菟仙海蚣膠囊對(duì)生精細(xì)胞損傷大鼠睪丸生精功能保護(hù)作用研究

張銀川,劉喜平

(1.定西市婦幼保健院,甘肅定西 743000;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730000)

少精、弱精癥是造成男性不育或生育力下降的主要原因,菟仙海蚣膠囊來源于筆者治療少精、弱精男性不育癥的驗(yàn)方,由菟絲子、仙靈脾等 5味藥物組成。臨床應(yīng)用表明,菟仙海蚣膠囊可增加少精、弱精患者精子密度、提高精子活力[1]。本研究觀察了菟仙海蚣膠囊對(duì)腺嘌呤致生精細(xì)胞損傷大鼠睪丸生精功能的保護(hù)作用,以期揭示其作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SD大鼠,SPF級(jí),雄性,3個(gè)月齡,體質(zhì)量280～320 g,由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用證號(hào)SYXK(甘)2004～0006,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(甘)2004～0006。動(dòng)物分籠飼養(yǎng),食固體 SPF級(jí)飼料,自由飲水。飼料由北京市科奧協(xié)力飼料有限公司提供,合格證號(hào)為京動(dòng)許字(2000)第 015號(hào)。室溫 20～25℃,相對(duì)濕度45%～52%。

1.2 藥品、試劑與儀器

菟仙海蚣膠囊由菟絲子、仙靈脾等 5味藥物按一定比例組成,由蘭州中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)中心及甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心監(jiān)制,規(guī)格為0.35 g/粒(3.21 g生藥/g膠囊),實(shí)驗(yàn)室時(shí)用生理鹽水配置成相應(yīng)濃度的溶液。五子衍宗丸,北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠產(chǎn)品,批號(hào) 2009324。羧甲基纖維素鈉,河北省文安縣盛源纖維素廠產(chǎn)品,批號(hào)20090227;腺嘌呤,洛陽德勝化工有限公司產(chǎn)品,批號(hào)20080911;一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS),均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品,批號(hào)依次為 090612,090510;戊巴比妥鈉,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品,批號(hào) 20030816。Tissue-Tek·VIPTM5Jr全封閉組織脫水機(jī)、Tissue-Tek·TECTM5組織包埋機(jī)及IVS-40推拉式切片機(jī),均為日本櫻花電器株式會(huì)社產(chǎn)品;BH-2顯微鏡,日本OLYMPUS產(chǎn)品;R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,瑞士BUCHI產(chǎn)品;BL150電子天平,北京Sartorius產(chǎn)品; KDC-2044低速冷凍離心機(jī),科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組與給藥

方法[2],將 72只 SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 3～4 d后,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、五子衍宗丸組及菟仙海蚣膠囊大、中、小劑量組 6組,每組 12只,分籠飼養(yǎng),每籠 6只?？瞻讓?duì)照組每天灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉10μL/g;模型對(duì)照組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉5μL/g,40min后灌胃5%的腺嘌呤混懸溶液(250μg/g)5μL/g;五子衍宗丸組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉5μL/g,40 min后灌胃24%的五子衍宗丸溶液5μL/g;菟仙海蚣膠囊大劑量組每天灌胃中藥浸膏5.4 g生藥/kg, 40min后灌胃5%的腺嘌呤混懸溶液(250μg/g) 5μL/g;菟仙海蚣膠囊中劑量組每天灌胃中藥浸膏2.7 g生藥/kg,40 min后灌胃5%的腺嘌呤混懸溶液(250μg/g)5μL/g。菟仙海蚣膠囊小劑量組每天灌胃中藥浸膏1.35 g生藥/kg,40min后灌胃5%的腺嘌呤混懸溶液(250μg/g)5μL/g。每天1次,實(shí)驗(yàn)總持續(xù)時(shí)間為40 d。實(shí)驗(yàn)期間每 7 d稱體質(zhì)量1次,調(diào)整給藥量,每天每 100 g體質(zhì)量大鼠的給藥總量為1mL。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 睪丸組織形態(tài)學(xué)的變化及其損傷評(píng)分

將睪丸以10%甲醛液固定,石蠟包埋,切片,制片,脫臘,HE染色,封片。于光鏡下觀察曲精細(xì)管結(jié)構(gòu)、計(jì)數(shù)生精上皮數(shù)、測(cè)量MSTD并顯微攝影,參考文獻(xiàn)方法[3],對(duì)睪丸組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)分。

1.4.2 睪丸組織NO與NOS變化

取一側(cè)睪丸,將睪丸表面的白膜去除;剪取0.3 g放于預(yù)先消毒過的平皿中;加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(0.01 mol/L Tris-HCl)共2 mL,用眼科小剪刀盡量剪碎組織,轉(zhuǎn)移至勻漿器制備勻漿;以另外1m L勻漿介質(zhì)沖洗并轉(zhuǎn)移勻漿后的組織溶液置于一次性試管中,制成約10%(W/V,即0.1 g組織加1m L介質(zhì))的組織溶液;10 000 r/min低溫離心30min;取上清液按照試劑盒說明書用硝酸還原酶法檢測(cè)NO、NOS活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。以 P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 菟仙海蚣膠囊對(duì)生精細(xì)胞損傷大鼠一般情況的影響

空白對(duì)照組大鼠精神、體征正常。模型對(duì)照組除 1只大鼠在造模灌胃過程中因操作不當(dāng)而死亡外,其余大鼠出現(xiàn)明顯的腎陽虛癥狀如精神萎靡、蜷臥、反應(yīng)遲鈍、少動(dòng)、進(jìn)食減少、豎毛、瞇眼、眼瞼周圍浮腫、耳廓蒼白、多尿等,且隨給藥天數(shù)的增加而加重。菟仙海蚣膠囊大、中、小劑量組大鼠體征較模型對(duì)照組為輕。

2.2 菟仙海蚣膠囊對(duì)生精細(xì)胞損傷大鼠睪丸組織病理形態(tài)學(xué)及損傷評(píng)分的影響

空白對(duì)照組睪丸組織曲細(xì)精管各級(jí)生精細(xì)胞發(fā)育正常、排列規(guī)整。模型對(duì)照組睪丸呈萎縮狀態(tài),部分曲細(xì)精管退化變性,管腔內(nèi)生殖上皮變薄,各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量減少。菟仙海蚣膠囊大劑量組異常曲細(xì)精管明顯減少,精子細(xì)胞較多見。五子衍宗組及菟仙海蚣膠囊中、小劑量組在低倍鏡下見典型的“斑點(diǎn)樣”改變;在高倍鏡下見部分曲細(xì)精管萎縮,精原細(xì)胞和支持細(xì)胞明顯減少,部分精子間質(zhì)水腫,間質(zhì)細(xì)胞空泡樣變性。見圖 1。

圖1 各組大鼠睪丸組織病理學(xué)HE染色切片(×200)

睪丸組織損傷評(píng)分結(jié)果見表 1。給予腺嘌呤溶液 40 d后,模型對(duì)照組睪丸與空白對(duì)照組在生精上皮層數(shù)、MSTD、睪丸組織結(jié)構(gòu)評(píng)分上差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);菟仙海蚣膠囊大劑量組在生精上皮層數(shù)、MSTD和組織結(jié)構(gòu)評(píng)分上與模型對(duì)照組對(duì)比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 各組大鼠睪丸組織損傷評(píng)分對(duì)比 ±s

表1 各組大鼠睪丸組織損傷評(píng)分對(duì)比 ±s

注:與空白對(duì)照組對(duì)比,**P＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比,#P＜0.05,##P＜0.01。

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2.3 菟仙海蚣膠囊對(duì)生精細(xì)胞損傷大鼠睪丸組織NO及NOS的影響

見表3。模型對(duì)照組睪丸組織勻漿中NOS活性增強(qiáng),NO含量增加,與空白對(duì)照組對(duì)比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);菟仙海蚣膠囊大、中、小劑量均能對(duì)抗該效應(yīng),與模型對(duì)照組對(duì)比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。表明菟仙海蚣膠囊具有降低睪丸織中異常升高的NOS活性、NO含量的作用。

表2 各組大鼠睪丸組織NO及NOS含量對(duì)比 ±s

表2 各組大鼠睪丸組織NO及NOS含量對(duì)比 ±s

注:與空白對(duì)照組對(duì)比,*P＜0.05,**P＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比,#P＜0.05,##P＜0.01。

組 別劑量/g·kg-1 動(dòng)物數(shù)NO /mmol·g-1 NOS /U·mg-1空白對(duì)照組 — 12 3.18±0.47 3.81±0.54模型對(duì)照組 0.25 11 5.96±0.70** 5.43±1.09**五子衍宗組 1.2 12 3.92±0.90## 4.59±0.89#菟仙海蚣大劑量組 5.4 12 3.87±0.55## 4.22±0.69#菟仙海蚣中劑量組 2.7 12 5.34±0.61# 4.62±0.67#菟仙海蚣小劑量組 1.35 12 5.66±0.68 4.99±0.79#

3 討 論

男性少精、弱精癥是造成男性不育或生育能力低下的重要原因,其病因復(fù)雜,尤其是特發(fā)性的精子減少或特發(fā)性弱精子原因不明。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎藏精”、“主生殖”,腎之陰精是化生精液的物質(zhì)基礎(chǔ),其化生過程又賴腎陽的氣化作用,氣血條暢是腎之陰陽正常升降的前提。故腎虛精瘀是男性少精、弱精癥的重要病機(jī),溫腎益精、活血通精法為其防治的基本治法。菟仙海蚣膠囊由菟絲子、蜈蚣等藥物組成,組方嚴(yán)謹(jǐn),藥少力專,能溫腎益精、活血通精,使精出有源、精行通暢。腺嘌呤可誘導(dǎo)腎陽虛型睪丸功能損害[4],故本研究選用腺嘌呤建立大鼠生精細(xì)胞損傷動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給予腺嘌呤溶液后大鼠出現(xiàn)明顯的腎陽虛癥狀,菟仙海蚣膠囊可改善大鼠腎陽虛癥狀。

睪丸是性腺軸的靶器官,是精子發(fā)生的場(chǎng)所,睪丸曲細(xì)精管及間質(zhì)細(xì)胞等組織的損傷,可導(dǎo)致生殖內(nèi)分泌激素水平降低,并影響精液的數(shù)量與質(zhì)量。本研究表明,經(jīng)菟仙海蚣膠囊干預(yù)后,睪丸組織萎縮狀態(tài)得到一定程度的改善,異常曲細(xì)精管明顯減少,精原細(xì)胞和支持細(xì)胞較模型對(duì)照組明顯增多,精子細(xì)胞較多見。

精子發(fā)生是由分化較低的精原細(xì)胞發(fā)育成為高度分化精子的過程。NOS和NO對(duì)男性生殖功能具有重要調(diào)節(jié)作用,可調(diào)節(jié)睪丸的血液供應(yīng)、激素的合理分泌,參與支持細(xì)胞、精子的正常發(fā)生及獲能,并影響精子的質(zhì)量,從而影響男性的生殖功能。此外,低濃度的NO可促進(jìn)精子活力、保護(hù)精子功能,而高濃度的NO則有抑制作用,可導(dǎo)致生精障礙,引起不育[5]。本研究表明腺嘌呤可誘發(fā)大鼠睪丸組織中NOS活性增強(qiáng)、NO含量增加,菟仙海蚣膠囊具有降低睪丸織中異常升高的NOS活性和NO含量的作用,從而促進(jìn)精子活力、保護(hù)生精功能。

參考文獻(xiàn):

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