四逆散干預(yù)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎的藥效學(xué)研究 *

王麗娜,范 穎,盧 健,林庶茹

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)方劑教研室,遼寧沈陽(yáng) 110032;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,遼寧沈陽(yáng) 110032)

四逆散近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于消化系統(tǒng)疾病如內(nèi)滯不通引起的胸脅苦滿、腹中脹痛或下利等的治療。潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、大便帶血,甚或黏液膿血便、里急后重等,屬于中醫(yī)學(xué)“泄瀉”、“痢疾”、“滯下”等范疇,與四逆散治療病證相符。目前有關(guān)四逆散原方治療UC的實(shí)驗(yàn)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討四逆散對(duì)實(shí)驗(yàn)性UC大鼠的藥效學(xué)影響,以期初步揭示其干預(yù)實(shí)驗(yàn)性UC的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)SD大鼠40只,體質(zhì)量160～180 g,雌雄各半,一次性購(gòu)于上海西普爾 -必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,合格證號(hào)為SCXK(滬)-20080016。

1.2 藥品、試劑與儀器

四逆散組由柴胡免煎顆粒(批號(hào)0909165)、白芍免煎顆粒(批號(hào)0909053)、枳實(shí)免煎顆粒(批號(hào)0909086)、炙甘草免煎顆粒(批號(hào) 0909050)組成,均由江陰天江藥業(yè)有限公司提供;固腸止瀉丸由西安阿房宮藥業(yè)有限公司提供(批號(hào)092440),為中藥對(duì)照藥。多聚甲醛,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品,批號(hào)F20090722;完全弗氏佐劑,美國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品,批號(hào)096K89031;生理鹽水;75%酒精;PBS緩沖液等。BL610型電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品;飛鴿牌TDL-5-4型離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;DY89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品;OLYMPUS顯微鏡,日本TKO光學(xué)儀器株式會(huì)社產(chǎn)品; RM2145型切片機(jī)及 H 11210型烤片機(jī),均為德國(guó)徠卡儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 模型的建立

參照文獻(xiàn)方法[1]加以改良。取新鮮家兔的結(jié)腸黏膜制成黏膜勻漿,冷凍24 h;溶凍后以4 000轉(zhuǎn)/min的速度離心30 min;取上清液提純,根據(jù)Low ry法測(cè)定蛋白含量;含量達(dá)標(biāo)后置于冰箱保存?zhèn)溆?使用時(shí)與等量完全弗氏佐劑配成抗原乳化液。除正常對(duì)照組外,其余每組于造模第 1天注射抗原乳化液,分別注射于大鼠的雙側(cè)足跖、雙側(cè)腹股溝及背部,每只0.5 m L;第10,17 d依同法注射等量抗原乳化液。

1.4 分組與給藥

按體質(zhì)量將 40只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、固腸止瀉丸組、四逆散組4組,每組 10只,雌雄各半。各組均按 10μL/g體質(zhì)量的濃度配備灌胃藥物。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組按1.00mg/(g·d)蒸餾水灌胃,其他兩組造模同時(shí)于第 2天給予藥物處理。各組藥物按臨床成人用量的 6.3倍折算實(shí)驗(yàn)大鼠的用量,分別為中藥對(duì)照組按1.4 mg/(g·d)固腸止瀉丸溶液灌胃,四逆散組按1.75mg/(g·d)四逆散溶液灌胃。

1.5 取材方法

于給藥后 20 d處死大鼠,摘取動(dòng)物脾臟、胸腺稱量質(zhì)量,并計(jì)算其脾臟、胸腺指數(shù)。取距肛門約10 cm處病變最明顯結(jié)腸組織,沿腸系膜縱向剪開(kāi),以生理鹽水沖凈腸管壁,將結(jié)腸剖開(kāi)、展平,使黏膜表面向上,對(duì)其進(jìn)行肉眼觀察,并按結(jié)腸黏膜損傷程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。于病變部位取材,置于 4%多聚甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色,光鏡觀察,并且按照結(jié)腸病理組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)期間觀察各組大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)度、毛色光澤度及疏密度、大便性狀、飲食飲水情況、死亡情況等。記錄大鼠體質(zhì)量變化,每周稱質(zhì)量1次以調(diào)整給藥量。

1.6.2 脾臟、胸腺指數(shù)

根據(jù)以下公式計(jì)算。脾臟指數(shù)(mg/10 g)=脾臟質(zhì)量×100/體質(zhì)量,胸腺指數(shù)(mg/10 g)=胸腺質(zhì)量 ×100/體質(zhì)量。

1.6.3 肉眼下結(jié)腸組織損傷程度

肉眼觀察結(jié)腸黏膜損傷情況,按結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(見(jiàn)表 1)評(píng)定結(jié)腸黏膜損傷積分。

表1 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6.4 光鏡下結(jié)腸組織損傷程度及形態(tài)學(xué)變化

病理切片觀察用常規(guī)的HE染色法。光鏡下觀察結(jié)腸組織損傷情況,參考組織學(xué)損傷評(píng)分[3],包括潰瘍炎癥肉芽腫,纖維化有無(wú)、輕、重(有無(wú)、輕、重分別計(jì)為0,1,2分)及病變損害深度(至黏膜下層 1分,至肌層 2分,至漿膜層3分),各項(xiàng)相加即為總分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 四逆散對(duì)UC大鼠一般情況的影響

造模前,各組大鼠精神狀態(tài)良好,毛發(fā)緊密且有光澤,反應(yīng)靈敏,較活躍,飲食飲水正常,大便正常。模型對(duì)照組大鼠出現(xiàn)形體消瘦,精神萎靡,有拱背、扎堆現(xiàn)象,毛發(fā)較疏松無(wú)光澤,肛周被污染,有不同程度的腹瀉,部分大鼠可見(jiàn)肉眼少量血便。四逆散組及固腸止瀉丸組大鼠的上述癥狀和體征有明顯改善。

2.2 四逆散對(duì)UC大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組對(duì)比,模型對(duì)照組、固腸止瀉丸組、四逆散組大鼠脾臟指數(shù)升高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);模型對(duì)照組大鼠胸腺指數(shù)降低,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比,固腸止瀉丸組、四逆散組大鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)均升高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。四逆散組與固腸止瀉丸組兩指標(biāo)對(duì)比,差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)對(duì)比mg·10-1·g-1,±s

表2 各組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)對(duì)比mg·10-1·g-1,±s

注:與正常對(duì)照組對(duì)比,*P＜0.05,**P＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比, #P＜0.05;##P＜0.01。

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2.3 四逆散對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織損傷程度的影響

與正常對(duì)照組對(duì)比,模型對(duì)照組、固腸止瀉丸組、四逆散組大鼠結(jié)腸組織損傷程度評(píng)分及病理組織學(xué)評(píng)分增高,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比,固腸止瀉丸組、四逆散組大鼠結(jié)腸組織損傷程度評(píng)分以及結(jié)腸病理組織學(xué)評(píng)分降低,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。四逆散組與固腸止瀉丸組兩指標(biāo)對(duì)比,差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表 3。

表3 各組大鼠結(jié)腸損傷程度對(duì)比 ±s

表3 各組大鼠結(jié)腸損傷程度對(duì)比 ±s

注:與正常對(duì)照組對(duì)比,**P＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比,##P＜0.01。

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2.4 四逆散對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)的影響

正常對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞完整、連續(xù),固有層腺體排列規(guī)整,無(wú)水腫、增生、充血,無(wú)潰瘍、糜爛點(diǎn)及細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組黏膜表面可見(jiàn)潰瘍形成,重者可達(dá)肌層,炎癥反應(yīng)較重,有充血糜爛,細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜上皮部分缺失,局部固有層腺體減少,黏膜肌層不明顯。固腸止瀉丸組黏膜小凹變淺,固有層腺體減少。四逆散組黏膜層、黏膜肌層清晰,黏膜小凹正常。見(jiàn)圖 1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)HE染色切片(×100)

3 討 論

有學(xué)者認(rèn)為,脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的改變能夠反映機(jī)體免疫功能的狀態(tài)[4-5]。有關(guān) UC動(dòng)物模型脾臟指數(shù)改變的報(bào)道不一,多數(shù)研究結(jié)果表明UC大鼠脾臟指數(shù)明顯降低[6],亦有研究證明 UC大鼠脾臟指數(shù)增加[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型對(duì)照組大鼠脾臟指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組,此可能是由于機(jī)體免疫功能紊亂,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),發(fā)生感染而致。經(jīng)四逆散治療后,UC大鼠脾臟、胸腺指數(shù)均顯著升高,提示四逆散可能具有促進(jìn)UC大鼠脾臟和胸腺免疫功能恢復(fù)的作用,亦驗(yàn)證了四逆散可正向調(diào)節(jié)免疫抑制狀態(tài)機(jī)體的免疫功能,對(duì)機(jī)體免疫功能有促進(jìn)和調(diào)節(jié)的作用[8]。

從結(jié)腸標(biāo)本兩大評(píng)分比較得出,模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸損傷程度明顯重于正常對(duì)照組,四逆散組大鼠的結(jié)腸損傷程度明顯輕于模型對(duì)照組,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察UC大鼠結(jié)腸黏膜病理形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn),采用四逆散干預(yù)治療后,病變組織黏膜層、黏膜肌層清晰,黏膜小凹正常,未見(jiàn)炎性滲出,說(shuō)明結(jié)腸黏膜病變組織已得到有效的修復(fù)。由此可初步得出,四逆散能有效改善 UC大鼠的一般狀況和病理?yè)p害,具有減輕 UC大鼠結(jié)腸炎性以及潰瘍病變的效用。此亦驗(yàn)證了四逆散的抗?jié)冏饔肹9-10]。

本實(shí)驗(yàn)證明,四逆散能夠有效治療實(shí)驗(yàn)性大鼠UC,其作用機(jī)理可能與提高UC大鼠的免疫功能、減輕UC大鼠病理?yè)p傷程度有關(guān)。衛(wèi)生出版社,1991:1161.

[2]余穎聰,鄭亮,姚云斌.潰瘍性結(jié)腸炎大鼠氧自由基動(dòng)態(tài)變化及腸黏膜超微結(jié)構(gòu)觀察[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué),2009, 21(7):685-687.

[3]王炳芳,王迎昕,王曉蕾,等.己酮可可堿對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎治療作用及其機(jī)制[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007,28(13):1196-1198.

[4]鐘毅.益壽調(diào)脂片對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2000,10(8):468.

[5]寇俊萍.當(dāng)歸芍藥散對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2003,20(3):170.

[6]陳治水,聶志偉,孫旗立,等.健脾益氣方健脾靈治療慢性潰瘍性結(jié)腸炎的療效藥理[J].世界華人消化雜志, 1999,7(11):960-963.

[7]劉保林,戴媛媛,唐寧等.吳茱萸氯仿提取物對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的藥效學(xué)研究[J].中藥藥理與臨床,2003,19 (6):16-19.

[8]宋寶輝,李英蘭,李霞,等.四逆散對(duì)機(jī)體免疫功能的影響[J].中醫(yī)藥信息,2000,17(4):67.

[9]李驥,畢珺輝,孫宇峰.四逆散抗實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的藥效學(xué)及作用機(jī)理研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2007,25(7): 1317-1319.

[10]張慧.痛瀉藥方合四逆散加味治療肝郁脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎58例[J].中醫(yī)雜志,2008,49(5):438-439.