異育銀鯽各組織器官中細胞色素P450藥酶活性的比較

賈嫻,胡琳琳,房文紅,汪開毓,胡曉

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部海洋與河口漁業(yè)資源及生態(tài)重點開放實驗室,上海200090; 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,四川雅安625014)

異育銀鯽各組織器官中細胞色素P450藥酶活性的比較

賈嫻1、2,胡琳琳1,房文紅1,汪開毓2,胡曉1

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部海洋與河口漁業(yè)資源及生態(tài)重點開放實驗室,上海200090; 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,四川雅安625014)

對異育銀鯽Carassius auratus gibelio肝胰臟、腎、鰓、腸和肌肉等組織器官中細胞色素P450 (CYP450)主要藥酶活性進行檢測,研究其在異育銀鯽各組織中的分布。結(jié)果顯示:以CO還原差示光譜法測得異育銀鯽肝胰臟、腎、鰓、腸、肌肉微拉體的細胞色素P450及b5含量均以肝胰臟微粒體中最高,其次為腎、鰓、腸微粒體,肌肉中最低。以氨基比林N-脫甲基、紅霉素N-脫甲基、苯胺-4-羥化反應(yīng)分別作為CYP2B、CYP3A和CYP2E的探針反應(yīng),測得氨基比林N-脫甲基酶(APD)及紅霉素N-脫甲基酶(ERND)活性在上述組織中分布差異性類似,均表現(xiàn)為肝胰臟微粒體中最高,分別為(1.668±0.104)、(0.941±0.061)nmol/(min·mg),其次為腎、鰓、腸微粒體,肌肉微粒體中最低,分別為(0.245± 0.011)、(0.078±0.019)nmol/(min·mg);苯胺-4-羥化酶(AH)活性以肝胰臟微粒體最高,為(0.052±0.009)nmol/(min·mg),其次為鰓微粒體,肌肉微粒體中最低,不能檢出。研究表明,異育銀鯽主要組織微粒體中具有細胞色素P450亞型活性,且它們在異育銀鯽體內(nèi)的分布和活性存在著組織和器官差異性,以肝胰臟組織中的含量和活性為最高。

異育銀鯽;微粒體;細胞色素P450;組織分布

藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化主要是通過藥物代謝酶起作用,因而研究參與藥物代謝的酶及其酶促反應(yīng)成為藥理學(xué)研究的一個十分活躍的領(lǐng)域[1]。對于魚類細胞色素P450(CYP450),國外針對虹鱒已有較為全面的研究,但其多見于環(huán)境與分子毒理學(xué)研究以及環(huán)境污染物的監(jiān)測。國內(nèi)有關(guān)水產(chǎn)動物組織微粒體藥酶的研究不多,如黎雯等[2]用魚肝EROD酶活力誘導(dǎo)作為二噁英的水生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo);陳大健等[3]研究了氟苯尼考對鯽CYP2E1活性的影響;韓現(xiàn)芹等[4]評價了磺胺甲基異嗯唑、甘草和連翹對牙鲆CYP2E1活性的影響;吳偉等[5]研究了多溴聯(lián)苯醚脅迫下鯽肝胰臟微粒體CYP3A1和GST的響應(yīng)。本研究中,作者以異育銀鯽Carassius auratus gibelio為研究對象,優(yōu)化了異育銀鯽各組織微粒體的制備和細胞色素P450酶系相關(guān)酶活性的檢測方法,并以氨基比林N-脫甲基、紅霉素N-脫甲基、苯胺-4-羥化反應(yīng)分別作為CYP2B、CYP3A和CYP2E的探針反應(yīng),對各組織中細胞色素P450亞型藥酶活性進行了比較研究,旨在為今后進一步開展藥物代謝、藥酶以及相互作用關(guān)系研究提供基礎(chǔ)技術(shù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 異育銀鯽購自上海郊區(qū)青浦養(yǎng)魚場,挑選健康、體表無損傷的5尾魚用于試驗,體重為(225±12)g,體長為(18.6±2.1)cm。將試驗魚養(yǎng)殖于室內(nèi)100 L的玻璃缸中,試驗用水為經(jīng)脫氯凈化的自來水。試驗期間,采用增氧機連續(xù)充氧,水溫為(25±2)℃,每天換水2次,換水量為50%。試驗前將魚馴養(yǎng)2周,每天按魚體重的3%左右投喂不含抗生素的全價魚飼料,早晚各一次,試驗前24 h停止喂食。

1.1.2 藥品與試劑 還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、1 -苯基-2-硫脲(PTU)、1,4-二硫蘇糖醇(DTT)、α-苯甲硫酰氟(PMSF)購于Sigma公司;考馬斯亮藍G250購于沃凱公司;牛血清白蛋白(AR)、Tris(GR)、紅霉素(AR)、氨基比林(AR)購于上海生工生物有限公司;苯胺、苯酚、三氯乙酸、連二亞硫酸鈉等均為分析純,購于國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

氯化鉀-磷酸鹽緩沖液:0.154 mol/L KCl-0.1 mol/L PBS緩沖液(pH為7.4)。

勻漿緩沖液:將體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油、1 mmol/L PMSF、1 mmol/L PTU、0.1 mmol/L DTT和1 mmol/L EDTA溶解于氯化鉀-磷酸鹽緩沖液。

保存緩沖液:將體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油、1 mmol/L PMSF、1 mmol/L PTU、0.1 mmol/L DTT和1 mmol/L EDTA溶解于氯化鉀-磷酸鹽緩沖液中。

1.2 方法

1.2.1 微粒體的制備 參照Lee等[6]的方法制備微粒體。用預(yù)冷的氯化鉀-磷酸鹽緩沖液漂洗組織(其中腸需灌洗以去除內(nèi)容物),按w(組織)∶w (勻漿緩沖液)=1∶4的比例混勻,用內(nèi)切式組織勻漿機于冰浴中制成勻漿,再轉(zhuǎn)入預(yù)冷離心管中; 4℃下以10 000×g離心20 min,棄去漂浮的脂類物質(zhì)后,置于超速冷凍離心管中;4℃下以105 000× g離心60 min。棄上清液,沉淀即為微粒體組分,加入適量保存緩沖液充分混勻后,分裝于凍存管,置于-80℃下保存。比較以氯化鉀-磷酸鹽緩沖液和含保護劑的氯化鉀-磷酸鹽緩沖液作為勻漿緩沖液在制備微粒體時對P450酶的保護作用,并對制備的肝胰臟微粒體P450進行紫外掃描。

1.2.2 微粒體蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍法[7]測定微粒體蛋白質(zhì)含量。加入適量保存緩沖液將各樣品稀釋成1 mg(微粒體蛋白質(zhì))/mL (懸液),于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 微粒體細胞色素P450及b5含量的測定參照Omura等[8]的方法測定微粒體細胞色素P450及b5含量。將微粒體樣品稀釋至0.5 mg微粒體蛋白/mL,取6 mL,加入60 μL 100 g/L連二亞硫酸鈉,用玻璃棒小心攪拌混勻,靜置1 min,等量分裝于光徑為1 cm的比色杯中,分別作為對照和樣本,于樣品杯中緩慢通入CO 1 min,穩(wěn)定2 min,在波長400～500 nm處調(diào)零掃描差示光譜,并記錄450 nm和490 nm處的OD值。測定b5時,以少許NADH代替100 g/L連二亞硫酸鈉,除不充CO外,其余步驟與P450的測定相同。

A1=(OD450nm-OD490nm)×1000/(91×C),

A2=(OD423nm-OD490nm)×1000/(171×C),

式中:A1為P450(nmol/mg蛋白);A2為b5含量(nmol/mg蛋白);C為檢測樣本稀釋后的蛋白濃度(mg/mL)。

1.2.4 氨基比林N-脫甲基酶(APD)活性的測定 參照Schenkman[9]的方法,制備甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定氨基比林N-脫甲基酶(APD)活性。根據(jù)各樣品的OD420nm值和甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活性。酶活性以每毫克蛋白單位時間內(nèi)的甲醛生成量表示[nmol/(min·mg)]。

1.2.5 紅霉素N-脫甲基酶(ERND)活性的測定 反應(yīng)體系中,除將底物改為1.4 mmol/L的紅霉素外,其余步驟同氨基比林N-脫甲基酶(APD)活性的測定。酶活性以每毫克蛋白單位時間內(nèi)的甲醛生成量表示[nmol/(min·mg)]。

1.2.6 苯胺4-羥化酶(AH)活性的測定 參照Dupont[10]的方法制備4-氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定苯胺4-羥化酶(AH)活性。根據(jù)各樣品的OD630nm值和4-氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活性。酶活性以每毫克蛋白單位時間內(nèi)的4-氨基酚生成量表示[nmol/(min·mg)]。

2 結(jié)果

2.1 異育銀鯽各組織器官中微粒體蛋白的含量

異育銀鯽肝胰臟、腎、鰓、腸和肌肉等組織器官的微粒體采用差速離心法制備,測得腎組織微粒體中蛋白質(zhì)含量最高,肌肉微粒體中最低(表1)。

表1 異育銀鯽主要組織器官中微粒體蛋白的含量(n=5)Tab.1 Microsomal protein concentrations in main tissue microsomes from the crucian carp

2.2 異育銀鯽各組織器官中微粒體細胞色素P450及b5的含量

異育銀鯽肝胰臟、腎、鰓、腸和肌肉等組織器

官的微粒體中細胞色素P450和b5的含量見圖1。從圖1可見:肝胰臟微粒體中細胞色素P450和b5的含量最高,分別為(0.312±0.008)、(0.141± 0.010)nmol/mg;肌肉組織微粒體中最低,分別為(0.008±0.033)、(0.0015±0.0013)nmol/mg;腎、鰓和腸組織較接近,P450含量為0.165～0.191 nmol/mg,b5含量為0.091～0.107 nmol/mg。

圖1 異育銀鯽各組織微粒體中細胞色素P450及b5的含量Fig.1 P450 and b5 concents in main tissue microsomes of the crucian carp

肝胰臟微粒體中P450和b5紫外掃描圖譜見圖2。從圖2可見:肝胰臟微粒體在450 nm處有最高吸收峰,為細胞色素P450,還原形式b5在423 nm處具有吸收峰;采用不添加保護劑的氯化鉀-磷酸鹽緩沖液制備肝胰臟微粒體時,P450容易失活。

圖2 異育銀鯽肝胰臟微粒體中細胞色素P450及b5的掃描光譜圖Fig.2 The scanning spectrogram of hepatopancreas microsome CYP450 and b5 in the crucian carp

2.3 異育銀鯽主要組織中APD、ERND和AH的活性

從圖3可見:在異育銀鯽肝胰臟、腎、鰓、腸和肌肉組織中,3種主要藥酶活性均以氨基比林N -脫甲基酶(APD)活性為最高,其次是紅霉素N -脫甲基酶(ERND),苯胺4-羥化酶(AH)活性最低,肌肉中幾乎檢測不到;在不同組織間, APD、ERND和AH活性均以肝胰臟微粒體中的最高,分別為(1.668±0.104)、(0.941±0.061)、(0.052±0.009)nmol/(min·mg)。

圖3 異育銀鯽主要組織中APD、ERND及AH的活性Fig.3 APD,ERND and AH activities in main tissue microsomes from the crucian carp

3 討論

3.1 微粒體制備方法的優(yōu)化

本試驗中采用差速離心法制備異育銀鯽組織微粒體。在制備和保存過程中,使用氯化鉀-磷酸鹽緩沖液和含保護劑的氯化鉀-磷酸鹽緩沖液,并比較微粒體制備的效果和對細胞色素P450酶的保護作用。使用氯化鉀-磷酸鹽緩沖液制備所得微粒體細胞色素P450容易失活,表現(xiàn)為其紫外掃描圖譜在420 nm左右常出現(xiàn)一個肩峰(圖2)。在添加保護劑的氯化鉀-磷酸鹽緩沖液中,DTT和PTU對二硫鍵具有保護作用,PMSF為蛋白酶抑制劑,EDTA具有螯合作用,用該法制備所得的微粒體中細胞色素P450不易失活,實測蛋白含量高于氯化鉀-磷酸鹽緩沖液制備方法。由此可見,加入保護劑可消除干擾離子的影響,減少因血紅素的吸附而造成對光譜測定的干擾。

3.2 魚類P450、b5含量與組織分布

關(guān)于魚類肝胰臟微粒體中細胞色素P450的研究報道較多。如未經(jīng)藥物誘導(dǎo)的奧尼羅非魚肝胰臟微粒體中細胞色素P450含量為(0.346±0.042)

nmol/mg[11];虹鱒肝胰臟微粒體細胞色素P450含量為(0.354±0.035)nmol/mg[12];Stegeman等[13]對10種熱帶魚的細胞色素P450及亞型活性進行了研究,其中7種魚細胞色素P450含量為0.1～0.5 nmol/mg,細胞色素b5含量為0.025～0.25 nmol/ mg。本試驗中測得異育銀鯽肝胰臟微粒體細胞色素P450和b5含量分別為(0.312±0.008)nmol/ mg和(0.142±0.010)nmol/mg,與上述結(jié)果接近。這說明本試驗中建立的異育銀鯽細胞色素P450和b5含量的測定方法真實可靠。細胞色素P450在許多組織和器官中都存在,但其分布具有一定的選擇性,主要分布于外源化合物進入體內(nèi)的主要入口組織,這些組織構(gòu)成了外源物質(zhì)進入體內(nèi)的第一道防線。對于魚類而言,有研究報道,除了肝胰臟以外,細胞色素P450在鰓、腎、心等組織中也有少量存在。本試驗結(jié)果顯示,異育銀鯽肝胰臟中細胞色素P450含量最高,是腎、鰓、腸中細胞色素P450含量的1.5～2.0倍,而肌肉中細胞色素P450的含量則很低,為(0.008±0.032) nmol/mg。關(guān)于魚類微粒體b5的相關(guān)研究很少。本試驗結(jié)果顯示,b5的組織分布與P450相似,在肝胰臟中含量最高,腎、鰓、腸中較低,約為肝胰臟中b5含量的2/3,肌肉組織中極低,幾乎不能檢出。在人和其它哺乳動物中,肝和小腸也是CYP3A表達的主要器官[14-16],可見P450的這種選擇性分布使其可以最大限度地發(fā)揮作用。

3.3 CYP2B、CYP3A及CYP2E活性的測定及組織分布

CYP1、CYP2和CYP3家族的成員在許多外源物的生物轉(zhuǎn)化中起著非常重要的作用,與這些異構(gòu)酶一樣或者相關(guān)的成員在魚類中也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。利用探針?biāo)幬餃y定相應(yīng)的P450酶活性,可用于分析比較不同個體以及同一個體不同組織中酶活性的差異。哺乳動物的CYP3A在細胞色素P450中所占比例最高,是參與口服藥物首過效應(yīng)的主要酶系。相關(guān)免疫化學(xué)比較研究證實,硬骨魚類中也存在CYP3A基因,且作為肝臟主要的細胞色素P450成分與哺乳動物具有相似性[17]。據(jù)Buhler等[18]報道,魚類肝胰臟微粒體混合功能氧化酶系和哺乳動物的相應(yīng)酶系相似,可催化氨基比林的N-脫甲基反應(yīng)和苯胺的羥化反應(yīng)。本試驗中分別以紅霉素、氨基比林和苯胺作為研究CYP3A、CYP2B和CYP2E1的探針?biāo)幬?結(jié)果顯示:CYP3A在異育銀鯽肝胰臟、腎、鰓、腸及肌肉組織中都有所分布,肝胰臟中CYP3A含量最高,是腎、鰓的3.5～4.0倍,約為腸的5倍,肌肉中最低,僅為肝胰臟中的1/12。盡管本試驗中測得的異育銀鯽肝胰臟微粒體中紅霉素N-脫甲基酶活性[(0.941±0.061)nmol/ (min·mg)]低于哺乳動物,但與未經(jīng)處理的海鱸Dicentrarchus labrax[(1162±200)pmol/(min·mg)]比較接近[19]。由此可以推測,魚類CYP3A可能和哺乳動物一樣,在藥物代謝中起著重要作用。Stegeman等[13]報道的大多數(shù)熱帶魚(如金線仿石鱸等)肝胰臟微粒體中氨基比林N-脫甲基酶活性為0.5～11 nmol/(min·mg);虹鱒肝胰臟中微粒體中苯胺羥化酶活性為0.068 nmol/(min·mg),本試驗結(jié)果均與之相近。與CYP3A類似,CYP2B與CYP2E1在異育銀鯽組織器官中的分布也具有一定的選擇性,表現(xiàn)為肝胰臟中CYP2B含量約為腎的1.5倍,鰓的2倍,腸的3倍,肌肉中最低,僅為肝胰臟的1/7左右。本試驗中測得異育銀鯽的鰓中CYP2E1含量僅次于肝胰臟。研究表明, CYP2E1能夠被許多有機小分子化合物誘導(dǎo),是毒理學(xué)方面很重要的代謝系統(tǒng)[20]。鰓是魚類的主要呼吸器官,CYP2E1在鰓中的較多分布與其參與水環(huán)境中外源物質(zhì)的代謝相適應(yīng)。

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Comparative Activity of microsomal cytochrome P450 in various tissues and organs in allogynogenesis silver crucian carp Carassius auratus gibelio

JIA Xian1,2,HU Lin-lin1,FANG Wen-hong1,WANG Kai-yu2,HU Xiao1
(1.East China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Key Laboratory of Marine and Estuarine Fisheries Resources and Ecology,Ministry of Agriculture,Shanghai 200090,China;2.Animal Medicine College,Sichuan Agriculture University,Yaan 625014, China)

The activities and tissue distribution of cytochrome P450 drug-metabolizing enzyme were studied in liver,kidney,gill and muscle of allogynogenesis silver crucian carp Carassius auratus gibelio.Microsomal P450 and b5 contents were determined by the method of CO differential spectroscopy in liver,kidney,gill,intestine and muscle microsomes.Both cytochrome P450 and cytochrome b5 contents were found to be the maximum in liver microsome,and the minimum in muscle microsome.The activities of CYP2B,CYP3A and CYP2E were evaluated by microsomal N-demethylation of aminopyrine(APD),erythromycin(ERND)and 4-aniline-hydroxylation(AH)as probe specific reactions.The activities of APD(1.668±0.104)and ERND(0.941±0.061)nmol/(min·mg)were the maximum in liver microsome,and the minimum in muscle microsome[(0.245±0.011),and(0.078±0.019) nmol/(min·mg)].The maximal AH activity(0.052±0.009)nmol/(min·mg)was observed in liver microsome,but not be detected in muscle microsome,indicating that the above-mentioned cytochrome P450 isoenzymes were available in main tissue microsoms in the crucian carp,and the APD,ERND and AH activities were different in different tissues,the maximal activities being observed in liver microsome.

Carassius auratus gibelio;microsome;cytochrome P450;tissue distribution

2095-1388(2011)01-0074-05

S948;Q555

A

2010-03-17

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助項目(2007M06)

賈嫻(1983-),女,碩士研究生。E-mail:xianjlz@126.com

房文紅(1968-),男,博士,研究員。E-mail:whfang06@yahoo.com.cn