王國(guó)良.魚(yú)類Hsp70的研究進(jìn)展[J].寧波大學(xué)學(xué)報(bào), 2007,20(4):446-449.

[2] Lin Shengsong,Wu Longtao,Ni Duojiao,et al.The cDNA cloning and mRNA expression of heat-shock protein 70 gene in the haemocytes of bay scallop(Argopecten irradians,Lamarck 1819)responding to bacteria challenge and naphthalin stress[J].Fish&Shellfish Immunology,2006,21(3):335-345.

[3] 王森舟.熱休克蛋白的生物功效及與腫瘤熱療的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2006,22(8):969-971.

[4] Tamura Y,Peng P,Liu K,et al.Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock protein preparations[J].Science,1997,278:117-120.

[5] Lindquist S,Craig E A.The heat-shock proteins[J].Annu Rev Genet,1988,22:631-767.

[6] Hartl F U.Molecular chaperones in cellular protein folding[J]. Nature,1996,381:571-579.

[7] Feder M E,Hofmann G E.Heat-shock proteins,molecular chaperones,and the stress response:evolutionary and ecological physiology[J].Annu Rev Physiol,1999,61:243-282.

[8] Jolly C,Morimoto R I.Stress and the cell nucleus:dynamics of gene expression and structural reorganization[J].Gene,1999,7: 261-270.

[9] Feige U,Polla N S.Heat shock protein:the Hsp70 family[J].Experentia,1994,50:979-986.

[10] 孫培明,王志亮.熱應(yīng)激蛋白70-肽疫苗研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2006,42(12):43-44.

[11] Zhu X,Zhao X,Burkholder W F,et al.Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK E[J].Science, 1996,272:1606-1614.

[12] Srivastava P K.Immunotherapy of human cancer:lessons from mice[J].Nature Immunol,2000,1(5):363-366.

[13] Siegel R S.Methylotroyphic yeast Pichia pasteur produced in high -cell-density fermentation with high cell yields as vehide for recombinant protein producdon[J].Biotenchnology and Bioengineering,1989,34:403-404.

[14] Koutz P,Davis G R,Stillman C,et al.Structural comparison of the Pichia pastoris alcohol oxidase genes[J].Yeast,1989,5:167-177.

[15] Waterham H R,Digan M E,Koutz P J,et al.Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate deydyogenase gene and regulation and use of its promoter[J].Gene,1997,186:37-44.

[16] 張維延,江陽(yáng),許志祥,等.畢氏酵母KM71和GS115發(fā)酵工藝的比較[J].蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,21(3):268-270.

[17] 趙永芳.生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社, 2002:7-82.

[18] Smith P K,Krohn R I,Hermanson G T,et al.Measurement of protein using bicinchoninic acid[J].Anal Biochem,1985,150:76-85.

Expression and purification of recombinant Tilapia heat shock protein 70 in yeast Pichia pastoris

CHEN Ming1,WANG Qiu-hua1,2,WANG Rui1,HUANG Ting1,LIANG Wan-wen1,LI Chao1, LEI Ai-ying1,CHEN Fu-yan1,YU Xiao-li1,GAN Xi1
(1.Guangxi Institute of Fisheries,Nanning 530021,China;2.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning 530005,China)

The recombinant cDNA of Tilapia Hsp70 was amplified from blood mRNA and inserted into vector pMD18-T.Sequencing revealed that the cDNA was subcloned into expression vector pPIC9K.The recombinant vector was transformed into the yeast Pichia pastoris KM71 via electroporation after sequencing.The transforming positive clones were screened by PCR and rtHsp70 in culture supernatant induced by methanol was identified by Western blot.Protein purification by the affinity chromatograph and gel filtration showed the sequence of rtHsp70 DNA was correct.It was a protein with relative molecular mass of 70 000 in the culture supernatant by SDS-PAGE and Western blot analysis.Two 2 mg purified rtHsp70 can be obtained in per liter expression supernatant,and Pichia pastoris engineer bacteria of rtHsp70 expression and purified protein were gained.The study is paved the way for further study of using rtHsp70 for immunologic adjuvant in peptide-vaccine application.

rtHsp70(recombinant Tilapia heat shock protein 70);gene expression;Pichia pastoris

2095-1388(2011)01-0058-05

Q813.2

A

2010-03-08

國(guó)家社會(huì)公益研究項(xiàng)目(2060302 GXIF-2008-03);國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BADB9B04)

陳明(1979-),男,助理研究員。E-mail:cm990919@163.com

甘西(1956-),男,研究員。E-mail:ganxicn@126.com